竇嬌瑩，楊志偉

(1.甘肅省中醫(yī)院檢驗科，蘭州 730050;2.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學與免疫學系，銀川 750004)

·論著·

嗜肺軍團菌momp基因疫苗的制備及其免疫原性研究*

竇嬌瑩1,2，楊志偉2

(1.甘肅省中醫(yī)院檢驗科，蘭州 730050;2.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學與免疫學系，銀川 750004)

摘要:目的構建真核重組質粒GFP-momp作為核酸疫苗，已構建的原核重組質粒pET-momp表達的蛋白作為蛋白疫苗，二者聯合免疫BALB/c雌性小鼠，觀察其免疫原性。方法(1)以嗜肺軍團菌DNA作為模板，擴增得到momp基因，并克隆至pEGFP-C1載體獲得重組質粒GFP-momp。鑒定正確后，將其轉染到NIH3T3細胞，利用熒光顯微鏡觀察GFP-momp的表達。(2)選取BALB/c雌性小鼠60只,平均分為4組,即磷酸鹽緩沖液(PBS)組(A組)、空質粒pEGFP-C1組(B組)、DNA疫苗組(C組)、聯合疫苗組(D組)。以重組質粒GFP-momp作為DNA疫苗，重組質粒GFP-momp和MOMP蛋白作為聯合疫苗，第1天A組肌肉注射PBS 50 μL，B組注射pEGFP-C1 50 μg，C、D組各注射GFP-momp 50 μg；第14天各組以相同劑量追加免疫1次；第21天A、B、C組用相同劑量再追加免疫1次，D組注射10 μg純化的MOMP蛋白。借助對各試驗組小鼠的抗體水平、脾淋巴細胞增殖活性、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷活性等指標的動態(tài)檢測，來評價DNA疫苗與蛋白疫苗的免疫原性。結果擴增出831 bp的momp基因，構建重組質粒GFP-momp，轉染入NIH3T3細胞并在細胞內表達出綠色熒光蛋白。在淋巴細胞增殖試驗中：A組和B組比較差異無統計學意義(P>0.05)；C組和D組淋巴細胞增殖活性均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組高于D組，差異有統計學意義(P<0.05)。間接ELISA測定血清中抗原特異性抗體水平結果顯示，A、B兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；C、D兩組均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；D組抗體滴度高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。CTL殺傷活性試驗結果顯示，A、B兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；C、D兩組均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)； D組殺傷活性高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論成功構建momp基因的真核表達載體并在NIH3T3細胞中得到表達，并進一步得出嗜肺軍團菌momp基因誘導產生的DNA疫苗和DNA-蛋白疫苗均能產生細胞免疫和體液免疫，具有免疫原性。

關鍵詞:嗜肺軍團菌；momp基因；疫苗

軍團菌是存在于天然水和土壤中的胞內寄生菌，廣泛存在于潮濕含鐵的管道,如空調、淋浴器等與人類生活密切相關的地方,大大增加了人類與該菌的接觸概率[1]。人畜可因吸入含軍團菌的氣溶膠而感染。作為胞內寄生菌，軍團菌可借助侵入宿主的巨噬細胞來逃避吞噬體和溶酶體的殺傷作用，并在宿主細胞中生長繁殖。目前已知的軍團菌以嗜肺軍團菌(Lp)1型最為常見，它是引起社區(qū)獲得性肺炎和院內感染肺炎的重要病原菌[2]。軍團菌感染目前沒有有效的特異性預防措施，因此，研究高效的疫苗已成為現階段臨床的迫切需求。本研究利用生物及免疫信息學方法進行比對分析后發(fā)現，主要外膜蛋白(MOMP)是基因表達的相對分子質量為30×103的外膜蛋白，具有良好的免疫原性。本研究擬構建重組質粒GFP-momp作為DNA疫苗對小鼠進行免疫，已構建的重組質粒pET-momp誘導表達的重組蛋白MOMP作為蛋白疫苗，觀察該基因的免疫原性，為疫苗方面的研究奠定基礎，現報道如下。

1材料與方法

1.1菌株和質粒Lp 1型菌株由四川大學陳建平教授惠贈；重組MOMP蛋白由作者前期構建。EcoRⅠ和HindⅢ限制性內切酶購自fermentas公司；DNA 提取及純化試劑盒購于北京天根公司；質粒提取試劑盒購自 Omega 公司。試驗動物：BALB/c雌性小鼠，6～8周齡，SPF級，體質量約18 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：0239997。

