邢三麗　申定珠　陳川　郁志華　吳蓓玲　遲惠英（上海市中醫(yī)老年醫(yī)學研究所，上?！?00031）

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調心方對阿爾茨海默病模型鼠學習記憶能力及p62表達水平的影響*

邢三麗申定珠陳川郁志華吳蓓玲遲惠英
（上海市中醫(yī)老年醫(yī)學研究所，上海200031）

【摘要】目的研究調心方對阿爾茨海默病模型小鼠學習記憶功能的影響及其與自噬受體蛋白p62相關的作用機制。方法采用24周齡APP/PS1雙轉基因小鼠作為早中期阿爾茨海默病模型動物，同時給予調心方及多奈哌齊治療共12周，采用Morris水迷宮檢測各組小鼠學習記憶能力以及用免疫熒光染色、Western blotting法檢測小鼠海馬區(qū)域p62蛋白的表達。結果與正常對照組比較，APP/PS1模型組小鼠學習記憶能力受損，海馬區(qū)域p62表達降低，經中藥調心方治療后，能明顯改善APP/PS1小鼠的學習記憶能力，提高大腦海馬區(qū)域p62的表達。結論調心方可通過提高海馬區(qū)域p62的表達而改善學習記憶功能。

【關鍵詞】阿爾茨海默病調心方p62

阿爾茨海默?。ˋD）是老年人中最常見的癡呆類型，是一種漸進性的神經退行性疾病，其主要病理特征為細胞外老年斑的沉積，胞內神經纖維纏結以及神經元的變性丟失［1］。隨著人口老齡化的加劇，AD患者的人數會迅速增加，將成為全球范圍內影響人類健康的一個重要疾病，近來的研究認為AD屬于蛋白質異常折疊性疾?。?-6］。

由于目前的研究對于AD的發(fā)病原因尚不完全清楚且療效不肯定，近年來，隨著中醫(yī)對AD防治研究的深入，發(fā)現中醫(yī)藥在AD的防治方面有著明顯的優(yōu)勢。我們在前期臨床研究中發(fā)現，輕中度AD患者以心氣虛證為主［7］，以黨參、石菖蒲、遠志、桂枝、龍骨、甘草及

白芍組成的調心方能夠改善輕中度AD患者的認知功能，且能夠提高后扣帶回與腦功能區(qū)的連接性，改善腦功能［8］，但其具體生物學機制尚不清楚。本研究選用24周齡APP/PS1小鼠作為早期AD模型，并用中藥調心方藥物進行干預，觀察自噬受體蛋白p62在早期AD的變化以及調心方對其表達的影響，旨在揭示調心方是否通過影響p62從而改善早期AD學習記憶，以期為臨床治療AD奠定基礎。

1　材料與方法

1.1動物雄性24周齡APP/PS1雙轉基因小鼠，體質量（26±3）g，SPF級，南京大學模式動物研究所提供，許可證號:SCXK（蘇）2010-0001，雄性C57BL/6小鼠，體質量（27±2）g，SPF級，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號:SCXX（京）2012-0001。

1.2試藥與儀器1）藥物:調心方采用配方顆粒，由黨參2.25 g，石菖蒲0.83 g，遠志0.38 g，桂枝0.42 g，龍骨0.5 g，甘草0.83 g，白芍0.5 g組成，單味中藥由江陰天江藥業(yè)有限公司生產，鹽酸多奈哌齊由衛(wèi)材中國藥業(yè)有限公司生產。2）試劑:小鼠抗p62單克隆抗體為BD Transduction Laboratories公司產品；小鼠抗β-Actin單克隆抗體；DAPI染料均為Sigma公司產品；BCA蛋白濃度測定試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司產品。3）儀器:Morris全自動水迷宮測試系統(tǒng)為上海吉量軟件科技有限公司產品；冰凍切片機HM525為德國MICROM公司產品；熒光顯微鏡OLYMPUS BX51。

