付曼妮，解翠林,石　年

(鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院普愛院區(qū)皮膚科，湖北 黃石　435000)

咪唑斯汀對小鼠接觸性皮炎的治療作用及機制研究

付曼妮，解翠林,石年

(鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院普愛院區(qū)皮膚科，湖北 黃石435000)

摘要：目的研究咪唑斯汀對小鼠反應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)的治療作用，探討其可能機制。方法采用2,4 - 二硝基氟苯(DNFB )建立小鼠背部ACD 模型，建模成功后將其隨機分為模型組、咪唑斯汀組和陽性對照醋酸地塞米松組，每組10只，另外選取10只未處理小鼠作為對照組。用藥組采取灌胃給藥進行治療，對照組和模型組給予同體積生理鹽水。分別在用藥后24 h和72 h測定各組皮膚厚度、皮膚腫脹度，ELISA法測定各組小鼠血清及皮膚組織TNF-α、IL-4、 IL-12的水平。結(jié)果與對照組相比，ACD組皮膚厚度和皮膚腫脹度顯著增加 (P<0.05 )；血清及皮損組織中TNF-α、IL-12水平顯著升高( P<0.05 )，而IL-4水平無明顯變化(P>0.05)。咪唑斯汀能顯著抑制ACD小鼠皮膚腫脹及TNF-α、IL-12 水平，對IL-4水平無明顯影響。結(jié)論咪唑斯汀對ACD模型小鼠有良好的治療作用，可能與降低Th1型炎癥因子水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞：皮炎,接觸性；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素4；白細(xì)胞介素12；小鼠

反應(yīng)性接觸性皮炎( allergic contact dermatitis，ACD )是由抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚過敏性疾病，通常是由皮膚直接接觸化學(xué)物質(zhì)所致[1]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，ACD逐漸成為一種普遍的職業(yè)病。大量研究表明多種細(xì)胞因子，如IFN-γ、IL-2、IL-4在ACD的發(fā)病中其重要作用[2-3]。咪唑斯汀是一種特異性外周組胺H1受體拮抗劑，臨床上常用于蕁麻疹的治療。另有報道顯示，咪唑斯汀還具有抗過敏、抗炎作用[4]。為進一步證實其抗炎作用，本研究采用DNFB建立小鼠ACD模型，觀察咪唑斯汀對其的療效并探究其可能機制。

1材料

1.1實驗動物SPF級雄性昆明小鼠(購于湖北省疾控中心實驗動物中心)40只，體重(30±5)g。飼養(yǎng)于室溫22～25 ℃，相對濕度40%～50%環(huán)境下，混合飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2主要藥品與試劑咪唑斯汀原料(西安楊森制藥有限公司)用5%羧甲基纖維素鈉配制成0.33 g·L-1混懸液，醋酸地塞米松原料(天津力生制藥有限公司)用5%羧甲基纖維素鈉配制成0.025 g·L-1混懸液，DNFB(Sigma公司)配制成0.2%及0.5%的丙酮溶液。TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(美國Cayman公司)，IL-4、IL-12酶聯(lián)免疫試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司)。

2方法

2.1ACD模型建立將40只昆明小鼠隨機分為對照組、模型組、咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組四組，每組10只。實驗小鼠喂養(yǎng)2周后，腹部同一部位除毛，暴露皮膚；實驗第1天和第2天于去毛部位涂抹0.5% DNFB溶液25 μL各致敏一次。第6天在小鼠背部右側(cè)選取3 cm × 2 cm區(qū)域除毛，涂抹0.2% DNFB 25 μL激發(fā)。左側(cè)3 cm × 2 cm剃毛區(qū)域為對照[5]。在致敏前1天開始，咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組按3.33 mg ·kg-1和0.25 mg·kg-1劑量灌藥，每天1次，連續(xù)5 d。激發(fā)后立即灌藥，1次/d，連續(xù)灌藥3 d。