1.2方法

1.2.1Lp基因組DNA的提取參考DNA提取試劑盒操作步驟進行。

1.2.2Lpmomp基因的PCR擴增根據Pub Med相關文獻的momp基因序列，設計并合成引物，分別在5′端加上EcoRⅠ和HindⅢ內切酶位點。 上游 5′-ATA ATA TAG GAA TTC GGT ACG ATG GGT CCA GTA TG-3′ ，下游 5′-CCC AAG CTT TTA GAC ATT GCC AAC ATA TTT TAA GC-3′。PCR擴增體系：基因組DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq mix 25 μL，無RNA酶水22 μL。擴增條件：95 ℃ 預變性5 min； 95 ℃ 變性30 s； 48 ℃退火45 s； 72 ℃延伸1.5 min；30 個循環(huán)； 72 ℃總延伸7 min。

1.2.3提取質粒pEGFP-C1按照質粒提取試劑盒操作步驟提取質粒pEGFP-C1。

1.2.4momp重組質粒的構建用EcoRⅠ和HindⅢ對擴增的momp基因和載體pEGFP-C1進行雙酶切，在16 ℃下進行連接，轉化于制備好的感受態(tài)細胞，均勻涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.5陽性重組克隆的篩選、鑒定將單個菌落接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)并提取質粒，用Hind Ⅲ和EcoRⅠ進行單、雙酶切鑒定。以酶切鑒定陽性的重組質粒為模板，擴增后電泳觀察。

1.2.6重組質粒序列測定取鑒定陽性的重組質粒菌體，送上海生工生物技術公司進行測序。

1.2.7轉染將鑒定正確的含重組GFP-momp、空質粒pEGFP-C1的單個菌落增菌，按試劑盒說明書提取無內毒素質粒用于轉染。同時將處于對數期的NIH3T3細胞種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔約1×106個，培養(yǎng)至細胞達板底面積80%時用于轉染。試驗分正常NIH3T3細胞組、空質粒PEGFP-C1組、重組GFP-momp組。

1.2.8重組質粒在細胞中的篩選及表達轉染48 h后用300 μg/mL的G418進行篩選，并于72 h后檢測GFP-momp在細胞中的瞬時表達。

1.2.9動物免疫取BALB/c雌性小鼠60只，平均分為4組，即PBS組(A組)、空質粒pEGFP-C1組(B組)、DNA疫苗組(C組)、聯合疫苗組(D組)。采用肌肉注射法進行免疫接種。第1周A組每只小鼠注射PBS 50 μL，B組每只注射空質粒pEGFP-C1 50 μg，C組注射重組質粒GFP-momp50 μg，D組注射重組質粒GFP-momp50 μg；第14天各組相同劑量追加免疫一次；第21天A、B、C組用相同劑量追加免疫1次，D組注射10 μg 純化的MOMP蛋白。

1.2.10用間接ELISA檢測血清中特異性抗體取免疫后第14、21、28天每組各5只小鼠，眼部采血，以純化后MOMP蛋白作為包被抗原。測定血清中抗原特異性抗體水平，并設陰性對照孔。若陽性對照孔平均OD值/陰性對照孔平均OD值大于2.1則判斷為陽性，出現陽性反應的待測血清最高稀釋度即為抗體滴度。

1.2.11檢測細胞免疫反應開始免疫后第14、21、28天，每組分別取5只小鼠，無菌條件下取出脾臟，制成細胞懸液。細胞活性大于95%以上備用。

1.2.12檢測淋巴細胞增殖活性(MTS法)調整脾淋巴細胞濃度至1×106/mL，100 μL/孔加到96孔板，分別加ConA(終濃度5 μg/mL)，并設對照孔(不加ConA)。每只小鼠3個復孔，在37 ℃,5% CO2孵箱中培養(yǎng)72 h。吸取20 μL的 CellTiter 96?Aqueous試劑到含有100 μL培養(yǎng)液的細胞中培養(yǎng)4 h。測量OD值。計算刺激指數(SI)作為淋巴細胞增殖程度的指標。SI=試驗孔OD值/對照孔OD值的均值

1.2.13細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷活性檢測(LDH法)以重組GFP-momp轉染出的陽性細胞作為檢測CTL殺傷活性的靶細胞。PBS組、空質粒組、重組GFP-momp組、GFP-momp/MOMP蛋白組小鼠脾淋巴細胞作為效應細胞。調整效應細胞與靶細胞的細胞數之比為10∶1，并設效應細胞、靶細胞對照孔及空白對照孔，均設3個平行孔。同時設靶細胞LDH自然釋放孔，靶細胞+100 μL RPMI1640；靶細胞LDH差異最大釋放孔，靶細胞+90 μL RPMI1640+10 μL裂解液；效應細胞LDH自然釋放孔，100 μLRPMI1640 的效應細胞。37 ℃孵育4 h。加入相應底物50 μL，避光孵育30 min。加50 μL終止液，測量490 nm處的OD值。

