李　松

四川達州市中西醫(yī)綜合醫(yī)院檢驗科　達州　635000

缺血性腦卒中急性期血清腦特異性miRNAs水平的變化及與炎癥應答和梗死體積的相關性

李松

四川達州市中西醫(yī)綜合醫(yī)院檢驗科達州635000

【摘要】目的探討缺血性腦卒中急性期血清腦特異性miRNAs水平的變化及其與炎癥應答和梗死體積的相關性。方法收集起病24 h內的缺血性腦卒中患者22例及健康對照8例，收集臨床資料，NIHSS評分評估神經功能缺損，MRI檢查評估梗死體積。于卒中起病24 h內(22例)及48 h內(6例)采取靜脈血，分離血清。結果卒中起病24 h內血清miRNA-124水平顯著下降，起病48 h內血清miRNA-219水平較起病24 h內有所升高。卒中起病24 h內血清miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219水平均與梗死體積呈負相關，血清miRNA-9水平與入院時及入院24 h NIHSS評分呈負相關。結論腦特異性miRNAs參與調節(jié)缺血性腦卒中急性期炎癥應答水平，血清miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219水平降低加劇炎癥反應及腦組織炎癥損傷。

【關鍵詞】缺血性腦卒中；梗死體積；血清腦特異性miRNAs；MMP-9；hs-CRP

目前腦血管病已成為我國城市和農村人口的第1位致殘和死亡原因，且發(fā)病有逐年增多的趨勢，嚴重威脅人類健康及生存質量，給社會和家庭造成沉重的經濟負擔。全國第3次死因回顧抽樣調查顯示，中國的腦卒中發(fā)病率較發(fā)達國家高4～5倍，其中70%以上為缺血性腦卒中[1]。一系列臨床前研究和臨床研究證明，靶向作用于炎癥反應的神經保護治療可避免缺血半暗帶區(qū)的細胞死亡，改善卒中患者的神經功能和預后。自2008年Lawrie等[2]在人類血清中首次檢測到miRNAs，并發(fā)現(xiàn)彌漫性大B細胞淋巴瘤患者血清miRNA-2l表達上調，此后不少學者采用各種方法在健康人群以及各種疾病患者的血漿或血清中檢測到多種miRNAs，并發(fā)現(xiàn)在不同的疾病中有各自特異的循環(huán)miRNAs的表達譜[3]。分析血清腦特異性miRNAs水平與患者腦梗死體積和炎癥應答水平的相關性，及其對患者神經功能的影響，以期發(fā)現(xiàn)對缺血性腦卒中的診斷及預后敏感性和特異性均較高的實驗室指標。

1材料與方法

1.1實驗材料臨床資料：此研究共收入22例急性缺血性腦卒中患者及8例健康對照。病例組為2012-06-2013-03我院神經內科就診的急性缺血性腦卒中患者，納入標準：(1)臨床確診為急性缺血性卒中，入院前頭部CT排除腦出血；(2)于卒中發(fā)病24h內入院；(3)能接受MRI檢查(無MRI檢查禁忌證)。排除標準：(1)年齡<18歲；(2)接受過溶栓治療或目前正在使用抗凝藥物；(3)顱內出血或合并梗死后出血；(4)合并任何其他神經系統(tǒng)疾病或精神疾??；(5)合并腫瘤；(6)合并自身免疫性疾??；(7)研究期間出現(xiàn)感染相關的臨床癥狀。入組患者及健康對照均由本人或法定監(jiān)護人簽署知情同意書。由1名熟練的神經內科醫(yī)師采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NationalInstituteofHealthStrokeScale，NIHSS)對患者入院時、入院24h后及入院7d后的神經功能缺損程度進行評估。收集病例組的臨床資料，包括起病時間、基線NIHSS評分、年齡、性別、高血壓、吸煙、糖尿病、房顫、血脂紊亂、冠心病、既往卒中史等。

1.2實驗方法病例采集，收集血液標本：所有入組患者均于起病24h內采取靜脈血1次，其中6例于第1次采血24h后(即起病48h內)接受第2次采血。以肘正中靜脈為穿刺部位，由1名熟練的護士采取靜脈血5mL，采用不添加任何抗凝劑和促凝劑的血清分離管(紅管)收集血液標本。因溶血會影響循環(huán)中某些miRNAs的含量[4]，采取靜脈血后不顛倒采血管，標本轉運途中盡量減少顛簸，以避免溶血。

MRI評估梗死體積：所有入組患者入院后均至我院醫(yī)學影像科接受頭部MRI檢查，MRI儀器型號為MagnetomTrioTim3.0T。掃描序列包括T1、T2、T2FLAIR、MRA、DWI，掃描層厚為6mm，掃描層間距為7.8mm。掃描圖像上傳到PACS系統(tǒng)。采用ImageJ2.1.4.6軟件對每個梗死層面進行分析，手繪出DWI序列上的高信號區(qū)域，由軟件自動計算出高信號區(qū)域對應的面積。采用如下公式計算梗死體積：梗死體積=各梗死層面DWI高信號區(qū)域面積之和×(掃描層厚+掃描層間距)。血清總RNA提取：血清總RNA的提取參照TrizolLS(Invitrogen公司)說明書進行，分光光度法檢測所提取RNA的濃度和純度，本實驗所提取RNA的A260/A280>1.8。