1.3分組及給藥將36只APP/PS1小鼠分為模型組、調心方組、多奈哌齊組，每組各12只，另設立同月齡、同背景的C57BL/6小鼠12只為正常對照組。適應性喂養(yǎng)1周后，灌胃給藥，每日1次。調心方藥物組劑量按0.057 g/d給予，多奈哌齊組劑量按0.05 mg/d給予，正常對照組每天灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)12周。APP/PS1小鼠不給予任何處理作為模型組。

1.4觀察項目

1.4.1小鼠學習記憶能力檢測采用Morris水迷宮法檢測各組小鼠的學習記憶能力。各組小鼠于給藥12周后進行測試，水溫保持在（22±2）℃，將一個隱藏的平臺浸入1 cm水面之下。各組小鼠連續(xù)訓練5 d，以第2、第3象限池壁中點為出發(fā)點，將小鼠面向池壁輕放入水中，允許小鼠尋找平臺的時間為最大70 s，且允許其在平臺上停留30 s，記錄小鼠找到平臺所需要時間，即為潛伏期。

1.4.2免疫熒光法觀察海馬區(qū)域p62的表達實驗結束后，小鼠給予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，剪開胸腹腔，暴露心臟，經左心室先用生理鹽水快速灌注，再用4%多聚甲醛進行灌注固定，斷頭取腦，依次用20%、30%蔗糖梯度脫水后，待腦組織沉底后取出，做冰凍切片，片厚20 μm。用PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.2）漂洗3次，每張切片用含0.02%Triton-100的10%正常山羊血清封閉1 h；鼠抗p62多克隆抗體（1∶200）4℃過夜；漂洗3次后滴加FITC標記的二抗（1∶1000）37℃避光孵育1 h；用0.01 mol/L PBS漂洗3次后，每張切片滴加DAPI染液50 μL（Sigma公司），室溫下避光孵育30 min；再用PBS漂洗3次后封片，熒光顯微鏡下觀察海馬區(qū)域p62的表達。

1.4.3Western blotting檢測自噬相關蛋白p62表達

實驗結束后，小鼠給予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，隨后迅速剝離海馬，置于生理鹽水中清洗后，提取總蛋白，根據BCA法測定蛋白濃度（根據BCA試劑盒說明書），取40 μg蛋白樣品，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉到PVDF膜，用牛血清白蛋白封閉，加入小鼠p62多克隆抗體（1∶1000）過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶HRP標記二抗，以化學發(fā)光法顯影并拍照，以β-actin作為內部參照

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（）表示，兩組數據比較用Student′s t-test。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組小鼠水迷宮實驗結果比較見表1。與正常對照組相比，模型組小鼠在第5天逃避潛伏期明顯增加（P＜0.01），與模型組比較，調心方組、多奈哌齊組小鼠潛伏期明顯縮短（P＜0.05），而調心方藥組與多奈哌齊組間比較無明顯差異。調心方組、多奈哌齊組小鼠在第1天、第2天于70 s內未找到平臺，潛伏期均記為70 s。

表1　各組小鼠Morris水迷宮試驗潛伏期（s，

表1　各組小鼠Morris水迷宮試驗潛伏期（s，

與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.01。

組別　n多奈哌齊組　16正常對照組　16模型組　16調心方組　16 第1天　第2天　第3天70.00±0.00 70.00±0.00 63.40±18.58 62.15±16.34 50.09±25.28 49.40±27.57 69.33±2.69 66.32±14.27 70.00±0.00 70.00±0.00 70.00±0.00 66.50±9.65 第4天　第5天65.70±16.65 57.18±22.99*47.99±26.96 43.18±26.01 66.82±10.12 70.00±0.00△62.42±17.73 57.91±19.50*

2.2各組小鼠p62表達比較

2.2.1免疫熒光標記檢測各組p62表達見圖1。與正常對照組小鼠比較，經綠色熒光標記的自噬蛋白p62在模型組小鼠的海馬區(qū)域表達減少，即僅有極弱的熒光彌散分布；調心方組熒光信號較模型組有所增強，同樣，多奈哌齊組的海馬區(qū)域，p62標記的熒光信號也稍有增強。

