孫愛華,胡文輝
(1.黃岡市中心醫(yī)院藥劑科,湖北 黃岡 438000;2.鄂州市中心血站,湖北 鄂州 436000)
HPLC法測定勞拉西泮片有關(guān)物質(zhì)的含量
孫愛華1,胡文輝2
(1.黃岡市中心醫(yī)院藥劑科,湖北 黃岡438000;2.鄂州市中心血站,湖北 鄂州436000)
摘要:目的建立勞拉西泮片的含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC方法。方法以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑的ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)為色譜柱,流動(dòng)相:0.05 mol·L-1的磷酸二氫銨(含0.5%的三乙胺,用磷酸調(diào)pH至2.5)∶甲醇∶乙腈=35∶35∶30;流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:235 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30℃。結(jié)果勞拉西泮峰及各雜質(zhì)峰均能良好分離。雜質(zhì)A濃度與峰面積在1.5 μg·L-1~8.048 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。雜質(zhì)B濃度與峰面積在15.0 μg·L-1~8.224 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。雜質(zhì)C濃度與峰面積在1.7 μg·L-1~8.144 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好;雜質(zhì)D濃度與峰面積在2.5 μg·L-1~8.032 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好;雜質(zhì)E濃度與峰面積在3.0 μg·L-1~8.032 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。測定樣品含量平均值為97.9%,有關(guān)物質(zhì)均符合要求。結(jié)論該方法快速、簡單,穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,可作為勞拉西泮片的含量及有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。
關(guān)鍵詞:勞拉西泮;色譜法,高壓液相
《美國藥典》35版[4]均收錄了勞拉西泮原料和其片劑、口服溶液劑及注射劑。兩版藥典中的勞拉西泮原料藥部分,列出了5個(gè)有關(guān)物質(zhì),有兩個(gè)工藝雜質(zhì),分別是雜質(zhì)A和雜質(zhì)B,其中雜質(zhì)B即是工藝雜質(zhì)又是降解產(chǎn)物,所以對(duì)雜質(zhì)B進(jìn)行了嚴(yán)格控制,對(duì)雜質(zhì)A則未做具體要求。《歐洲藥典》[5]只收載了勞拉西泮原料藥,并用薄層色譜法對(duì)有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)A和雜質(zhì)B進(jìn)行測定,但未做具體要求?!吨袊幍洹?015版[6]均收載了勞拉西泮和勞拉西泮片,原料藥考察了雜質(zhì)Ⅰ(即雜質(zhì)B)和雜質(zhì)Ⅱ(即雜質(zhì)C),片劑只考察了雜質(zhì)Ⅱ(即雜質(zhì)C)。
為了提高勞拉西泮原料藥及制劑的質(zhì)量,根據(jù)其生產(chǎn)工藝條件及降解特點(diǎn),并結(jié)合強(qiáng)制破壞試驗(yàn)的結(jié)果,最終確定了勞拉西泮原料藥及制劑的有關(guān)物質(zhì),包括雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D和雜質(zhì)E(結(jié)構(gòu)見圖1)。本文主要建立了一種可以同時(shí)測定勞拉西泮片劑和其有關(guān)物質(zhì)檢測的HPLC方法,經(jīng)驗(yàn)證該方法操作簡便、靈敏和專屬性強(qiáng)。
1儀器與試藥
Agilent 1260型高效液相色譜儀,紫外檢測器(Agilent)及安捷倫色譜工作站,電子分析天平(AE230S 梅特勒-托利多上海有限公司),SB5200超聲儀(必能信超聲上海公司)。色譜純乙腈,色譜純甲醇,超純水,磷酸二氫銨(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),三乙胺(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),磷酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。勞拉西泮對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào)171253-200401),雜質(zhì)A、B、C、D、E為自制。勞拉西泮片(泰國大西洋制藥有限公司,批號(hào):140524),規(guī)格1.0 mg。
2方法和結(jié)果
2.1色譜條件色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:0.05 mol·L-1的磷酸二氫銨(含0.5%的三乙胺,用磷酸調(diào)pH至2.5)∶甲醇∶乙腈=35∶35∶30;流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:235 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30℃。
2.2溶液配制取勞拉西泮片對(duì)照品20片,研細(xì),取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于勞拉西泮20 mg),置于100 mL容量瓶中,加入適量的流動(dòng)相溶解,超聲10 min,放冷,補(bǔ)加流動(dòng)相至刻度,搖勻,過濾,濾液作為供試品溶液。精密量取1.0 mL,置50 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。
