陳紅兵　劉一民　趙磊（山東省濰坊市益都中心醫(yī)院，山東　濰坊　262500）

?

胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌流損傷的保護(hù)作用及對(duì)AQP4、MMP-9表達(dá)的影響*

陳紅兵△劉一民趙磊
（山東省濰坊市益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500）

【摘要】目的觀察胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌流損傷的保護(hù)作用及對(duì)AQP4、MMP-9表達(dá)的影響。方法選取120只成年健康雄性大鼠，隨機(jī)選擇30只作為假手術(shù)組，其余90只制備腦缺血再灌注模型，成功78只，平均分為模型組和胡黃連苷Ⅱ組。胡黃連苷Ⅱ組給予胡黃連苷Ⅱ腹腔注射，模型組、假手術(shù)組給予等量的生理鹽水腹腔注射，假手術(shù)組不制備腦缺血模型，其他步驟均同模型組。檢測(cè)3組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分、DCI、ACI、CIV，以及水通道蛋白4（AQP4）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和環(huán)氧合酶2（COX2）表達(dá)水平。結(jié)果

胡黃連苷Ⅱ組神經(jīng)功能缺失評(píng)分、DCI、ACI、CIV水平較假手術(shù)組顯著降低，模型組各水平也較假手術(shù)組明顯降低，且胡黃連苷Ⅱ組較模型組也明顯降低；胡黃連苷Ⅱ組的AQP4、MMP-9和COX2表達(dá)水平分別為（1.12±0.14）、（0.95±0.08）、（0.58±0.05）ng/mL，較模型組明顯降低，較假手術(shù)組顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論胡黃連苷Ⅱ可以顯著抑制AQP4、MMP-9表達(dá)，對(duì)腦缺血再灌流損傷具有一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】胡黃連苷Ⅱ腦缺血再灌流水通道蛋白4基質(zhì)金屬蛋白酶9

中腦缺血性損傷可以引發(fā)缺血半暗帶區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。研究證實(shí)［1-2］，腦缺血損傷和腦組織處在低氧環(huán)境中，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡，而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）通路在腦缺血造成損傷的過程中，具有促炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。ERK1/2通路抑制劑以及鈣通道阻滯劑氯胺酮能夠抑制腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭蠩RK1/2通路被激活，并下調(diào)miRNA-21和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)。水通道蛋白4 （AQP4）參與介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)腦缺血持續(xù)3 h，梗死周圍皮質(zhì)區(qū)的AQP4水平明顯升高，而胡黃連苷Ⅱ可以下調(diào)其表達(dá)水平［3］，同時(shí)還可以抑制MMP-9的表達(dá)，緩解炎癥性損傷，減輕腦缺血再灌流損傷。本研究旨在進(jìn)一步探討胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌流損傷的保護(hù)作用及對(duì)AQP4、MMP-9表達(dá)的影響，采用對(duì)照方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取120只成年健康雄性大鼠，體質(zhì)量230～250 g，平均（246.8±2.5）g，均由藥物檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2分組與造模隨機(jī)選擇30只作為假手術(shù)組，其余90只大鼠禁食12 h后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為0.3 mL/kg，仰臥固定，分離結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立腦缺血模型。術(shù)中以及術(shù)后保持肛溫36～37℃，術(shù)后2 h，若大鼠仍蘇醒或者死亡，則剔除。剔除12只，剩余78只隨機(jī)分為模型組和胡黃連苷Ⅱ組，各39只。假手術(shù)組不進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，其余操作均同上。

