郭珊嵐,王　衛(wèi)

(資陽市第一人民醫(yī)院病理科，四川 資陽　641300)

CDH1基因甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預后的相關性分析

郭珊嵐,王衛(wèi)

(資陽市第一人民醫(yī)院病理科，四川 資陽641300)

摘要：目的檢測原發(fā)性結(jié)直腸癌患者術中腹腔灌洗液懸浮細胞中的CDH1基因啟動子所在5'-CpG島的異常甲基化，同時對其異常甲基化與臨床病情發(fā)展、病理變化及術后預后的相關關系進行探討。方法選取該院腫瘤科進行結(jié)直腸癌切除術的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者，所有入選患者由專人進行跟蹤隨訪。檢測CDH1基因啟動子所在5'-CpG島的異常甲基化，對其異常甲基化與臨床病情發(fā)展、病理變化及術后預后的相關關系進行探討。結(jié)果該研究共納入患者184例，其中甲基化組86例，非甲基化組98例。對兩組患者臨床病理結(jié)果檢查可知甲基化組腫瘤直徑大于非甲基化組(P<0.001)，甲基化組腫瘤浸潤性所占比例高于非甲基化組(P<0.001)，甲基化組腫瘤分化程度低于非甲基化組(P<0.001)，甲基化組淋巴轉(zhuǎn)移率、遠處轉(zhuǎn)移率高于非甲基化組(P<0.001，P=0.026)，甲基化組臨床TNM分期更晚(P<0.001)。根據(jù)隨訪結(jié)果顯示非甲基化組患者生存率高于甲基化組患者(P<0.05)。Cox比例風險模型結(jié)果顯示，患者腫瘤的大體分型、分化程度、侵襲程度和病理分期是影響生存預后的變量，其中腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化是影響預后最重要的獨立因素，RR=28.514。結(jié)論原發(fā)性結(jié)直腸癌患者腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化程度提高，惡性程度高，預后差。

關鍵詞：結(jié)直腸腫瘤;DNA甲基化;染色體,人,16對;預后

基因CDH1是一種依賴鈣離子的細胞黏附分子，編碼上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)，定位于染色體16q22.1的，對同種細胞細胞間的黏附有重要作用，它功能缺失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著極為密切的相關性[1-2]。有研究報道，消化道腫瘤患者腫瘤組織中可檢測到CDH1的缺失、上皮性鈣黏蛋白的缺失或其表達水平的降低[3]。在其他常見腫瘤如卵巢腫瘤、頭頸部腫瘤中也有不同程度的確實或表達水平降低[4-5]。位于5'-CpG島的CDH1基因啟動子，其異常甲基化可影響上皮性鈣黏蛋白表達，進一步影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。本研究選用實時熒光PCR技術，檢測甲基化特異性，獲取入選結(jié)直腸癌患者術中腹腔灌洗液，制備細胞懸浮液，檢測CDH1基因啟動子所在5'-CpG島的異常甲基化，同時對其異常甲基化與臨床病情發(fā)展、病理變化及術后預后的相關關系進行探討。

1臨床資料

1.1一般資料選取2013年1～12月我院腫瘤科進行結(jié)直腸癌切除術的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者，所有入選患者由專人進行跟蹤隨訪，隨訪頻率根據(jù)患者自身情況決定，隨訪截止日期2014年12月31日。

本研究由我院醫(yī)學倫理委員會批準通過并進行監(jiān)督，所有患者及家屬對本研究研究內(nèi)容及風險均表示知情并理解，并簽署知情同意書。

1.2選擇標準納入標準：結(jié)腸鏡檢診斷為原發(fā)性結(jié)直腸癌；鏡檢獲取活組織病理切片確認為原發(fā)性結(jié)直腸癌；手術切除前未進行任何放化療等輔助治療；影像學CT及MRI判定為可切除腫瘤。排除標準：心臟超聲、血生化、肺通氣等檢查顯示患者身體情況無法接受手術者結(jié)直腸癌腫瘤位于腹膜反折下者。