精密稱取勞拉西泮對(duì)照品5.06 mg、雜質(zhì)A對(duì)照品5.03 mg、雜質(zhì)B對(duì)照品5.14 mg、雜質(zhì)C對(duì)照品5.09 mg、雜質(zhì)D對(duì)照品4.97 mg、雜質(zhì)E對(duì)照品5.02 mg,分別置于25 mL容量瓶中,加入乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為勞拉西泮和各雜質(zhì)對(duì)照品的貯備溶液。
注:雜質(zhì)A.3(RS)-7-氯-5-(2-氯苯基)-1,3-二氫-乙酰氧基-2H-苯二氮-2-酮;雜質(zhì)B.(2-氨基-5-氯苯基)(2-氯苯基)甲酮;雜質(zhì)C.6-氯-4-(2-氯苯基)-喹唑啉-2-醛;雜質(zhì)D.6-氯-4-(2-氯苯基)-喹唑啉甲酸;雜質(zhì)E.6-氯-4-(2-氯苯基)-喹唑啉甲醇。
圖1勞拉西泮原料藥及制劑的有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)圖
2.3方法學(xué)考察
2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別精密量取上述勞拉西泮及各雜質(zhì)對(duì)照品的貯備溶液1.0 mL,置于10 mL的容量瓶中,加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取10 μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,各峰理論板數(shù)要求不低于3 000,分離度不低于1.5,如圖2所示。
注:1.勞拉西泮;2.雜質(zhì)A;3.雜質(zhì)D;4.雜質(zhì)E;5.雜質(zhì)C;6.雜質(zhì)B。
圖2系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)圖譜
2.3.2檢測限及定量限測定取配制的各雜質(zhì)對(duì)照品溶液1.0 mL,分別置于100 mL容量瓶中,加入流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為檢測限定量限的試驗(yàn)溶液, 按照上述色譜條件進(jìn)樣,進(jìn)樣10 μL,根據(jù)信噪比法進(jìn)行試驗(yàn),信噪比為3計(jì)算檢測限,信噪比為10計(jì)算定量限,結(jié)果見表1。
表1 各雜質(zhì)檢測限及定量限/ng
2.3.3線性試驗(yàn)精密稱量各雜質(zhì)對(duì)照品的貯備溶液0.5、1.0、1.5、2.0 mL,分別于50 mL容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為各雜質(zhì)對(duì)照品的定量溶液,分別進(jìn)樣10 μL,記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)(A),以濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(C),得各雜質(zhì)的回歸方程及線性范圍,結(jié)果見表2。
2.3.4精密度試驗(yàn)精密量取系統(tǒng)適用性溶液10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,分別計(jì)算各峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。勞拉西泮和雜質(zhì)A、B、C、D、E的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.27%、0.39%、1.04%、1.54%、0.86%、1.02%(n=6)。
2.3.5溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)分別精密量取系統(tǒng)適用性溶液10 μL,于0、2、4、8、12 h進(jìn)行測定,勞拉西泮及雜質(zhì)A、B、C、D、E峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.92%、0.83%、1.04%、0.78%、1.16%、1.28%,說明樣品及各個(gè)雜質(zhì)在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.6回收率試驗(yàn)精密稱取勞拉西泮對(duì)照品10.03、10.11、10.05 mg,分別置50 mL量瓶中,精密量取各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液2.5、5.0、7.5 mL,置上述量瓶中,加入流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,分別作為加樣回收率的低、中、高濃度。根據(jù)各雜質(zhì)峰面積計(jì)算其回收率,結(jié)果見表3。
表3 各雜質(zhì)回收率及RSD結(jié)果匯總
2.3.7專屬性試驗(yàn)精密稱定勞拉西泮對(duì)照品100 mg于50 mL的容量瓶中,加入適量甲醇振搖溶解,用甲醇稀釋至刻度。量取5.0 mL對(duì)照品溶液于25 mL的容量瓶中,加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液5.0 mL搖勻,甲醇稀釋至刻度,定容,置于100℃水浴鍋中4 h,放冷備用。量取5.0 mL對(duì)照品溶液,加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉搖勻,甲醇稀釋至刻度,定容,置于100℃水浴鍋中4 h,放冷備用。量取5.0 mL對(duì)照品溶液,加入30%雙氧水溶液5.0 mL,搖勻,室溫放置24 h。另外分別量取5.0 mL的溶液2份,置于25 mL的容量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度。一個(gè)置于100℃水浴鍋中加熱4 h,放冷。另外一個(gè)置于強(qiáng)光(5 000 Lx)下照射12 h后,放冷。分別精密量取上述各破壞項(xiàng)中的溶液1.0 mL,加入流動(dòng)相稀釋至10.0 mL,按照上述色譜條件取10 μL進(jìn)樣測定,記錄色譜圖,見圖3。
表2 各雜質(zhì)線性方程及線性范圍
圖3 專屬性試驗(yàn)圖譜
