路璐，李德冠，張俊伶，王月英，孟愛民

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不同劑量137Csγ-射線輻射后造血干/祖細胞輻射敏感性差異研究

路璐1，李德冠1，張俊伶1，王月英1，孟愛民2

摘要：目的探討不同劑量137Csγ-射線輻射后不同時間點C57BL/6小鼠造血細胞輻射敏感性的差異。方法采用隨機區(qū)組法將72只雄性C57BL/6小鼠分為對照組和2、4、6 Gy照射組。照射組給予2、4、6 Gy137Csγ-射線一次性全身照射，對照組給予假照射。分別于受照后14 d、35 d和56 d斷頸處死小鼠，取外周血進行血象測定，取骨髓細胞測定有核細胞（BMNCs）、造血干細胞（HSCs）和造血祖細胞（HPCs）數(shù)目。結果與對照組相比，照射組小鼠造血系統(tǒng)受到不同程度損傷。外周血白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞數(shù)（RBC）、血小板（PLT）和血紅蛋白含量（HGB）均有不同程度的降低，其中HGB對輻射較不敏感，RBC在受照后35 d已基本恢復至正常值，WBC和PLT對輻射較敏感；6 Gy照射對WBC和PLT影響較重，恢復緩慢。照射后14 d，照射組BMNCs、HSCs和HPCs數(shù)目均低于對照組；照射后35 d和56 d，6 Gy照射組BMNCs和HPCs數(shù)目均低于對照組（均P＜0.05），2、4 Gy照射組BMNCs和HPCs數(shù)目與對照組差異無統(tǒng)計學意義。照射后35 d，照射組HSCs數(shù)目均低于對照組；照射后56 d，4、6 Gy照射組HSCs數(shù)目均低于對照組（均P＜0.05），2 Gy照射組HSCs數(shù)目與對照組差異無統(tǒng)計學意義。結論不同劑量137Csγ-射線輻射對小鼠造血系統(tǒng)造成不同程度的損傷，且輻射對HSCs的損傷是持久性的。

關鍵詞：γ射線；外周血；造血干細胞；造血祖細胞；137Cs

作者單位：1中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室（郵編300192）；2中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所

電離輻射可以直接或通過續(xù)發(fā)反應導致機體廣泛損傷，包括急性損傷、遲發(fā)性損傷和慢性損傷，其中造血系統(tǒng)損傷是輻射損傷的主要表現(xiàn)之一[1-3]。造血系統(tǒng)對輻射極其敏感，各種造血前體細胞、造血祖細胞（hematopoietic progenitor cells, HPCs）在形成成熟血細胞的過程中不斷地分化、增殖，對輻射高度敏感[4-5]。以往對于造血系統(tǒng)輻射損傷的研究絕大部分著重于大劑量照射后的損傷效應[2]，然而有關低、中、高劑量全身照射后造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）和HPCs的損傷和修復規(guī)律的報道較少。本研究對不同劑量137Csγ-射線全身照射后不同時間點小鼠的造血功能進行系統(tǒng)研究，并探討HSCs 和HPCs放射敏感性的差異。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器137Csγ-射線照射源、Autocell40購自加拿大原子能有限公司（劑量率為1.01 Gy/min）；美國BD FAC?SAriaⅢ流式細胞儀；日本光電MEK-T222K全自動血液分析儀。streptavidin APC-Cy7、anti-c-kit-APC、biotin-conjugated anti-mouse CD5、anti-CD45R/B220、anti-Gr-1、anti-Mac-1α 及anti-Ter-119抗體均購自美國ebioscience公司；anti-Sca-1-PE-Cy7抗體購自美國Biolegend公司。

1.2實驗動物SPF級C57BL/6小鼠72只，雄性，6～8周齡，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(京) 2009-0017，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所動物實驗中心。

1.3方法

1.3.1動物分組按照隨機區(qū)組法將C57BL/6小鼠分為對照組和2、4、6 Gy照射組，每組18只。2、4、6 Gy照射組進行一次性全身137Csγ-射線照射，吸收劑量分別為2、4和6 Gy，源靶距15 cm，吸收劑量率1.01 Gy/min；對照組接受假照射（即不照射）。實驗過程中，所有動物在同等條件下飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。