SYBR法實時定量PCR：反應步驟嚴格按照Takara公司OneStepPrimeScript?miRNAcDNASynthesisKit及SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒說明書進行。熔解曲線為銳利的單峰則結果可信。讀取每孔的CT值，以cel-miRNA-39為參照，采用2-△△Ct法[40]評定每個樣本中相應miRNA分子的含量。

ELISA檢測血清MMP-9濃度：實驗步驟按照MMP-9ELISA試劑盒說明書進行采用CurveExpert1.4軟件進行標準曲線的擬合，然后利用此標準曲線計算每個血清樣本MMP-9的濃度。

血漿hs-CRP濃度的檢測：患者入院后，于卒中起病24h內采取靜脈血3mL送至中南醫(yī)院檢驗科，采用透射免疫比濁法測定血漿hs-CRP濃度，試劑盒由西門子提供，由西門子BNP全自動特定蛋白儀完成。

1.3統(tǒng)計學分析此研究涉及到的所有統(tǒng)計學分析均由SPSS19.0完成。首先對連續(xù)變量資料如血清miRNAs水平、MMP-9含量、hs-CRP含量、梗死體積和NIHSS評分進行正態(tài)分析，對符合正態(tài)分布的資料采用參數(shù)t檢驗，對不符合正態(tài)分布的資料采用Kruscal-Wallis與Mann-WhitneyU 檢驗或Wilcoxon秩和檢驗。采用受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲線) 分析檢測指標的診斷價值。采用Spearman-Rho檢驗分析檢測指標間的相關性。所有檢驗均為雙側，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1血清中可穩(wěn)定檢測到腦特異性miRNAs本研究采用TrizolLS提取血清中總RNA，然后采用加尾法反轉錄及SYBR法熒光定量PCR可以穩(wěn)定檢測到miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219的擴增。盡管部分標本CT值超過30，但熔解曲線均為銳利的單峰，表明本研究采用的方法體系具有較高的特異性。圖1為1例健康志愿者血清cel-miRNA-39及miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219的擴增曲線和熔解曲線。

圖11例健康志愿者血清外參及腦特異性miRNAs的擴增曲線和熔解曲線上2排：擴增曲線依次為：cel-miRNA-39、miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219下2排：熔解曲線依次為：cel-miRNA-39、miRNA-124、miRNA-9、miRNA-219

2.2缺血性腦卒中急性期血清腦特異性miRNAs水平變化卒中起病24h內患者血清腦異性miRNAs水平變化：卒中起病24h內，在所檢測的3種腦特異性miRNAs中，只有血清miRNA-124水平較健康對照組明顯降低(P=0.002)(圖2a)，血清miRNA-9水平與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(圖2b)，血清miRNA-219水平較健康對照組有下降趨勢(P=0.095)(圖2c)。其中血清miRNA-124水平對于診斷急性缺血性腦卒中的ROC曲線下面積為0.792(95%可信區(qū)間0.627～0.956，P=0.017)，此時診斷的敏感性為76.2%，特異性為87.5%。

卒中起病48h內患者血清腦異性miRNAs水平變化：本研究同時檢測了6例患者卒中起病48h內血清中3種腦特異性miRNAs的水平。與卒中起病24h內的血清miRNAs水平相比，血清miRNA-124(圖2d)和miRNA-9(圖2e)水平無明顯變化，而血清miRNA-219水平較卒中起病24h內有所上升(P=0.028)(圖2f)。

圖2缺血性卒中急性期血清腦特異性miRNAs水平上排：病例組(卒中起病24h內)vs健康對照組：(a)miRNA-124(b)miRNA-9(c)miRNA-219下排：卒中起病24h內vs卒中起病48h內：(d)miRNA-124(e)miRNA-9(f)miRNA-219