通過圖譜可以看出,勞拉西泮在堿性條件及光照條件下較為穩(wěn)定,未見明顯雜質(zhì)出現(xiàn)。在酸性條件下破壞出雜質(zhì)B,峰面積按照面積歸一化計(jì)算約為17.6%。在氧化破壞中產(chǎn)生雜質(zhì)C、雜質(zhì)D及雜質(zhì)E,按照面積歸一化法計(jì)算峰面積分別為2.5%、3.1%、2.7%。高溫破壞雜質(zhì)主要為雜質(zhì)C,峰面積按照面積歸一法計(jì)算為5.1%。
2.4樣品含量測定取上市品勞拉西泮片,研細(xì),精密稱量粉末適量(相當(dāng)于勞拉西泮10 mg),置于50 mL容量瓶中,加入甲醇適量,超聲溶解10 min,補(bǔ)加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,過濾,濾液作為供試品備用。按照上述色譜條件,精密量取10 μL進(jìn)色譜儀,記錄圖譜。已知雜質(zhì)按照雜質(zhì)對(duì)照計(jì)算,未知雜質(zhì)按照0.5%勞拉西泮的自身對(duì)照法來計(jì)算樣品含量及有關(guān)物質(zhì)含量。檢查結(jié)果表明樣品中雜質(zhì)B和雜質(zhì)E均未檢出,其余有關(guān)物質(zhì)和含量測定結(jié)果見表4。
表4 勞拉西泮片有關(guān)物質(zhì)及含量測定結(jié)果
3討論
勞拉西泮在230 nm處有最大吸收,綜合降解產(chǎn)物及各有關(guān)物質(zhì)的性質(zhì),選擇235 nm為有關(guān)物質(zhì)及含量的檢測波長,此波長可以兼顧其他各有關(guān)物質(zhì)的檢測。試驗(yàn)過程中分別試驗(yàn)了甲醇和磷酸緩沖鹽、乙腈和磷酸緩沖鹽等不同流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)單一有機(jī)溶劑和磷酸緩沖鹽的組合不能將勞拉西泮和各個(gè)有關(guān)物質(zhì)有效分類。將甲醇和乙腈同等比例再與磷酸緩沖鹽混合可以達(dá)到有效分離各個(gè)有關(guān)物質(zhì)及勞拉西泮。由于雜質(zhì)D為一極性較大的羧酸類化合物,保留時(shí)間受pH的影響較大。故試驗(yàn)中采用了磷酸鹽緩沖液系統(tǒng),且用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.5。
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HPLC determination of the related substances in iorazepam tablets
SUN Ai-hua1,HU Wen-hui2
(1.PharmaceuticalDepartment,HuanggangCentralHospital,Huanggang,Hubei438000,China;2.EzhouCentralBloodStation,Hubei436000,China)
Abstract:ObjectiveTo determine the related substances and content in iorazepam tablets by HPLC.MethodsThe chromatographic separation was performed on ZORBAX SB-C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm)that was made by alkyl-bonded silica gels.The mobile phase was 0.05 mol·L-1ammonium dihydrogen orthophosphate (including 0.5% trimethylamine and pH adjusted to 2.5 with phosphoric acid)∶methanol∶acetonitrile=35∶35∶30.The flow rate was 1.0 mL·min-1,the detection wavelength was 235 nm,the sample size was 10 μL,and the column temperature was set at 30℃.ResultsThe resolution between iorazepam and the other peaks met the requirements.The linearity of related substance A concentration and peak area was 1.5 μg·L-1~8.048 mg·L-1.The linearity of related substance B concentration and peak area was 15.0 μg·L-1~8.224 mg·L-1.The linearity of related substance C concentration and peak area was 1.7 μg·L-1~8.144 mg·L-1.The linearity of related substance D concentration and peak area was 2.5 μg·L-1~7.952 mg·L-1.The linearity of related substance E concentration and peak area was 3.0 μg·L-1~8.032 mg·L-1.Determination of the sample average content was 97.9%,and the related substance met the requirements.ConclusionsThe method was quick,simple,stable,and well repeatable,which could be used to determine the content of iorazepam tablets and its related substances.
Key words:iorazepam;Chromatography,High Pressure Liquid
通信作者:胡文輝,男,副主任技師,研究方向:臨床檢驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)診斷,E-mail:2531134237@qq.com
doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.014
(收稿日期:2015-10-15,修回日期:2016-02-23)