1.3.2臟器指數(shù)測定分別于照射后14、35和56 d稱取小鼠體質量，斷頸處死小鼠各6只，電子天平稱取小鼠脾臟和胸腺的質量，計算脾臟和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質量（mg）/體質量（g）。胸腺指數(shù)=胸腺質量（mg）/體質量（g）[6]。

1.3.3外周血常規(guī)檢測小鼠眼球取血，并將血裝入含k3EDTA抗凝劑的EP管中，用血細胞計數(shù)儀測定白細胞（white blood cell, WBC）計數(shù)、紅細胞（red blood cell, RBC）計數(shù)、血小板（platelet, PLT）和血紅蛋白含量（hemoglobin, HGB）等指標[6]。1.3.4骨髓有核細胞（bone marrow nuclear cells, BMNCs）、HSCs和HPCs數(shù)目的檢測無菌分離小鼠單側股骨，用PBS（含2%胎牛血清）將骨髓細胞沖出并進行細胞計數(shù)。取5× 106個小鼠骨髓細胞，加入生物素偶聯(lián)的CD5、CD45R/B220、Gr-1、Mac-1α和Ter-119抗體，冰上孵育30 min后加入1 mL含2%FBS的PBS，400 r/min離心5 min后棄上清；加入streptavidin APC-Cy7、anti-c-kit-APC和anti-Sca-1-PE-Cy7抗體染色，用含2%FBS的PBS調整染色體積50～80 μL，冰上孵育90 min后加入1 mL含2%FBS的PBS，400 r/min離心5 min，棄上清；加入500 μL PBS重新懸浮細胞，過濾至流式管中進行流式細胞儀分析[7]。Flow Jo7.6軟件分析數(shù)據(jù)，結果以每只小鼠單側股骨BMNCs數(shù)目、HSCs數(shù)目和HPCs數(shù)目表示。

1.4統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey′s檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1小鼠體質量和臟器指數(shù)的變化情況（1）體質量。照射組小鼠體質量較對照組均有不同程度下降，4 Gy和6 Gy照射組在照射后14 d的體質量明顯低于對照組，6 Gy照射組在照射后35 d和56 d的體質量明顯低于對照組（均P＜0.05）。（2）臟器指數(shù)。除6 Gy照射組在照射后35 d的脾臟指數(shù)低于對照組（P＜0.05）外，各照射組在照射后不同時點的脾臟指數(shù)與對照組差異均無統(tǒng)計學意義。（3）胸腺指數(shù)。6 Gy照射組在照射后不同時點的胸腺指數(shù)均低于對照組（均P＜0.05），2 Gy和4 Gy照射組胸腺指數(shù)與對照組差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。

Tab. 1 Changes of body weight and organ index after different doses of137Csγ-irradiation表1不同劑量137Csγ-射線照射后小鼠體質量和臟器指數(shù)的變化情況　(n=6, x ±s)

2.2小鼠外周血血常規(guī)指標的變化情況不同劑量射線照射后，小鼠造血系統(tǒng)受到不同程度損傷。（1）WBC。照射后14 d，各照射組小鼠外周血WBC均低于對照組（均P＜0.05）；照射后35 d，4 Gy和6 Gy照射組低于對照組（均P＜0.05），2 Gy照射組與對照組差異無統(tǒng)計學意義；照射后56 d，2 Gy和4 Gy照射組小鼠外周血WBC開始恢復（均P＞0.05），6 Gy照射組仍低于照射組（均P＜0.05）。（2）RBC。照射后14 d，各照射組小鼠外周血RBC均低于對照組（均P＜0.05）；照射后35 d和56 d，各照射組與對照組差異均無統(tǒng)計學意義。（3）HGB。除2 Gy照射組在照射后14 d的HGB低于對照組（P＜0.05）外，各照射組在照射后不同時點與對照組差異均無統(tǒng)計學意義。（4）PLT。照射后14 d，各照射組小鼠PLT與對照組比較均有不同程度降低（均P＜0.05）；照射后35 d和56 d，僅6 Gy照射組低于對照組（均P＜0.05），2 Gy和4 Gy照射組與對照組差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。組分別下降26.15%、93.86%和97.06%，HPCs較對照組分別下降31.68%、45.05%和79.46%；照射后35 d，6 Gy照射組BMNCs和HPCs數(shù)目均低于對照組（均P＜0.05），2、4和6 Gy照射組HSCs數(shù)目均低于對照組（均P＜0.05）；照射后56 d，6 Gy照射組BMNCs和HPCs數(shù)目低于對照組，4 Gy和6 Gy照射組HSCs數(shù)目均低于對照組（均P＜0.05），見表3、圖1。