圖1　小鼠海馬內p62免疫熒光染色（200倍）

2.2.2Western blotting法檢測自噬相關蛋白p62表達見圖2。結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)域p62蛋白表達降低；而與模型組比較，調心方組以及多奈哌齊組的海馬區(qū)域p62表達水平均增高，提示調心方、多奈哌齊能通過提高自噬蛋白p62的表達水平來改善AD小鼠的學習記憶能力。

圖2　小鼠海馬內p62蛋白表達量

3　討論

阿爾茨海默病是一種嚴重的腦組織退行性疾病，臨床主要表現為進行性記憶功能減退，嚴重者將會導致患者生活不能自理，給家庭和社會帶來極大的負擔。近來研究發(fā)現自噬功能缺陷可能與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關，敲除自噬相關基因的大鼠，可以出現典型的神經退行性變［9-10］，提示自噬在神經退行性疾病中扮演了極為重要的角色。自噬是細胞內由溶酶體介導來降解異常受損的蛋白質和細胞器，在維護細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，因此通過自噬清除神經元內異常聚積的蛋白，維持神經元正常功能顯得尤為重要［11］。p62蛋白是一種接頭蛋白，能夠與泛素化蛋白結合，作為自噬的一個選擇性降解底物，在一定程度上反映了細胞自噬活性［12］。

從中醫(yī)角度來講，盡管AD的病因病機涉及心、脾、肝、腎多臟器，而心是其主，《素問·靈蘭秘典論》曰“心者，君主之官也，神明出焉”。調心方正是根據以”調心以治氣，調氣以養(yǎng)神”為治療AD的基本法則所創(chuàng)立。在前期臨床試驗中，能夠比西藥多奈哌齊更為有效改善AD患者的認知能力和日常生活能力，尤其是對即刻記憶和短程記憶有顯著改善作用［8］。本研究觀察了調心方對AD模型小鼠自噬相關蛋白p62表達的變化，免疫熒光與Western blot結果均表明:APP/PS1小鼠海馬區(qū)中的自噬相關蛋白p62表達減少，而調心方能上調其表達，表明調心方能夠通過明顯誘導p62表達進而進一步促進自噬的活化，從而發(fā)揮其改善AD學習記憶作用。但調心方對自噬影響的確切機制尚需進一步研究，以及對自噬相關通路還有待深入闡明，以求明確其更有效的作用靶點。

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Effect of Tiaoxin Fang on Learning and Memory Ability and P62 Expression Level of Alzheimer Disease Model Mice

XING Sanli，SHEN Dingzhu，CHEN Chuan，et al.Shanghai Geriatric Institute of Chinese Medicine，Shanghai 200031，China.

【A bstract】Objective: To investigate the effect of Tiaoxin Fang，a compound drug of traditional Chinese medicine，on learning and memory ability and its mechanism related to autophagic receptor p62 in Alzheimer′s disease model mice.Methods: The 12 weeks′old APP/PS1 transgenic mice were selected as early stage of Alzheimer′s disease.Meanwhile，they were treated with Tiaoxin Fang by gastrogavage for 12 weeks.The learning and memory ability was measured with Morris water maze.The protein expressions of p62 in hippocampus of mice were detected by immunofluorescence staining and Western blot assay.Results: Compared with the control group，the learning and memory ability of APP/PS1 mice were damaged，and the expression of p62 in hippocampus decreased.After administrating Tiaoxin Fang，the learning and memory ability and p62 expression of APP/PS1 mice were significantly improved.Conclusion: Tiaoxin Fang ameliorates the learning and memory impairment by improving the expression of p62 in the hippocampus.

【Key words】Alzheimer′s disease；Tiaoxin Fang；p62

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0045-03

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.016

*基金項目：上海市自然科學基金項目（13ZR1439800）

收稿日期（2015-09-17）