孫愛(ài)華,胡文輝

(1.黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，湖北 黃岡　438000；2.鄂州市中心血站，湖北 鄂州　436000)

HPLC法測(cè)定勞拉西泮片有關(guān)物質(zhì)的含量

孫愛(ài)華1,胡文輝2

(1.黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，湖北 黃岡438000；2.鄂州市中心血站，湖北 鄂州436000)

摘要：目的建立勞拉西泮片的含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC方法。方法以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑的ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相：0.05 mol·L-1的磷酸二氫銨(含0.5%的三乙胺，用磷酸調(diào)pH至2.5)∶甲醇∶乙腈=35∶35∶30；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。結(jié)果勞拉西泮峰及各雜質(zhì)峰均能良好分離。雜質(zhì)A濃度與峰面積在1.5 μg·L-1～8.048 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。雜質(zhì)B濃度與峰面積在15.0 μg·L-1～8.224 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。雜質(zhì)C濃度與峰面積在1.7 μg·L-1～8.144 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好;雜質(zhì)D濃度與峰面積在2.5 μg·L-1～8.032 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好；雜質(zhì)E濃度與峰面積在3.0 μg·L-1～8.032 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。測(cè)定樣品含量平均值為97.9%，有關(guān)物質(zhì)均符合要求。結(jié)論該方法快速、簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可作為勞拉西泮片的含量及有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：勞拉西泮;色譜法,高壓液相

《美國(guó)藥典》35版[4]均收錄了勞拉西泮原料和其片劑、口服溶液劑及注射劑。兩版藥典中的勞拉西泮原料藥部分，列出了5個(gè)有關(guān)物質(zhì)，有兩個(gè)工藝雜質(zhì)，分別是雜質(zhì)A和雜質(zhì)B，其中雜質(zhì)B即是工藝雜質(zhì)又是降解產(chǎn)物，所以對(duì)雜質(zhì)B進(jìn)行了嚴(yán)格控制，對(duì)雜質(zhì)A則未做具體要求?！稓W洲藥典》[5]只收載了勞拉西泮原料藥，并用薄層色譜法對(duì)有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)A和雜質(zhì)B進(jìn)行測(cè)定，但未做具體要求?！吨袊?guó)藥典》2015版[6]均收載了勞拉西泮和勞拉西泮片，原料藥考察了雜質(zhì)Ⅰ(即雜質(zhì)B)和雜質(zhì)Ⅱ(即雜質(zhì)C)，片劑只考察了雜質(zhì)Ⅱ(即雜質(zhì)C)。

為了提高勞拉西泮原料藥及制劑的質(zhì)量，根據(jù)其生產(chǎn)工藝條件及降解特點(diǎn)，并結(jié)合強(qiáng)制破壞試驗(yàn)的結(jié)果，最終確定了勞拉西泮原料藥及制劑的有關(guān)物質(zhì)，包括雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D和雜質(zhì)E(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。本文主要建立了一種可以同時(shí)測(cè)定勞拉西泮片劑和其有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的HPLC方法，經(jīng)驗(yàn)證該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏和專屬性強(qiáng)。

1儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器(Agilent)及安捷倫色譜工作站，電子分析天平(AE230S 梅特勒-托利多上海有限公司)，SB5200超聲儀(必能信超聲上海公司)。色譜純乙腈，色譜純甲醇，超純水，磷酸二氫銨(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，三乙胺(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。勞拉西泮對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)171253-200401)，雜質(zhì)A、B、C、D、E為自制。勞拉西泮片(泰國(guó)大西洋制藥有限公司，批號(hào)：140524)，規(guī)格1.0 mg。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.05 mol·L-1的磷酸二氫銨(含0.5%的三乙胺，用磷酸調(diào)pH至2.5)∶甲醇∶乙腈=35∶35∶30；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2.2溶液配制取勞拉西泮片對(duì)照品20片，研細(xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于勞拉西泮20 mg)，置于100 mL容量瓶中，加入適量的流動(dòng)相溶解，超聲10 min，放冷，補(bǔ)加流動(dòng)相至刻度，搖勻，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。精密量取1.0 mL，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

精密稱取勞拉西泮對(duì)照品5.06 mg、雜質(zhì)A對(duì)照品5.03 mg、雜質(zhì)B對(duì)照品5.14 mg、雜質(zhì)C對(duì)照品5.09 mg、雜質(zhì)D對(duì)照品4.97 mg、雜質(zhì)E對(duì)照品5.02 mg，分別置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為勞拉西泮和各雜質(zhì)對(duì)照品的貯備溶液。

