壽記新　高海東　王建業(yè)　劉菲菲　付旭東　王　酩　丁攀峰　孟恩平　周少龍

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院　鄭州　450052

MCT1 MMP-2mRNA在人腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)及相關(guān)性研究

壽記新高海東△王建業(yè)劉菲菲付旭東王酩丁攀峰孟恩平周少龍

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院鄭州450052

【摘要】目的探討單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(MCT1)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)mRNA在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及相關(guān)性。方法應(yīng)用熒光定量qRT-PCR法，分別測(cè)定50例原發(fā)性人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤和10例腦內(nèi)減壓術(shù)患者腦組織標(biāo)本中MCT1、MMP-2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果(1)MCT1、MMP-2在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.05)；(2)MCT1、MMP-2在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組較低級(jí)別膠質(zhì)瘤組mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；(3)MCT1、MMP-2mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)可能具有正相關(guān)性(r=0.712，P=0.001)，對(duì)照組標(biāo)本中均未見明顯MCT1、MMP-2mRNA表達(dá)。結(jié)論(1)MCT1、MMP-2mRNA的表達(dá)同膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別關(guān)系密切，且病理級(jí)別越高其表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；(2)MCT1、MMP-2mRNA表達(dá)可能協(xié)同參與了人腦原發(fā)性膠質(zhì)瘤的病理發(fā)展過程；(3))MCT1、MMP-2mRNA關(guān)聯(lián)檢測(cè)有可能作為判斷膠質(zhì)瘤侵襲性及其預(yù)后的重要參考指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；腦膠質(zhì)瘤

作為顱腦腫瘤中當(dāng)前較多見的原發(fā)性人腦膠質(zhì)瘤[1]，目前仍無理想的根治措施，已有研究證明，其病理分級(jí)越高侵襲性越強(qiáng)，且其詳細(xì)發(fā)病機(jī)制尚不清楚[2]。最新研究表明單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(MCT1)在膠質(zhì)瘤的一系列病理演變中具有一定的推動(dòng)作用[3]，并與膠質(zhì)瘤的惡性程度關(guān)系密切。Miranda-Gon?alves等[4]發(fā)現(xiàn)，與彌漫性星形細(xì)胞瘤和非腫瘤腦組織相比，腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的細(xì)胞膜上MCT1的表達(dá)明顯增強(qiáng)。另有報(bào)道，具有侵襲能力的膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠分泌大量MMP-2，同時(shí)其侵襲力與MMP-2的表達(dá)水平密切相關(guān)[5]；但二者在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及其相關(guān)性，目前研究報(bào)道尚少，本文旨在探討在原發(fā)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及惡變過程中二者mRNA的表達(dá)及其相關(guān)性，以期提供一定的數(shù)據(jù)供實(shí)驗(yàn)及臨床參考應(yīng)用。

1資料與方法

1.1病例資料選取我院神經(jīng)外科2012-07-2015-05，術(shù)中切除并經(jīng)組織學(xué)病理切片證實(shí)的原發(fā)性人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本50例為研究對(duì)象(觀察組)，男28例，女22例；年齡21～74歲，平均(48±11)歲，中位年齡46歲。按照《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤組織學(xué)分類》(2007)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)分類，Ⅰ～Ⅱ級(jí)共21例作為低度惡性組(其中少突膠質(zhì)瘤10例，星形膠質(zhì)瘤11例)，Ⅲ～Ⅳ級(jí)共29例為高度惡性組(其中少支膠質(zhì)細(xì)胞瘤4例，混合性膠質(zhì)瘤7例，惡性星形膠質(zhì)瘤18例)，同時(shí)篩選本院神經(jīng)外科病區(qū)，相同時(shí)期因腦損傷后10例內(nèi)減術(shù)腦外傷患者的腦組織為對(duì)照組，所有選取的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本均經(jīng)石蠟常規(guī)性包埋及10%甲醛進(jìn)行固定。

1.2主要試劑、儀器高純總RNA提取試劑盒(購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物公司)；按照總RNA提取試劑盒說明書嚴(yán)格操作，同時(shí)將獲得總RNA純度通過微量紫外光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定并定量，A260：A280在1.692～1.913，滿足實(shí)驗(yàn)需要。MCT1、MMP-2、β-actin基因引物序列由Primerpremier7.0軟件設(shè)計(jì)引物，TaKaRa公司合成。引物序列如下：

MCT1f：5'-TGAAGTGCTAGGAGGCG-GA-3'，

r：5'-ACGTCTTCAAGGTGCTGTTCAT-3’；

MMP-2f：5'-ACCCCAACGTACACCCCGAT-3'，

r：5'-CGCGAGAACCCAACTCCTCC-3'；

β-actinf：5'-AGCCGTGGACATCCGCAAAG3'，

r：5'-GTGGAAG-GTAGACAGCGAGG-3'

1.3RT-PCR反應(yīng)測(cè)定各級(jí)別膠質(zhì)瘤MCT1、MMP-2mRNA表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：通過qRT-PCR試劑盒中的M-MLV第一鏈合成得到的第一鏈體系，獲得cDNA，在—20℃下保存?zhèn)溆谩Ｇ覍ⅵ?actin作為內(nèi)比照，運(yùn)用qRT-PCR(美國(guó)羅氏LightCycler480)RT-PCR反應(yīng)體系：4×qPCRMix10μL，上游引物20pmol(2μL)，20pmol(2μL)下游引物，模板cDNA4μl，dH2O2μL，共20μL。反應(yīng)條件：96 ℃ 10s，58 ℃ 40s，總擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。然后，將所得到的qRT-PCR產(chǎn)物樣品通過2%的瓊脂糖凝膠電泳和熔解曲線給予鑒定，最后采用(2-△△CT)公式給予定量分析。