2方法

2.1灌洗液采集患者麻醉后，在開腹后，手術前，溫熱生理鹽水500 mL灌洗腹腔，收集灌洗液，以備檢查。

2.2DNA提取及亞硫酸鹽修飾腹腔灌洗液細胞懸浮，提取懸浮細胞DNA，測定DNA濃度及純度，操作嚴格按照步驟進行。使用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒對提取的DNA進行亞硫酸鹽修飾。亞硫酸亞轉(zhuǎn)化試劑盒操作步驟如下：10 μg提取DNA加入5 μL NaOH裂解液，所用NaOH裂解液濃度為3 mol·L-1。37℃20 min變性。加入NaHSO4溶液520 μL，所用NaHSO4溶液濃度為2 mol·L-1。加入氫醌溶液30 μL，所用氫醌溶液濃度為0.2 mol·L-1。50℃ 16～18 h水浴。DNA樣品、8%異丙醇2 mL加入DNA純化樹脂1 mL進行濾析。加入3 mol·L-1醋酸鈉、無水乙醇進行沉淀。離心，棄上清。自然干燥。加入TE溶液20 μL溶解。使用全基因組擴增技術對修飾后的DNA進行擴增。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3DNA甲基化檢測根據(jù)GenBank基因庫設計CDH1基因甲基化特異性引物及CDH1基因非甲基化特異性引物。其中CDH1基因甲基化特異性引物正義鏈為5′-TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3′，反義鏈為5′-TAATTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3′，擴增片段116bp。CDH1基因非甲基化特異性引物正義鏈為5′-TAACTAAAAATTCACCTACCGAC-3′，反義鏈為5′-CACMCCAATCAACAACACA -3′，擴增片段97 bp?？瞻讓φ帐褂谜麴s水代替。陽性對照使用體外Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶處理的人基因組全DNA。陰性對照組使用體外未經(jīng)處理的人基因組全DNA。檢測使用ABI7500 PCR儀進行檢測，加入甲基化引物、非甲基化引物、各對照組樣本、各檢測組樣本進行實時熒光PCR檢測甲基化特異性。

2.4甲基化標準根據(jù)測得CT值繪制標準曲線，計算各組甲基化DNA拷貝數(shù)，計算甲基化比率，計算公式為甲基化百分數(shù)=[甲基化DNA拷貝數(shù)/(甲基化DNA拷貝數(shù)+非甲基化DNA拷貝數(shù))]×100%。所得甲基化百分數(shù)小于等于20%認為非甲基化，大于20%認為甲基化。將PCR所得產(chǎn)物使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像觀察所得條帶，出現(xiàn)甲基化條帶認為甲基化，出現(xiàn)非甲基化條帶認為非甲基化。綜合上述結(jié)果，將樣本及產(chǎn)物分為兩組，甲基化組和非甲基化組。

3結(jié)果

3.1臨床病理比較本研究共納入患者184例，其中男性109例，女性75例，患者年齡33～69歲，平均年齡(48.2±9.6)歲。腹腔灌洗液懸浮細胞甲基化檢測結(jié)果顯示，甲基化組86例，非甲基化組98例。對兩組患者臨床病理結(jié)果檢查可知甲基化組腫瘤直徑大于非甲基化組(P<0.001)，甲基化組腫瘤浸潤性所占比例高于非甲基化組(P<0.001)，甲基化組腫瘤分化程度低于非甲基化組(P<0.001)，甲基化組淋巴轉(zhuǎn)移率、遠處轉(zhuǎn)移率高于非甲基化組(P<0.001，P=0.026)，甲基化組臨床TNM分期更晚(P<0.001)，表1。

3.2預后比較對所有入選患者進行專人隨訪，隨訪時間為2～24個月。隨訪結(jié)果顯示，非甲基化組患者生存率高于甲基化組患者(P<0.05)，將隨訪數(shù)據(jù)進行Kaplan-Meiker生存分析,結(jié)果如圖1，兩組曲線分離，非甲基化組2年生存率顯著高于甲基組(P<0.001)。

表1　患者臨床病理比較

圖1　患者生存曲線比較

3.3結(jié)直腸癌患者Cox多因素生存分析Cox比例風險模型結(jié)果顯示，患者腫瘤的大體分型、分化程度、侵襲程度和病理分期是影響生存預后的變量，其中腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化是影響預后最重要的獨立因素，RR=28.514(P<0.001)。

表2　Cox風險分析

4討論

消化道腫瘤的發(fā)病率、死亡率隨著我們社會進步、經(jīng)濟發(fā)展、飲食改變逐年增加，成為臨床上極為常見的腫瘤之一[7]。作為一個在眾多抑癌基因中研究較為透徹的CDH1，它的缺失或結(jié)構(gòu)改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[8]?；駽DH1是一種依賴鈣離子的細胞黏附分子，編碼上皮性鈣黏蛋白，定位于染色體16q22.1的，對同種細胞細胞間的黏附有重要作用，對細胞的分化也有著促進作用[9]。CDH1在細胞分化維持、細胞極性維持、細胞組織結(jié)構(gòu)維持等方面起著重要作用[10]。有研究報道，消化道腫瘤患者腫瘤組織中可檢測到CDH1的缺失、上皮性鈣黏蛋白的缺失或其表達水平的降低[11]。研究發(fā)現(xiàn)，CDH1表達缺失或表達水平降低是導致消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[12]。有文獻報道，CDH1基因表達下降的原因可能是其基因突變或上游啟動子甲基化[13]。近期有研究報道稱，DNA上游啟動子甲基化較其基因突變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中更為常見。在腫瘤發(fā)生發(fā)展進程中，基因表達降低的重要機制之一就是啟動子區(qū)CpG島的甲基化[14]。因此，對DNA甲基化、甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關性、甲基化與腫瘤相關基因的研究逐漸受到重視。