2結果

2.1重組質粒GFP-momp的PCR擴增結果用引物對重組GFP-momp進行擴增,得到約800 bp大小的產物(圖1)。

注：M為DL2000 marker;1為 PCR產物;2為陰性對照。

圖1GFP-momp基因的PCR 擴增產物

2.2GFP-momp的酶切鑒定用HindⅢ對質粒單酶切，得到5 500 bp左右的產物；用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，同一泳道出現4 700 bp和800 bp兩種產物，并與pEGFP-C1空質粒及momp基因位置相一致(圖2)。

注：M1為1kb marker；1為HindⅢ單酶切GFP-momp產物；2為 HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切GFP-momp產物；3為HindⅢ單酶切pEGFP-C1產物;4為 PCR產物；M2為DL2000 marker。

圖2重組質粒GFP-momp的酶切結果

2.3熒光顯微鏡下觀察結果在熒光顯微鏡下發(fā)現被重組質粒GFP-momp轉染的NIH3T3胞漿中有較強的綠色熒光，同一視野下可見清晰的細胞形態(tài)，證實重組質粒GFP-momp轉染成功。同時空質粒pEGFP-C1轉染的細胞和正常細胞對照組均未見綠色熒光(圖3)。

2.4小鼠體內抗原特異性抗體滴度檢測見表1。開始免疫后第14、21、28天小鼠內眥采血分離血清，采用ELISA測定血清中抗原特異性抗體水平。檢測結果顯示，A組和B組比較差異無統計學意義(P>0.05)，且A、B兩組組內分析后差異也無統計學意義(P>0.05)。C組和D組滴度大于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；D組比C組抗體水平高，差異有統計學意義(P<0.05)，且C組和D組組內分析顯示，隨免疫時間延長，抗體滴度也隨之增大，差異有統計學意義(P<0.05)。

注： a為重組質粒GFP-momp轉染的NH3T3細胞的表達(熒光)；b為重組質粒GFP-momp轉染的NH3T3細胞的表達(普光)；c為空質粒pEGFP-C1轉染的NH3T3細胞(熒光)；d為空質粒pEGFP-C1轉染的NH3T3細胞(普光)；e為正常細胞對照組(熒光)；f為正常細胞對照組(普光)。

圖3　熒光顯微鏡檢測重組質粒GFP-momp在

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.5用MTS法檢測淋巴細胞增殖活性SI值見表2。開始免疫后第14、21、28天動態(tài)檢測結果顯示，A組和B組淋巴細胞增殖活性SI值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，且A、B兩組組內分析后差異也無統計學意義(P>0.05)。C組和D組均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)； D組比C組活性高，差異有統計學意義(P<0.05)，且C組和D組組內分析顯示，隨免疫時間延長，增殖活性SI值隨之增大，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2　　4組開始免疫后第14、21、28天小鼠淋巴細胞

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.6CTL殺傷活性檢測見表3。開始免疫后第14、21、28天，檢測CTL殺傷活性，檢測結果顯示，A組和B組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，且A、B兩組組內分析后差異也無統計學意義(P>0.05)。C組和D組殺傷活性大于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；D組比C組殺傷活性高，差異有統計學意義(P<0.05)，且C組和D組組內分析顯示，隨免疫時間延長，殺傷活性也隨之增大，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3　　4組開始免疫后第14、21、28天小鼠CTL

