趙辰生

山西省心血管病醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　太原　030024

銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癲癇大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受體及神經(jīng)肽Y表達(dá)的影響

趙辰生

山西省心血管病醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科太原030024

【摘要】目的分析銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癲癇大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受體(NR2A)及神經(jīng)肽Y(NPY)表達(dá)的影響。方法將64只實驗大鼠隨機分為4組，正常大鼠對照組16只，單純癲癇模型組16只，銀杏葉提取物預(yù)處理組16只，1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組16只，后3組實驗大鼠予以癲癇大鼠模型制作。造模成功后12 h，取各組大鼠腦組織制作標(biāo)本。采用免疫組化方法檢測標(biāo)本海馬組織NR2A及NPY蛋白的表達(dá)水平及陽性表達(dá)率。結(jié)果單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組NR2A的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平高于正常大鼠對照組(P均<0.05)；銀杏葉提取物預(yù)處理組NR2A陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均低于單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組(P均<0.05)。單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組NPY陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均高于正常大鼠對照組(P均<0.05)；而銀杏葉提取物預(yù)處理組NPY陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均高于正常大鼠對照組、單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組。單純癲癇模型組與1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組在NR2A及NPY表達(dá)比較上，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論銀杏葉提取物預(yù)處理給藥有一定的抗癲癇作用，其抗癲癇的機制可能與上調(diào)NPY及下調(diào)NR2A的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】癲癇；銀杏葉提取物；N-甲基-D-天冬氨酸受體；神經(jīng)肽Y

癲癇是在先天和后天多種因素共同作用下引起的以腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電為主要病理特征的一種神經(jīng)功能紊亂性疾病。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，目前我國癲癇的發(fā)病率約為7.0‰，患病人數(shù)高達(dá)約900萬人，已成為威脅人們身心健康和生活質(zhì)量的重要疾病因素[1]。目前，癲癇的臨床治療以AEDs類抗癲癇藥物治療為主。但在長期的臨床實踐中，這類藥物雖在一定程度上控制了疾病的發(fā)作，但仍有20%的患者存在反復(fù)發(fā)作的現(xiàn)象[2]；加之其突出的毒副反應(yīng)對患者行為和認(rèn)知功能造成的不利影響，大大制約了其臨床應(yīng)用價值。因此，尋找更高效、更安全、毒副作用小的新型抗癲癇藥物成為神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)學(xué)工作者探討的重要課題。而在悠久的藥學(xué)進(jìn)程中，中醫(yī)藥在癲癇的臨床治療上積累了豐富了經(jīng)驗。近年來，據(jù)相關(guān)研究報道顯示，銀杏葉提取物的主要成分—酮類和萜內(nèi)酯因具有對抗腦內(nèi)興奮性氨基酸興奮毒性的作用而可為癲癇的臨床治療開辟新的路徑。本研究通過建立癲癇大鼠模型，在探討銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癲癇大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受體(NR2A)及神經(jīng)肽Y(NPY)表達(dá)的影響的基礎(chǔ)上，分析其抗癲癇作用機制，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器紅藻氨酸注射液(上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司提供)；銀杏葉提取物761(西安天本生物工程有限公司提供)；1，2-丙二醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供)；蘇木素(天津市賽瑞達(dá)生物工程有限公司提供)；兔抗大鼠NPY蛋白多克隆抗體(美國Bioworldtechnology)；大鼠腦立體定向儀(北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司提供)；電子顯微鏡(湖北省科學(xué)器材公司提供)。

1.2實驗動物雄性SD大鼠64只，體質(zhì)量250～300g，購自南方醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心。