2結(jié)果

2.1MCT1mRNA在人腦膠質(zhì)瘤及正常對(duì)照組中表達(dá)的比較在對(duì)照組、低度及高度惡性人腦膠質(zhì)瘤3組標(biāo)本中MCT1mRNA的表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示上述3組標(biāo)本中MCT1mRNA的表達(dá)強(qiáng)度逐次增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　2組MCT1表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低度惡性組比較，#P<0.05

2.2MMP-2mRNA在膠質(zhì)瘤及對(duì)照組標(biāo)本中表達(dá)的比較在對(duì)照組、低度及高度惡性膠質(zhì)瘤3組標(biāo)本中MMP-2mRNA的表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示，上述3組標(biāo)本中MMP-2mRNA的表達(dá)強(qiáng)度逐次增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　人腦膠質(zhì)瘤和正常對(duì)照組中MMP-2的表達(dá)±s)

注：與對(duì)照組比較*P<0.05；與低度惡性組比較，#P<0.05

2.3在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中MCT1和MMP-2mRNA表達(dá)的相關(guān)性運(yùn)用Spearman相關(guān)分析法顯示MCT1和MMP-2mRNA的表達(dá)可能具有正相關(guān)性關(guān)系(r=0.712，P=0.001)。

3討論

腦膠質(zhì)瘤作為當(dāng)前發(fā)病率較高的顱腦腫瘤之一，其一旦發(fā)生往往具有血供豐富、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)及高復(fù)發(fā)率等生物學(xué)行為，在這一復(fù)雜的病理過程中膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞不斷汲取養(yǎng)分尤其是保持新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的更新代謝，維持腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定顯得尤為重要，而單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(mono-carboxylatetransporterproteins，MCTs)作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上廣泛分布的一類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在糖酵解代謝(H+、乳酸轉(zhuǎn)運(yùn))中發(fā)揮者不可替代作用[6]；且MCT1在人體內(nèi)數(shù)量最多，分布最廣對(duì)代謝和內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)的意義最為重要[7]。DeSaedeleer等[8]通過對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞系的研究后發(fā)現(xiàn)，乳酸能夠激活HiF-1并誘導(dǎo)腫瘤血管生成，而MCT1能夠促進(jìn)乳酸進(jìn)入腫瘤細(xì)胞以供細(xì)胞呼吸，且還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移而誘導(dǎo)腫瘤血管生成及增強(qiáng)其侵襲性；同樣已有研究表明，MMPs在膠質(zhì)瘤的侵襲性中也具有促進(jìn)作用，MMP-2[9-10]是一組含Zn2+的能降解基底膜的蛋白酶，主要降解明膠、膠原Ⅳ、膠原Ⅴ、層黏連蛋白、彈性蛋白及纖黏蛋白等，Chen等[11]實(shí)驗(yàn)表明，T98G膠質(zhì)瘤系能分泌大量的MMP-2，而在ECM的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好且能沿著基底膜侵襲，本研究應(yīng)用qRT-PCR法對(duì)低、高度惡性膠質(zhì)瘤組以及正常對(duì)照組中MCT1、MMP-2mRNA的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行研究分析。結(jié)果顯示，MCT1、MMP-2mRNA在膠質(zhì)瘤組標(biāo)本中的表達(dá)較正常對(duì)照組中的表達(dá)明顯增強(qiáng)；提示：MCT1、MMP-2mRNA在原發(fā)人腦膠質(zhì)瘤的病理及惡變過程中具有明顯的推動(dòng)作用；且MCT1、MMP-2mRNA具有膠質(zhì)瘤惡性程度以及病理級(jí)別增高而表達(dá)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，即MCT1、MMP-2mRNA的表達(dá)強(qiáng)度與原發(fā)人腦膠質(zhì)瘤的惡性度呈正相關(guān)性，與Aruna等[12]采用膠原酶譜分析發(fā)現(xiàn)，MMP-2在多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的酶活性比星形細(xì)胞瘤高，實(shí)驗(yàn)結(jié)論相似。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究雖然僅對(duì)MCT1、MMP-2在原發(fā)性人腦膠質(zhì)瘤中的mRNA表達(dá)作了定量分析，且原發(fā)性人腦膠質(zhì)瘤的詳細(xì)發(fā)病機(jī)制仍然不明，但初步揭示了MCT1、MMP-2在膠質(zhì)瘤中所起的作用及二者之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步對(duì)膠質(zhì)瘤的的發(fā)病機(jī)理等研究積累了數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，并為膠質(zhì)瘤基因靶點(diǎn)治療進(jìn)行了新的探索，二者共同檢測(cè)有可能作為判斷膠質(zhì)瘤侵襲性及其預(yù)后的重要參考指標(biāo)。

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(收稿2015-11-11)

基金項(xiàng)目：河南省科技廳項(xiàng)目(102300410065)

通訊作者：△高海東，E-mail：zdwfy9666@163.com

【中圖分類號(hào)】R739.4

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)10-0031-02