3討論

目前循環(huán)miRNAs的定量檢測缺乏一致公認的內參分子，既往多采用U6、RNU6B、18S或miRNA-16等作為內參。然而U6和RNU6B并非miRNAs，它們的提取、反轉錄和PCR擴增效率可能與miRNAs有差異，因此U6和RNU6B作為循環(huán)miRNAs檢測的內參目前存在爭議[5]。而循環(huán)miRNA-16水平受溶血影響[6]，且某些腫瘤患者體內的循環(huán)U6、miRNA-16的含量會發(fā)生變化[7-8]。因此，本研究于RNA提取之前加入cel-miRNA-39作為外參，以消除不同樣本之間RNA提取率的差異，使得不同樣本之間的比較具有較高的可信性。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中急性期血清miRNA-124水平較健康對照組明顯下降，血清miRNA-219水平有下降趨勢，亞組分析顯示血清miRNA-9水平在大面積腦梗死患者中也有所下降。本研究結果與上述動物模型研究結果的差異可能由下列方法學上的區(qū)別所致：(1)上述動物研究在血液標本的處理過程中，均未進行14 000～16 000g的高速離心。腦組織缺血缺氧后腦細胞死亡，釋放大量細胞碎片、凋亡小體等，同時血腦屏障通透性增高，使得這些物質較易穿過血腦屏障進入到循環(huán)中，導致所獲得的血漿樣本中含有較多的壞死細胞、細胞碎片、凋亡小體等，如前所述這些結構中含有大量miRNAs，使所檢測到的循環(huán)miRNA水平較高。由于血腦屏障破壞的程度與梗死體積并不成正比，因此血漿miRNA-124含量與大鼠腦梗死體積之間不存在相關性。(2)本研究所檢測的標本為血清，而上述動物研究所檢測的標本為血漿。在循環(huán)miRNAs的檢測中，標本處理過程中的高速離心步驟對血漿miRNAs含量的影響大于血清。McDonald[6]等發(fā)現(xiàn)對于同一健康志愿者，血漿中所檢測miRNAs的含量明顯高于血清；當對血漿和血清標本進行15 000g的高速離心處理后，血漿中所檢測miRNAs的含量的下降程度明顯高于血清，高速離心可以消除血漿和血清miRNAs含量的差異。

由于本文在血清樣本處理過程中采用高速離心步驟去除了細胞碎片、凋亡小體、血小板和大囊泡等的干擾，本研究中檢測到的血清腦特異性miRNAs應以微小泡形式或AGO蛋白結合形式存在。如前所述，非微小泡包被的miRNAs主要來自細胞壞死后胞漿的被動釋放，若血清腦特異性miRNAs以AGO蛋白結合形式存在，理論上缺血性腦卒中急性期其含量會升高。然而本研究中，缺血性卒中急性期血清miRNA-124水平明顯下降，血清miRNA-219水平有下降趨勢，血清miRNA-9水平在大面積腦梗死患者中也有所下降；并且血清中3種腦特異性miRNAs的水平均與炎性因子水平呈負相關，提示這些血清miRNAs具備一定生理活性，能夠參與調節(jié)炎癥反應。目前并沒有哺乳動物中Ago-miRNA復合物參與調節(jié)細胞間信息交換的相關報道，而微小泡形式的miRNAs則具備這些生理功能[9]。據(jù)此本文推測，本研究中檢測到的血清miRNAs可能主要以微小泡形式存在，但目前并無生理和病理狀態(tài)下血清腦特異性miRNAs存在形式的相關研究。

綜上所述，缺血性腦卒中急性期血清腦特異性miRNAs水平下降，并與炎性因子MMP-9水平和梗死體積呈負相關，其中血清miRNA-9水平與神經功能缺損程度呈負相關。這些miRNAs可能以微小泡形式存在，并具有生理功能，能夠抑制缺血性腦卒中急性期過度的炎癥反應。然而，這些miRNAs的來源、在循環(huán)中的存在形式、動態(tài)變化及治療價值有待更深入的研究，本研究結果也有待更大樣本的臨床試驗予以證實。

4參考文獻

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(收稿2015-06-11)

ChangesofthelevelsofserumspecificmiRNAsatacutestageofcerebralischemicstrokeanditscorrelationwithinflammatoryresponseandinfarctionvolume

Li Song

Department of Laboratory， the Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital of Dazhou City， Dazhou 635000， China

【Abstract】Objective To evaluate the changes of the levels of serum specific miRNAs at acute stage of cerebral ischemic stroke and its correlation with inflammatory response and infarction volume. Methods Clinical data from 22 consecutive patients with acute ischemic stroke within 24h after symptom onset and 8 healthy controls were retrospectively enrolled. Neurological function deficit was assessed by the National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS) and infarction volume was evaluated by MRI. Venous blood was collected and serum was isolated from each patient within 24h (22 cases) and 48h (6 cases) after stroke onset. The levels of serum miRNA were detected by RT-PCR and the level of MMP-9 by ELISA. Results The levels of serum miRNA-124 within 24h after stroke onset were significantly decreased. The level of serum miRNA-219 within 48h after stroke significantly rose up compared to that within 24h. The levels of all the three miRNAs (miRNA-124， miRNA-9， miRNA-219) detected within 24h after stroke onset were negatively correlated with infarction volume. Additionally， the level of serum miRNA-9 had negative correlation with NIHSS scores at admission and at 24 hours. Conclusion Brain specific miRNAs are involved in the regulation of inflammatory response in acute ischemic stroke. The lower levels of serum miRNA-124， miRNA-9 and miRNA-219 can aggravate inflammatory response and exacerbate cerebral injury.

【Key words】Ischemic stroke； Infarction volume； Serum specific miRNAs； MMP-9； hs-CRP

【中圖分類號】R743.33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)10-0007-03