1.3方法(1)動物分組及給藥：將64只大鼠隨機分為4組，即正常大鼠對照組16只，單純癲癇模型組16只，銀杏葉提取物預(yù)處理組16只(予以大鼠銀杏葉提取物761溶液注射)，1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組16只(予以大鼠同體積的體積分?jǐn)?shù)50% 1，2-丙二醇溶液注射)。(2)癲癇大鼠模型制作。4組大鼠中，正常大鼠對照組不予以模型制作，另3組大鼠予以模型制作。造模方法：首先，所有大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射，腦立體定向儀定位大鼠頭部，并減除毛發(fā)，局部消毒，鋪巾；然后于大鼠頭部正中線作長10～15mm的切口，再用30%的雙氧水將顱骨上的腱膜、顱骨外膜腐蝕，促使前囟充分暴露，并于前囟后1mm鉆孔；沿鉆孔將裝有紅藻氨酸注射液的微量進(jìn)樣器進(jìn)針，向側(cè)腦室內(nèi)將0.8μL的1μg紅藻氨酸注射液注入，注射完畢后，留針5min后將針緩慢拔出[3]。最后，將大鼠顱骨處所鉆的孔采用骨蠟封閉，再予以頭皮縫合，放回籠中進(jìn)行行為學(xué)監(jiān)測。并按照Racine分級評價，IV～V級為癲癇造模成功；造模失敗的大鼠按照相同的數(shù)量補充造模，直至成功[4]。

1.4NR2A及NPY表達(dá)的檢測(1)標(biāo)本制備：造模成功后12h，麻醉，胸腔剪開后使心臟完全暴露，穿刺針穿刺心尖，并剪開心臟放血。至肺臟變白后，于心臟內(nèi)快速灌注4%多聚甲醛。待大鼠頭尾及四肢變硬后，斷頭取腦，并固定于4 ℃ 4%多聚甲醛中。24h后取大鼠腦部前囟后2.5～4.5mm處的腦組織進(jìn)行脫水包埋，制成蠟塊。(2)NR2A及NPY表達(dá)的檢測：取出厚約4μm的備用石蠟切片，采用免疫組化方法檢測，以光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)，以鏡下5個固定高倍視野(×400)陽性細(xì)胞數(shù)的均值計為海馬組織NR2A及NPY蛋白的表達(dá)水平。同時，組織NR2A及NPY陽性表達(dá)的評定標(biāo)準(zhǔn)為：于每張標(biāo)本切片中選染色最強最集中的5個高倍視野(×400)計算陽性細(xì)胞率，并予以分級：0級：比率<5%；1級：比率5%～25%；2級：比率25%～50%；3級：比率50%～75%；4級：比率>75%。然后，軟色強度評價標(biāo)準(zhǔn)：陰性：0級；1級：弱陽性；2級：陽性；3級：強陽性。最后以陽性細(xì)胞率級別×軟色強度級別/2≥0.5判斷NR2A及NPY為陽性表達(dá)[5]。

2結(jié)果

2.1不同組大鼠海馬組織NR2A的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平比較從表1可以看出，單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組NR2A的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平高于正常大鼠對照組(P均<0.05)；而銀杏葉提取物預(yù)處理組NR2A陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均低于單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組(P均<0.05)。單純癲癇模型組與1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1　不同組大鼠海馬組織NR2A的陽性表達(dá)率及

注：與正常大鼠對照組比較，aP<0.05；與正常大鼠對照組、單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組比較，bP<0.05

2.2不同組大鼠海馬組織NPY的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平從表2可以看出，單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組NPY陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均高于正常大鼠對照組(P均<0.05)；而銀杏葉提取物預(yù)處理組NPY陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均高于正常大鼠對照組、單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組。單純癲癇模型組與1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：與正常大鼠對照組比較，aP<0.05；與正常大鼠對照組、單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組比較，bP<0.05