注：雜質(zhì)A.3(RS)-7-氯-5-(2-氯苯基)-1，3-二氫-乙酰氧基-2H-苯二氮-2-酮；雜質(zhì)B.(2-氨基-5-氯苯基)(2-氯苯基)甲酮；雜質(zhì)C.6-氯-4-(2-氯苯基)-喹唑啉-2-醛；雜質(zhì)D.6-氯-4-(2-氯苯基)-喹唑啉甲酸；雜質(zhì)E.6-氯-4-(2-氯苯基)-喹唑啉甲醇。

圖1勞拉西泮原料藥及制劑的有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)圖

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別精密量取上述勞拉西泮及各雜質(zhì)對(duì)照品的貯備溶液1.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，各峰理論板數(shù)要求不低于3 000，分離度不低于1.5，如圖2所示。

注：1.勞拉西泮；2.雜質(zhì)A；3.雜質(zhì)D；4.雜質(zhì)E；5.雜質(zhì)C；6.雜質(zhì)B。

圖2系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)圖譜

2.3.2檢測(cè)限及定量限測(cè)定取配制的各雜質(zhì)對(duì)照品溶液1.0 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為檢測(cè)限定量限的試驗(yàn)溶液， 按照上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣10 μL，根據(jù)信噪比法進(jìn)行試驗(yàn)，信噪比為3計(jì)算檢測(cè)限，信噪比為10計(jì)算定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　各雜質(zhì)檢測(cè)限及定量限/ng

2.3.3線性試驗(yàn)精密稱量各雜質(zhì)對(duì)照品的貯備溶液0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為各雜質(zhì)對(duì)照品的定量溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)(A)，以濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(C)，得各雜質(zhì)的回歸方程及線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.4精密度試驗(yàn)精密量取系統(tǒng)適用性溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算各峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。勞拉西泮和雜質(zhì)A、B、C、D、E的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.27%、0.39%、1.04%、1.54%、0.86%、1.02%(n=6)。

2.3.5溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)分別精密量取系統(tǒng)適用性溶液10 μL，于0、2、4、8、12 h進(jìn)行測(cè)定，勞拉西泮及雜質(zhì)A、B、C、D、E峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.92%、0.83%、1.04%、0.78%、1.16%、1.28%，說(shuō)明樣品及各個(gè)雜質(zhì)在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6回收率試驗(yàn)精密稱取勞拉西泮對(duì)照品10.03、10.11、10.05 mg，分別置50 mL量瓶中，精密量取各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液2.5、5.0、7.5 mL，置上述量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別作為加樣回收率的低、中、高濃度。根據(jù)各雜質(zhì)峰面積計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　各雜質(zhì)回收率及RSD結(jié)果匯總

2.3.7專屬性試驗(yàn)精密稱定勞拉西泮對(duì)照品100 mg于50 mL的容量瓶中，加入適量甲醇振搖溶解，用甲醇稀釋至刻度。量取5.0 mL對(duì)照品溶液于25 mL的容量瓶中，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液5.0 mL搖勻，甲醇稀釋至刻度，定容，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷備用。量取5.0 mL對(duì)照品溶液，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉搖勻，甲醇稀釋至刻度，定容，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷備用。量取5.0 mL對(duì)照品溶液，加入30%雙氧水溶液5.0 mL，搖勻，室溫放置24 h。另外分別量取5.0 mL的溶液2份，置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度。一個(gè)置于100℃水浴鍋中加熱4 h，放冷。另外一個(gè)置于強(qiáng)光(5 000 Lx)下照射12 h后，放冷。分別精密量取上述各破壞項(xiàng)中的溶液1.0 mL，加入流動(dòng)相稀釋至10.0 mL，按照上述色譜條件取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3。

表2　各雜質(zhì)線性方程及線性范圍

圖3　專屬性試驗(yàn)圖譜

通過(guò)圖譜可以看出，勞拉西泮在堿性條件及光照條件下較為穩(wěn)定，未見(jiàn)明顯雜質(zhì)出現(xiàn)。在酸性條件下破壞出雜質(zhì)B，峰面積按照面積歸一化計(jì)算約為17.6%。在氧化破壞中產(chǎn)生雜質(zhì)C、雜質(zhì)D及雜質(zhì)E，按照面積歸一化法計(jì)算峰面積分別為2.5%、3.1%、2.7%。高溫破壞雜質(zhì)主要為雜質(zhì)C，峰面積按照面積歸一法計(jì)算為5.1%。