2.2皮膚厚度及腫脹度測定激發(fā)皮炎24 h和72 h后，剪取背部右側(cè)及對稱左側(cè)皮膚，用電子游標(biāo)卡尺測量皮膚厚度，測量3次，取平均值；然后用直徑6 mm圓形打孔器打取兩側(cè)相同面積皮膚，稱重，計算對應(yīng)的皮膚腫脹度。計算公式：皮膚腫脹度 = (炎癥區(qū)域皮膚重量 - 健康區(qū)域皮膚重量)/健康區(qū)域皮膚重量×100 %。

2.3Elisa法測定小鼠血清及皮膚組織TNF-α，IL-4， IL-12水平激發(fā)皮炎24 h和72 h后，分別處死各組小鼠5只，摘取眼球取血，4℃靜置過夜后12 000 r·min-1離心，分離血清，皮膚組織勻漿后測定蛋白濃度，嚴(yán)格按照Elisa試劑盒說明書方法測定血清及皮膚組織上清液中細(xì)胞因子TNF-α，IL-4，IL-6，IL-12水平。

3結(jié)果

3.1咪唑斯汀對DNFB誘導(dǎo)的皮膚腫脹有明顯抑制作用與空白對照組比較，激發(fā)皮炎24 h后，模型組小鼠背部皮膚潮紅、充血，明顯肥厚，咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組小鼠背部皮膚輕微充血，腫脹不明顯，皮膚厚度相對于模型組均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 )；激發(fā)皮炎72 h后咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組皮膚厚度亦顯著小于模型組(P<0.05)。進一步測定各組小鼠背部皮膚腫脹度，結(jié)果顯示激發(fā)皮炎24 h和72 h后，咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組皮膚腫脹度顯著小于模型組(P<0.05)。說明咪唑斯汀能明顯抑制DNFB誘發(fā)的背部皮膚充血水腫，且效果與醋酸地塞米松相當(dāng)。見圖1、表1。

3.2咪唑斯汀對血清細(xì)胞因子水平的影響誘發(fā)皮炎24 h后，與空白對照組相比，模型組血清TNF-α、IL-12水平顯著上升(均P<0.05)，IL-4無明顯變化(P>0.05)；與模型組相比，咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組炎癥因子TNF-α、IL-12顯著降低(均P<0.05)，IL-4水平亦無明顯變化(P>0.05)。誘發(fā)皮炎72 h后，模型組TNF-α、IL-12水平雖有所下降，但仍高于空白對照組(均P<0.05)；咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組炎癥因子TNF-α、IL-12水平進一步降低，IL-4水平無明顯變化(P>0.05)。比較咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組上述相關(guān)炎癥因子水平，結(jié)果顯示均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

3.3咪唑斯汀對皮損組織細(xì)胞因子水平的影響誘發(fā)皮炎24 h后，模型組皮損組織TNF-α、IL-12水平顯著高于空白對照組(均P<0.05)，而IL-4無明顯變化(P>0.05)。與模型組相比，咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組炎癥因子TNF-α、IL-12顯著降低(均P<0.05)，IL-4水平亦無明顯變化；誘發(fā)皮炎72 h后，模型組TNF-α、IL-12水平雖有所下降，但仍高于對照組(均P<0.05)。咪唑斯汀組和醋酸地塞米松組炎癥因子TNF-α、IL-12進一步降低，IL-4水平無明顯變化(P>0.05)。見表3。

4討論

ACD是由一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的IV型變態(tài)反應(yīng)[6]，臨床表現(xiàn)為皮膚黏膜接觸致敏原后出現(xiàn)彌漫性丘疹、紅腫充血。由于其抗原大都屬于簡單化學(xué)物質(zhì)，很難避免，因此其發(fā)病十分普遍，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

對照組 模型組 咪唑斯汀組醋酸地塞米松組

圖1　藥物治療72 h后各組小鼠皮膚大體觀

注：與空白對照組比較，aP< 0.05；與模型組比較，bP< 0.05。

表2　用藥后各組小鼠血清細(xì)胞因子水平比較/ng·L-1

注：n=5，與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表3　用藥后各組小鼠皮損組織細(xì)胞因子水平比較/ng·L-1