3討論

紅藻氨酸誘導(dǎo)下所建立的癲癇動物模型作為一種點燃癲癇模型，具有與人類癲癇極為接近的發(fā)作行為特征和海馬硬化神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)改變，因而可作為一個優(yōu)勢生物模型工具，予以造模研究。本研究中，通過紅藻氨酸致大鼠癲癇模型的建立，探討銀杏葉提取物預(yù)處理對大鼠NR2A及NPY蛋白表達(dá)的影響，以期在研究銀杏葉提取物抗癲癇作用的基礎(chǔ)上，闡明其作用機制，為癲癇疾病的臨床治療開辟新的路徑。銀杏葉提取物，主要由黃酮類和萜內(nèi)酯類成分組成，其中，黃銅具有抗氧化、促進(jìn)自由基清除的作用，而萜內(nèi)酯則是目前藥學(xué)領(lǐng)域中效果最強的血小板激活因子拮抗劑。諸多研究報道強調(diào)，銀杏葉提取物預(yù)防給藥能促進(jìn)谷氨酸的神經(jīng)毒作用大大減輕，降低神經(jīng)元內(nèi)的鈣負(fù)荷，有效防止大腦皮質(zhì)脂質(zhì)的過氧化，控制神經(jīng)元的丟失和破壞，進(jìn)而對抗腦內(nèi)興奮性氨基酸產(chǎn)生的興奮毒性作用，且這可能是其抗興奮毒性的作用機制之一[6]。在此作用機制下，通過減輕興奮性神經(jīng)毒作用，降低鈣超載正是抑制癲癇的反復(fù)發(fā)作的重要靶點。因此，銀杏葉提取物具有一定的抗癲癇作用。目前，銀杏葉提取物作為一種天然植物藥物，因具有作用靶點多、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，已在臨床得到了廣泛應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示：(1)銀杏葉提取物預(yù)處理其抗癲癇的機制可能與下調(diào)NR2A的表達(dá)有關(guān)，也就是銀杏葉提取物可能通過下調(diào)NR2A的表達(dá)抑制癲癇發(fā)作。即銀杏葉提取物成份中應(yīng)該至少有一種或多種成份能夠抑制NR2A的表達(dá)，并通過其神經(jīng)保護(hù)功能，能夠減輕興奮性神經(jīng)毒作用，以發(fā)揮抗癲癇作用。NR屬Glu離子型受體，而Glu則是腦內(nèi)典型的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。諸多研究報道強調(diào)，NR功能的增強及NRmRNA表達(dá)上調(diào)，在驚厥的發(fā)生過程中及在癲癇易感性的形成過程中均發(fā)揮重要作用[7]。而NR2A作為NR的亞型，主要存在于大腦海馬中。本研究檢測結(jié)果顯示，單純癲癇模型組NR2A的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平高于正常大鼠對照組，提示致癲癇過程中存在NR過度的激活。而銀杏葉提取物預(yù)處理組NR2A陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均低于單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預(yù)處理組。由此可推測銀杏葉提取物預(yù)處理其抗癲癇的機制可能與下調(diào)NR2A的表達(dá)有關(guān)。(2)銀杏葉提取物預(yù)處理其抗癲癇的機制可能與上調(diào)NPY的表達(dá)有關(guān)。銀杏葉提取物成份中應(yīng)該至少有一種或多種成份能夠上調(diào)NPY的表達(dá)，并通過其神經(jīng)保護(hù)功能，能夠減輕興奮性神經(jīng)毒作用，以發(fā)揮抗癲癇作用。NPY作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可拮抗釋放海馬內(nèi)Glu遞質(zhì)而發(fā)揮抗癲癇作用。目前已有大量研究報道證實，通過增加NPY的釋放能有效減少癇樣放電的持續(xù)時間，降低其發(fā)作頻率[8]。本研究檢測結(jié)果顯示，單純癲癇模型組NPY陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均高于正常大鼠對照組，而銀杏葉提取物預(yù)處理組NPY陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均高于單純癲癇模型組。提示，銀杏葉提取物預(yù)處理其抗癲癇的機制可能與上調(diào)NPY的表達(dá)有關(guān)。

綜上，銀杏葉提取物預(yù)處理給藥有一定的抗癲癇作用，其抗癲癇的機制可能與上調(diào)NPY及下調(diào)NR2A的表達(dá)有關(guān)。

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(收稿2015-05-11)

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B

【文章編號】1673-5110(2016)10-0045-02