2.4樣品含量測(cè)定取上市品勞拉西泮片，研細(xì)，精密稱量粉末適量(相當(dāng)于勞拉西泮10 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇適量，超聲溶解10 min，補(bǔ)加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，濾液作為供試品備用。按照上述色譜條件，精密量取10 μL進(jìn)色譜儀，記錄圖譜。已知雜質(zhì)按照雜質(zhì)對(duì)照計(jì)算，未知雜質(zhì)按照0.5%勞拉西泮的自身對(duì)照法來(lái)計(jì)算樣品含量及有關(guān)物質(zhì)含量。檢查結(jié)果表明樣品中雜質(zhì)B和雜質(zhì)E均未檢出，其余有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　勞拉西泮片有關(guān)物質(zhì)及含量測(cè)定結(jié)果

3討論

勞拉西泮在230 nm處有最大吸收，綜合降解產(chǎn)物及各有關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)，選擇235 nm為有關(guān)物質(zhì)及含量的檢測(cè)波長(zhǎng)，此波長(zhǎng)可以兼顧其他各有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。試驗(yàn)過(guò)程中分別試驗(yàn)了甲醇和磷酸緩沖鹽、乙腈和磷酸緩沖鹽等不同流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)單一有機(jī)溶劑和磷酸緩沖鹽的組合不能將勞拉西泮和各個(gè)有關(guān)物質(zhì)有效分類。將甲醇和乙腈同等比例再與磷酸緩沖鹽混合可以達(dá)到有效分離各個(gè)有關(guān)物質(zhì)及勞拉西泮。由于雜質(zhì)D為一極性較大的羧酸類化合物，保留時(shí)間受pH的影響較大。故試驗(yàn)中采用了磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)，且用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.5。

參考文獻(xiàn)

[1]孫定人,張石革,梁之江.國(guó)家臨床新藥集[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2001:19.

[2]郜娜,賈琳靜,謝敏,等.反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中勞拉西泮的濃度[J].藥物分析雜志,2005,25(4):423-425.

[3]程?hào)|升,陳蕾,南楠.勞拉西泮原料及其片劑中有關(guān)物質(zhì)的檢查[J].藥物分析雜志,2006,26(12):1800-1803.

[4]The United States Pharmacopeial Convention US.Pharmacopeia (35)/ National Formulary(30)[S],2011:3720.

[5]European Directorate for the Quality Control of Medicines.European Pharmacopoeia 8.0[S],2013:1931.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(二部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:452.

HPLC determination of the related substances in iorazepam tablets

SUN Ai-hua1，HU Wen-hui2

(1.PharmaceuticalDepartment,HuanggangCentralHospital,Huanggang,Hubei438000,China;2.EzhouCentralBloodStation,Hubei436000,China)

Abstract:ObjectiveTo determine the related substances and content in iorazepam tablets by HPLC.MethodsThe chromatographic separation was performed on ZORBAX SB-C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm)that was made by alkyl-bonded silica gels.The mobile phase was 0.05 mol·L-1ammonium dihydrogen orthophosphate (including 0.5% trimethylamine and pH adjusted to 2.5 with phosphoric acid)∶methanol∶acetonitrile=35∶35∶30.The flow rate was 1.0 mL·min-1,the detection wavelength was 235 nm,the sample size was 10 μL,and the column temperature was set at 30℃.ResultsThe resolution between iorazepam and the other peaks met the requirements.The linearity of related substance A concentration and peak area was 1.5 μg·L-1～8.048 mg·L-1.The linearity of related substance B concentration and peak area was 15.0 μg·L-1～8.224 mg·L-1.The linearity of related substance C concentration and peak area was 1.7 μg·L-1～8.144 mg·L-1.The linearity of related substance D concentration and peak area was 2.5 μg·L-1～7.952 mg·L-1.The linearity of related substance E concentration and peak area was 3.0 μg·L-1～8.032 mg·L-1.Determination of the sample average content was 97.9%,and the related substance met the requirements.ConclusionsThe method was quick,simple,stable,and well repeatable,which could be used to determine the content of iorazepam tablets and its related substances.

Key words:iorazepam;Chromatography,High Pressure Liquid

通信作者：胡文輝，男，副主任技師，研究方向：臨床檢驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)診斷，E-mail:2531134237@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.014

(收稿日期：2015-10-15，修回日期：2016-02-23)