1.3給藥方法胡黃連苷Ⅱ組在腦缺血2 h后，將胡黃連苷Ⅱ（購自天津奎青有限公司，分子量為512，純度＞98%，使用生理鹽水稀釋至濃度為10 g/L）腹腔注射，劑量為20 mg/kg。假手術(shù)組和模型組腹腔注射生理鹽水，劑量為20 mg/kg。注意:此操作需要同一研究小組在同一時(shí)間協(xié)調(diào)完成。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)1）DCI測(cè)定。治療后24 h，每組選取5只大鼠，經(jīng)心臟灌注200 mL 4%多聚甲醛溶液后取腦，切取缺血部位的腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定2 h，蒸餾水浸泡4 h，常規(guī)脫水、透明以及包埋，連續(xù)冠狀切片，厚度5 μm，然后將其貼在防脫載玻片上，4℃保存。對(duì)于石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，并用蘇木精染色5 min，濃度為1%的鹽酸酒精分色20 s，濃度為1%的氨水返藍(lán)30 s，然后伊紅染色5 min，并使用乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片。在400倍顯微鏡下，隨機(jī)選取4個(gè)皮質(zhì)區(qū)不重疊的視野進(jìn)行觀察，DCI=變性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，用以表示皮質(zhì)區(qū)損傷程度。2）ACI測(cè)定。對(duì)石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，并嚴(yán)格按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（購自凱基生物公司）使用說明書進(jìn)行操作。然后在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)棕色顆粒的為凋亡細(xì)胞，在400倍顯微鏡下，隨機(jī)選取4個(gè)皮質(zhì)區(qū)不重疊的視野進(jìn)行觀察，ACI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，用以表示細(xì)胞凋亡的程度。3）CIV測(cè)定。于治療24 h后，從每組隨機(jī)選取5只大鼠，并經(jīng)心臟灌注200 mL生理鹽水取腦，做連續(xù)冠狀切片，厚度為2 mm，置于20 g/L的氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液中浸泡10 min，并于37℃避光保存。正常腦組織呈現(xiàn)均勻紅色，而梗死組織呈現(xiàn)白色。應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件Photoshop CS測(cè)得經(jīng)過視交叉平面的腦梗死面積和該層同側(cè)半球面積，而CIV=腦梗死面積/同側(cè)半球面積，用以表明腦梗死體積。4）AQP4、MMP-9、環(huán)氧合酶2（COX2）水平檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法，取包被有抗三者特異性抗體的酶標(biāo)板，然后按照標(biāo)本的次序分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL于空白微孔中，并加入樣品50 μL，空白孔加入蒸餾水50 μL，其余各孔加入酶標(biāo)記物溶液100 μL，封口膠密封，并于37℃溫育1 h，使用洗滌液充分洗滌3次，然后用吸水紙拍干；除假手術(shù)組外，其余每孔加入顯色劑A、B液均50 μL，于37℃暗處溫育15 min；分別加入終止液50 μL，于30 min內(nèi)采用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定OD值，然后依據(jù)OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到其對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度（ng/mL）。

1.5神經(jīng)功能缺失評(píng)分分別于治療前和治療后24 h采用mNSS方法進(jìn)行判定［4］，總分為0～18分，分值越高表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以表示，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，用檢驗(yàn)，用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分見表1。假手術(shù)組大鼠活動(dòng)正常，模型組和胡黃連苷Ⅱ組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)行為功能障礙和缺失。再灌注治療前后自身比較，治療后胡黃連苷Ⅱ組神經(jīng)功能缺失評(píng)分較治療前明顯降低（P＜0.05），而模型組神經(jīng)功能缺失評(píng)分較治療前明顯升高（P＜0.05），治療后，胡黃連苷Ⅱ組神經(jīng)功能缺失評(píng)分較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組大鼠再灌注治療前后神經(jīng)功能缺失評(píng)分比較

表1　各組大鼠再灌注治療前后神經(jīng)功能缺失評(píng)分比較

與本組治療前比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組治療后比較，#P＜0.05；與模型組治療后比較，△P＜0.05。

組別　n　治療前　治療后假手術(shù)組　30　0.32±0.02　0.35±0.03模型組　39　10.01±1.32　10.76±1.45*胡黃連苷Ⅱ組　39　9.98±1.28　7.92±1.36*#△

2.2各組大鼠DCI、ACI、CIV水平比較見表2。模型組DCI、ACI和CIV水平較假手術(shù)組均明顯升高，而胡黃連苷Ⅱ組3者水平較假手術(shù)組均明顯升高，較模型組均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3各組大鼠AQP4、MMP-9和COX2表達(dá)水平比較見表3。模型組AQP4、MMP-9和COX2表達(dá)水平較假手術(shù)組均明顯升高，而胡黃連苷Ⅱ組3者水平較假手術(shù)組均明顯升高，較模型組均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2　各組大鼠DCI、ACI、CIV水平比較