注：n=5，與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

DNFB是一種常見的化學(xué)致敏劑，具致敏和誘發(fā)接觸性皮炎的雙重功能，廣泛應(yīng)用于接觸性皮炎動物模型的制備[7]。通常采用DNFB建立小鼠耳廓ACD模型，但小鼠耳郭無皮下脂肪層，較薄，不易對耳廓厚度和腫脹度進行精確測定[8]。本研究在傳統(tǒng)ACD模型的基礎(chǔ)上，參照馮浩等[9]的方法建立小鼠背部ACD模型，此模型既能很好的模擬ACD的病理特征，而且克服了傳統(tǒng)耳廓ACD模型的缺陷。實驗結(jié)果顯示，ACD模型組背部皮膚出現(xiàn)潮紅、充血，明顯肥厚等典型的ACD癥狀。

目前國內(nèi)外大量研究表明，Th1型和Th2型細(xì)胞均參與了ACD的免疫反應(yīng)，但ACD主要由Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)所介導(dǎo)[10-11]。TNF-α和IL-12均由Th1型細(xì)胞所分泌。在ACD的激發(fā)期，T細(xì)胞接觸抗原后TNF-α的釋放迅速增加，刺激朗格漢斯細(xì)胞遷移，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子釋放，引起皮膚炎癥反應(yīng)[12-13]。IL-12能夠促進Th1型細(xì)胞分泌IFN-γ，形成正反饋調(diào)節(jié)，增強Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答[14]。本研究結(jié)果也顯示ACD組小鼠血清及皮損組織TNF-α和IL-12水平顯著升高，而血清及皮損組織IL-4水平與對照組相比無明顯變化。此結(jié)果也表面Th1型細(xì)胞免疫在ACD中起主導(dǎo)作用。咪唑斯汀是一種強效、特異選擇性組胺H1受體拮抗劑，兼具抗炎和抗過敏的雙重功效。研究表明，咪唑斯汀通過抑制5-脂氧合酶活性來減少白三烯的產(chǎn)生，從而抑制花生四烯酸所誘導(dǎo)的皮膚炎癥反應(yīng)[15-16]。本研究結(jié)果顯示，咪唑斯汀能明顯抑制DNFB誘發(fā)的小鼠背部皮膚充血水腫，且能顯著降低血清及皮損組織中TNF-α和IL-12水平。提示咪唑斯汀對ACD的抑制作用可能與其抑制Th1型反應(yīng)有關(guān)。

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Therapeutic effect and discussion of mechanism of mizolastine on murine allergic contact dermatitis

FU Man-ni,XIE Cui-lin，SHI Nian

(DepartmentofDermatology,HuangshiCentralHospitalPu-AiBranch,theAffiliatedHospitalofHubeiPolytechnicUniversity,EdongHealthcareGroup,Huangshi435000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the efficacy of Mizolastine in the treatment of allergic contact dermatitisin (ACD) mice and its possible mechanisms.MethodsThe DNFB was applied on the dorsum of mice to produce the allergi-c contact dermatitis models.Total of forty mice were randomly divided in to nor mal control group,model group,mizolastine group,dexamethasone acetate group with 10 mice in each group.At 24 hours and 72 hours after the beginning of treatmen,central thickness and the swelling of dorsal skins were examined.The leve ls of TNF-α,IL-12,IL-4 in serum and tissue of skin lesion were determined by ELISA method.ResultsCompared with the controlgroup,the ACD group showed a significant increase in thickness and swelling degree of dorsal skin,levels of T-NF-α,IL-12 in serum and tissue of skin lesion (P<0.05).The levels of IL-4 in serum and tissue of skin lesion were not changed (P>0.05).Application of the mizolastine can effectively suppress swelling degree of dorsal skin,reduce levels of TNF-α,IL-12,but did not cause significant changes in serum levels of IL-4 in mice with ACD.ConclusionMizolastine had good th erapeutic effect on allergic contact dermatitis mode1 of mice,and the mechanism might be related to suppression of Th1 cytokine.

Key words:Dermatitis,Contact；Dermatitis,Contact；Interleukin-4；Interleukin-12；Mice

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.006

(收稿日期：2015-12-21，修回日期：2016-02-07)