Tab. 3 Changes of number of BMNCs, HSCs and HPCs after different doses of137Cs γ-irradiation表3不同劑量射線后小鼠BMMNCs、HSCs和HPCs數(shù)目的變化情況　(n=6, x ±s)

Tab. 2 Changes of routine blood test after different doses of137Cs γ-irradiation表2不同劑量137Csγ-射線照射后小鼠外周血血常規(guī)指標的變化情況　(n=6, x ±s)

Fig.1 Phenotype analysis of mouse bone marrow cells圖1小鼠骨髓細胞表型分析

2.3小鼠BMNCs、HSCs和HPCs數(shù)目的變化情況照射后，與對照組比較，照射組小鼠BMNCs、HSCs和HPCs數(shù)目均有不同程度下降。照射后14 d，2 Gy、4 Gy和6 Gy照射組BMNCs、HSCs和HPCs數(shù)目均低于對照組（均P＜0.05），BMNCs較對照組分別下降25.09%、39.93%和54.42%，HSCs較對照

3　討論

機體受到輻射后，骨髓細胞的增殖和分裂功能受到損傷，導致血細胞來源減少，從而引起外周血象不同程度的變化[1]。HSCs是一類具有自我更新與分化能力的細胞，電離輻射可以引起HSCs損傷，導致其數(shù)目減少，體內體外自我更新及重建能力降低，進而引起骨髓的持久性損傷[2,7-8]。本研究通過測定小鼠外周血中WBC、RBC、PLT、HGB、BMNCs、HSCs和HPCs數(shù)目以研究不同劑量射線照射對小鼠造血系統(tǒng)的影響。

機體更新比較活躍的造血血液細胞具有較高的輻射敏感性。本研究結果顯示，137Csγ-射線照射后，與對照組相比，小鼠造血系統(tǒng)受到不同程度損傷。外周血WBC和PLT、HGB、RBC均有不同程度的降低，其中HGB對輻射較不敏感，RBC在受照后35 d已基本恢復至正常值，可能是由于紅細胞生存壽命為120 d，比其他血細胞存活時間長，并且紅細胞造血功能恢復較早；WBC和PLT對輻射較敏感，6 Gy照射對小鼠外周血WBC和PLT造成較重的影響，恢復緩慢。

骨髓是對輻射高度敏感的組織，輻射引起骨髓損傷進而導致骨髓造血細胞的變化[9]。BMNCs水平可在一定程度上反映骨髓造血能力[6]。本研究結果表明，C57BL/6小鼠照射后35 d，2 Gy和4 Gy照射組小鼠BMNCs數(shù)已經基本恢復，而6 Gy照射組小鼠BMNCs數(shù)在照射后56 d仍未完全得到恢復。