表2　各組大鼠DCI、ACI、CIV水平比較

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n　DCI假手術(shù)組　30　0.02±0.01模型組　39　0.72±0.06*胡黃連苷Ⅱ組　39　0.38±0.04*△ACI　CIV 0.09±0.02　4.32±0.12 0.68±0.05*　78.96±5.34*0.32±0.03*△62.38±4.95*△

表3　各組大鼠AQP4、MMP-9和COX2表達(dá)水平比較

表3　各組大鼠AQP4、MMP-9和COX2表達(dá)水平比較

組別　n　AQP4假手術(shù)組　30　0.59±0.06模型組　39　1.68±0.13*胡黃連苷Ⅱ組　39　1.12±0.14*△MMP-9　COX2 0.43±0.03　0.24±0.02 1.32±0.09*　0.96±0.06*0.95±0.08*△　0.58±0.05*△

3　討論

腦缺血性損傷包括缺血期原發(fā)性損傷以及再灌流期繼發(fā)性損傷，后者成為腦缺血再灌流損傷，可以在多種腦血管疾病中并發(fā)，是多環(huán)節(jié)、多途徑、多因素?fù)p傷酶聯(lián)促級(jí)反應(yīng)［5］。腦缺血發(fā)生后，導(dǎo)致各種炎癥因子表達(dá)水平升高，引發(fā)血腦屏障完整性損害，通透性增加，加重腦水腫的嚴(yán)重程度。水通道蛋白是一種與跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)相關(guān)的，具有四聚體結(jié)構(gòu)的膜通道蛋白［6-7］，其中APQ4分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是主要的水特異性通道蛋白，調(diào)節(jié)水通道活性。該物質(zhì)主要分布于脊髓組織和腦組織中的室管膜細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上。研究表明［8］，APQ4對(duì)急性腦缺血大鼠具有指示作用。在正常的腦組織中，MMP-9表達(dá)水平較低，發(fā)生腦缺血時(shí)，各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)被釋放，活化的MMP-9對(duì)基底膜造成損壞，導(dǎo)致血腦屏障受損［9］，最終形成繼發(fā)性缺血后腦水腫。因此，可以將MMP-9表達(dá)水平作為評(píng)估腦缺血損傷嚴(yán)重程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。COX是核因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶目標(biāo)之一，在正常的情況下，僅在神經(jīng)元等少數(shù)細(xì)胞中低水平表達(dá)，當(dāng)腦缺血造成損傷后，其表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，是神經(jīng)損傷治療的公認(rèn)重要靶點(diǎn)［10］。本研究中，模型組大鼠的AQP4、MMP-9和COX2的水平較假手術(shù)組明顯升高，胡黃連苷Ⅱ組的AQP4、MMP-9和COX2水平也較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明腦缺血再灌流對(duì)機(jī)體造成明顯的損傷，與理論基礎(chǔ)相符合。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，由腦缺血再灌流損傷引發(fā)的腦病屬于“中風(fēng)”的范疇［11］。中醫(yī)理論認(rèn)為該病的病機(jī)主要為氣虛不能攝血，氣滯血瘀等。中醫(yī)藥對(duì)APQ4表達(dá)調(diào)節(jié)作用顯著，能夠多層次、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)［12］，因此采用中藥減輕腦缺血再灌流損傷及其作用機(jī)制已逐漸成為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)［13-14］，胡黃連具有清熱、燥濕、涼血的作用，且其主要成分為胡黃連苷Ⅱ，能夠抗氧化、清除自由基，并通過抑制APQ4和MMP-9蛋白表達(dá)水平，對(duì)TLR4-NFKB信號(hào)起阻斷作用，進(jìn)而緩解腦水腫嚴(yán)重程度，改善大腦神經(jīng)功能。本研究中，是胡黃連苷Ⅱ組DCI、ACI、CIV、AQP4、MMP-9和COX2水平較模型組明顯降低，表明胡黃連苷Ⅱ可以保護(hù)大鼠腦缺血再灌流損傷，并抑制AQP4、MMP-9和COX2蛋白的表達(dá)。

綜上所述，胡黃連苷Ⅱ?qū)δX缺血再灌流大鼠損傷具有一定的保護(hù)作用，能夠顯著抑制AQP4、MMP-9和COX2蛋白的表達(dá)，減少梗死面積和腦組織皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡程度，并減輕腦損傷。

參考文獻(xiàn)

［1］吳達(dá)榮，陳世文，潘經(jīng)銳，等.亞低溫療法對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2014，17（4）:57-59.