Katarzyna等[15]研究結(jié)果顯示，所納入研究的35例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者中CDH1基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化檢出率為48%，同時研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性結(jié)直腸癌患者上皮性鈣黏蛋白水平的降低與CDH1基因啟動子區(qū)域甲基化有著顯著的相關關系。本研究結(jié)果表明，納入標準的184例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者中，CDH1基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化檢出率為46.7%。

基因的甲基化產(chǎn)生的影響包括腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展、腫瘤細胞脫落、患者術后及其他輔助治療后預后等多方面。基因甲基化可以導致遠處組織如腹腔內(nèi)腫瘤細胞脫落，作為腹腔種植轉(zhuǎn)移的重要種子細胞。Yakirevich等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腹腔灌洗液中無基因甲基化患者術后生存率高于、復發(fā)率低于發(fā)現(xiàn)基因甲基化患者。Benusiglio研究結(jié)果顯示，腹腔灌洗液中發(fā)現(xiàn)甲基化基因患者術后腹腔轉(zhuǎn)移率明顯高于無甲基化患者，另外，部分患者發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)腫瘤的肝肺轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，甲基化組患者淋巴轉(zhuǎn)移率、遠處轉(zhuǎn)移率高于非甲基化組患者。隨訪結(jié)果進行生存分析顯示，非甲基化組患者生存率高于甲基化組患者。Cox比例風險模型結(jié)果顯示，患者腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化是原發(fā)性結(jié)直腸癌患者術后預后生存率的獨立危險因素。此結(jié)果與大多數(shù)文獻報道結(jié)果一致。

綜上，腹腔灌洗液懸浮細胞甲基化組患者較非甲基化組患者腫瘤直徑大，腫瘤浸潤性所占比例高，腫瘤分化程度低，淋巴轉(zhuǎn)移率、遠處轉(zhuǎn)移率高，臨床TNM分期晚。隨訪結(jié)果顯示，非甲基化組患者生存率高。Cox比例風險模型結(jié)果顯示，患者腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化是原發(fā)性結(jié)直腸癌患者術后預后生存率的獨立危險因素。

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The correlation between CDH1 gene methylation status and clinical pathological characteristics and prognosis of colorectal cancer

GUO Shan-lan,WANG Wei

(TheFirstPeople'sHospital,Ziyang,Sichuan641300,China)

Abstract：ObjectiveTo detect the CDH1 gene methylation of suspension cells in intraoperative abdominal lavage fluid from colorectal cancer patients,and to examine its association with clinicopathology and prognosis.MethodsReal-time methylation-specific polymerase chain reaction(q-MSP)Was used to investigate the methylation status of the CDH1 gene promoter 5’-CpG islands from intraoperative abdominal lavage fluid in 184 patients with colorectal cancer.The associations between methylation of CDH1 genes and clinieopathologic features and prognosis were investigated.ResultsAmong the 184 colorectal cancer patients,aberrant methylation of CDH1 gene was detected in 86 patients.Significant associations were found between CDH1 methylation status and tumor size,growth pattern,differentiation,distant metastasis,and clinical staging(all P<0.05).The median progression-free survival was 28.6 months for CDH1 methylation group and 42.3 months for non—methylated group,and the difference Was statistically significant(P<0.01).The factors of Dukes stage,gross tumor configuration,intramural spread，differentiation degree and CDH1 methylation status in intraoperative peritoneal lavage fluid were available independent prognostic factors through multivariate analysis.And CDH1 methylation status in intraoperative peritoneal lavage fluid was the most important factor,RR=28.514.ConclusionsColorectal cancer patients with aberrant methylation of 5’-CpG of CDH1 gene promoter of suspension cells in abdominal lavage have higher malignancy,more metastasis and worse prognosis.

Key words:Colorectal Neoplasms;DNA Methylation;Chromosomes,Human,Pair 16;Prognosis

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.020

(收稿日期：2015-12-21，修回日期：2016-03-18)