HSCs具有較強的增殖能力和向特定組織即造血組織各系細胞分化的功能。研究證明成體HSCs不表達系特異性抗原Lin，即B細胞分化抗原B220、粒細胞分化抗原Gr-1、單核細胞分化抗原Mac-1、T細胞分化抗原CD4和CD8，但高水平表達干細胞抗原1（stem-cell antigen 1, Sca1)和c-Kit，簡稱LSK (Lin-Sca1+c-Kit+)[9]。HSCs在分化為形態(tài)上可辨認的幼稚血細胞之前，還經歷了一個中間發(fā)育階段。在這一階段中的細胞已經喪志HSCs所特有的自我復制和多向分化的能力，它們只能沿著有限的幾個方向或甚至一個方向分化。這一階段細胞在調控因子的影響下，可進行有限的細胞增殖活動，并在增殖過程中進一步發(fā)育成熟。這一階段的細胞稱為HPCs，其細胞表面標記為Lin-Sca1-c-Kit+。本實驗采用流式細胞儀分析HSCs和HPCs比例，結合Flow Jo7.6軟件，即可獲知不同劑量輻射對造血干/祖細胞的損傷效應。本研究結果表明，C57BL/6小鼠照射后35 d，2 Gy和4 Gy照射組小鼠HPCs數(shù)目已經基本恢復，6 Gy照射組小鼠HPCs數(shù)目在照射后56 d仍未完全得到恢復。而HSCs在受到輻射損傷后56 d，4 Gy和6 Gy照射組小鼠HPCs數(shù)目均未得到恢復，提示電離輻射對小鼠骨髓HSCs造成的損傷是持續(xù)性的。Wang等[2]研究顯示，給予6.5 Gy全身照射，小鼠HSCs的損傷程度高于HPCs，且HSCs的損傷是不可逆的。Chang等[10]研究表明，1 Gy質子輻射可以引起小鼠HSCs的永久性損傷。本研究結果同以往研究結果基本一致。

本研究從低中高3個不同劑量研究造血系統(tǒng)不同細胞輻射敏感性的差異，結果提示小鼠外周血WBC、PLT、BMNCs和HPCs的輻射損傷在2 Gy和4 Gy劑量照射后是可以恢復的，6 Gy劑量輻射引起的損傷較嚴重，可能需要更長的時間才能得到恢復。2 Gy、4 Gy和6 Gy電離輻射對HSCs的損傷是持久性的，在2個月內均不能得到恢復。

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（2015-08-20收稿2015-09-25修回）

（本文編輯陳麗潔）

The difference in the radiosensitivity between hematopoietic stem and progenitor cells after different doses of137Csγ-radiation

LU Lu1, LI Deguan1, ZHANG Junling1, WANG Yueying1, MENG Aimin2
1 Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Tianjin 300192, China；2 Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College Corresponding Author E-mail: aiminmeng@irm-cams.ac.cn

Abstract:Objective To observe the different radiosensitivity induced by different doses of137Csγ-ray irradiation between hematopoietic stem and progenitor cells. Methods Seventy-two C57BL/6 mice were randomly divided into control group and irradiated groups (2, 4 and 6 Csγ-ray irradiation, n=18 for each group). Mice of control group received sham irradiation, and the rest accepted 2, 4 and 6 Gy137Csγ total body irradiation, respectively. After 14-day, 35-day and 56-day irradiation, the peripheral blood samples were collected by balls enucleation. The number of bone marrow nuclear cells, hematopoietic stem and progenitor cells were counted. Results The peripheral blood of irradiated mice showed significant changes in the number of white blood cells (WBC), red blood cells (RBC), platelets (PLT) and hemoglobin (HGB) in a dose-response relationship. Compared with the control group, the numbers of BMNCs and hematopoietic progenitor cells (HPCs) were significantly lower in irradiated group. At 35 d and 56 d after 6 Gy irradiation the numbers of BMNCs and HPCs were significantly lower than those of control group (P＜0.05). There were no significant differences in numbers of BMNCs and HPCs between irradiated groups (2 and 4 Gy)and control group. The number of bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs)was significantly lower in irradiated group than that in control group after 14-d and 56-d irradiation (P＜0.05). Conclusion137Csγ-ray irradiation has some damage in mouse hematopoietic system. The damage caused by radiation is persistent to hematopoietic stem cells.

Key words:γ-ray；peripheral blood；hematopoietic stem cell；hematopoietic progenitor cell；137Cs

中圖分類號：R331.2

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150115

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973）資助項目(2011CB964800-G)；國家自然科學基金面上項目（81372928）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃青年項目（15JCQNJC46000）；“協(xié)和青年基金資助”和“中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助”（3332013044）；中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所發(fā)展基金（1521）

作者簡介：路璐（1982），女，助理研究員，碩士，主要從事輻射損傷防護藥物研究

通訊作者E-mail: aiminmeng@irm-cams.ac.cn