［2］潘登，譚軍.丁苯肽軟膠囊對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷腦組織含水及含鈣量的影響［J］.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2014，17（2）:38-40.

［3］趙多明，張梓倩，段云霞，等.胡黃連苷Ⅱ?qū)δX缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)作用研究［J］.國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2010，37（6）:461-465，468.

［4］Maedeh，Arabian Nahid，Aboutaleb Mansoureh，et al.Role of morphine preconditioning and nitric oxide following brain ischemia reperfusion injury in mice［J］.Iranian journal of basic medical sciences，2015，18（1）:14-21.

［5］李震.胡黃連苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后TLR4及caspase-3表達(dá)的影響［C］.2012年安徽省神經(jīng)病學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)，2012.

［6］房雷，孫麗，宮相聰，等.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷Caspas-3表達(dá)的影響［J］.國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，2010，32（5）:389-390.

［7］G，Uzum N，Baltaci Rasim，et al.Pre-and post-estrogen administration in global cerebral ischemia reduces blood-brain barrier breakdown in ovariectomized rats［J］.Acta physiologica Hungarica，2015，102（1）:60-66.

［8］王嶺，孫麗，高煥民，等.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)影響［J］.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，47 （1）:62-64.

［9］劉梅，李小剛，譚華.β-七葉皂甙鈉對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠自由基的影響［J］.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2011，14 （17）:4-8.

［10］Yirong，Yang Victor M，Salayandia Jeffrey F，et al.Attenuation of acute stroke injury in rat brain by minocycline promotes blood -brain barrier remodeling and alternative microglia/macrophage activation during recovery［J］.Journal of neuroinflammation，2015，12（1）:245.

［11］孫麗，王嶺，房雷，等.胡黃連苷Ⅱ在腦缺血再灌注損傷中抗氧化作用的研究［J］.國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，2011，33（9）: 803-806.

［12］孫偉，李震，劉洪玲，等.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血后細(xì)胞凋亡和NFκB表達(dá)的影響［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（17）:1457-1459.

［13］李震，李琴，郭云良，等.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷的干預(yù)作用［J］.解剖學(xué)報(bào)，2010，41（1）:9-12.

［14］郭云良，沈衛(wèi)，杜芳，等.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷后TLR4及NFκB表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（1）:58-61.

Protective Effect of Picroside II on Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats and the Expression of MMP-9 and AQP4

CHEN Hongbing，LIU Yimin，ZHAO Lei.Yidu Central Hospital of Weifang，Shandong，Weifang 262500，China.

【Abstract】Objective: To explore and study the protective effect of picroside II on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and the expression of MMP-9 and AQP4.Methods: 30 rats were randomly selected from 120 adult healthy male ones as normal control group，the remaining 90 of preparing cerebral ischemia reperfusion model.78 successful rats were divided into the observation group and the solvent group.The observation group received picroside II by intraperitoneal injection，while the solvent control group were given the same amount of saline by intraperitoneal injection，and the normal control group were not prepared for the rat model of focal cerebral ischemia，but other steps were the same as the solvent group.The neurological function score，DCI，CIV，ACI，AQP4，MMP-9 and COX2 expression in the three groups were observed and compared.Results: In the observation group，neurological deficit score，DCI，ACI，CIV levels decreased significantly compared with the normal control group，and each level of the solvent group were lower than those in the normal control group，and the data of the observation group compared with those of the solvent group decreased significantly.AQP4，MMP-9 and COX2 expression level of the observation group were respectively（1.12±0.14），（0.95±0.08），（0.58±0.05）ng/mL，compared with the solven group，decreasing obviously，and compared with the normal control group，increasing significantly.Differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion: Picroside II can inhibit the expression of AQP4 and MMP-9，which has protective effects on cerebral ischemia reperfusion injury.

【Key words】Picroside II；Cerebral ischemia reperfusion；Aquaporin 4；Matrix metalloproteinases 9

中圖分類號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1004-745X（2016）01-0060-04

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.021

*基金項(xiàng)目：山東省濰坊市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目計(jì)劃（2014007）

通信作者△（電子郵箱：chb0536@aliyun.com）

收稿日期（2015-10-09）