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3討論

細菌的外膜蛋白(OMP)在細菌致病過程中起重要作用，因為其不僅可刺激體液免疫，也可刺激細胞免疫，顯示了良好的免疫原性[3]。目前，軍團菌疫苗中的DNA疫苗作為第3代疫苗已引起人們的廣泛關注，且DNA疫苗具有容易獲取，使用安全，保存容易等優(yōu)點，還可以用其他疫苗來加強免疫效果。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局批準HIV、埃博拉病毒、瘧疾等多種DNA疫苗進入臨床試驗[4]。核酸疫苗引發(fā)的免疫應答相對較弱，尤其在大動物及人體內不足以引起足夠的免疫保護效果[5]。所以研究發(fā)現了多種提高核酸疫苗免疫效果的方法，其中用一種疫苗進行初始免疫，再用另一種或多種不同類型的疫苗進行加強免疫，即Prime-Boost免疫策略通常會產生比單一疫苗更強的免疫反應，特別是能產生更強的細胞免疫應答[6]。在誘導細胞免疫應答方面有比較好的作用，并顯示了很好的應用前景。本研究將所構建的重組質粒GFP-momp作DNA疫苗及重組質粒pET-momp表達的蛋白作為蛋白疫苗，對小鼠進行免疫，檢測其體內細胞免疫、體液免疫的相關性指標，結果初步分析表明，使用不同的免疫策略，產生的免疫應答方式和強度有所不同。C、D兩組抗體滴度水平均高于A、B兩組，說明C、D兩組均能產生較好的特異性抗體；但D組抗體水平只略高于C組，這可能是因為D組與C組相比只進行了一次蛋白免疫；C、D兩組在動態(tài)監(jiān)測抗體水平的情況下，組內也有差異，推測該值隨時間增加抗體也會增加，這與Ferraz等[7]所得結果一致。然而，細胞免疫應答方面的結果卻有所不同，C、D兩組細胞免疫水平均高于A、B兩組，說明C、D兩組均能產生較好的細胞免疫；但是與C組相比較，D組細胞免疫水平明顯高于C組，分析其原因可能是因為二者采用了不同的免疫方法，前者為單一的DNA免疫，后者為Prime-Boost免疫策略；且C、D兩組組內同一時間點的數據水平也隨免疫時間增加而相應提高。以上結果與Prime-Boost策略的基本原理相符，且與Ferraz等[7]采用表達結核桿菌Apa(富含丙氨酸-脯氨酸的抗原)、Hsp 65和Hsp 70的DNA疫苗初次免疫、卡介苗加強的策略免疫小鼠及Belyakov等[8]用DNA疫苗初次免疫、重組MVA病毒加強免疫研究初次免疫-加強免疫策略結果一致。同時，張璐等[9]在DNA疫苗和蛋白疫苗聯合免疫對HIV包膜蛋白gp120體液免疫的影響中證實，DNA和蛋白疫苗共同免疫有利于提高艾滋病疫苗誘導的抗體反應水平。另外，其他一些研究小組結果也顯示Prime-Boost策略可以明顯提高疫苗的保護效果[10-11]。 Lp作為一種胞內寄生菌，其感染機體后產生的免疫應答主要是細胞免疫，結果顯示Prime-Boost策略能產生較好的細胞免疫應答，有助于胞內菌的預防。

本研究結果表明，以Prime-Boost免疫策略為依據的DNA疫苗初次免疫，蛋白疫苗加強免疫的方法使Lp感染后的抗體水平有所提高，對淋巴細胞增殖活性和CTL殺傷活性也明顯提高。

因此，momp基因制備的DNA疫苗對小鼠有免疫原性，為Lp有效疫苗的研究提供了理論依據及應用價值。

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Preparation and immunogenicity ofmompgene vaccine of Legionella Pneumophilia*

DOUJiaoying1,2,YANGZhiwei2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ChineseTraditionalChineseMedicineofGansu,Lanzhou730050,China; 2.DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,SchoolofBasicMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the immunogenicity of the DNA vaccine induced by eukaryotic recombinant plasmid GFP-momp combined with protein vaccine induced by prokaryotic recombinant plasmid pET-momp in BALB/c female mice immunized intramuscularly.MethodsThe MOMP gene amplified from DNA of Legionella pneumophila by PCR were cloned into pEGFP-C1 vector,which produced the recombinant plasmid named as GFP-momp.GFP-momp was analyzed with restriction endonuclease digestion,PCR and DNA sequencing techniques.The NIH3T3 cell was transfected by recombinant plasmid GFP-momp through lipofection.The stable expression products of MOMP were observed by the fluorescent microscope.Sixty BALB/c female mice were divided into 4 groups averagely,the PBS control group (A group),the plasmid pEGFP-C1 control group (B group),DNA vaccine experimental group (C group) and the combination vaccine experimental group (D group).By recombinant plasmid the GFP-momp combined with MOMP protein,mice of group A were given intramuscular injection PBS 50 μL and mice of group B were injected with pEGFP-C1 50μg.In addition,mice of group C and D were injected GFP-momp 50 μg in the first day.Each group injected the same dose immunization once in the fourteenth day.Then mice of group A,B and C were injected with the same dose of an additional immunization and in the twenty-first day and that of the group D were injected with 10 μg purified MOMP protein.Then antibody levels,lymphocyte proliferation activity and CTL killing activity were tested to evaluate the immunogenicity of DNA vaccines and combined vaccine.Results831 bp momp gene was amplified.Under the fluorescent microscope,green fluorescent was observed in the cell cytoplasm.In the lymphocyte proliferation test,there was no significant difference between group A and B (P>0.05).Proliferative activity of group C and D were significantly higher than that of group B (P<0.05).And proliferative activity of group C was significantly higher than that of group D (P<0.05).The indirect ELISA results showed that antigen-specific levels of serum antibody in A Group and B Group had no significant difference (P<0.05).And the levels of serum antigen-specific antibody of group C and D were significantly higher than that of group B (P<0.05).Antibody titer of group D was significantly higher than that of group C (P<0.05).CTL killing activity experiments showed that there was no significant difference between group A and B (P>0.05).The activity of group C and D were significantly higher than that of group B (P<0.05) and the activity of group D was also significantly than that of group C (P<0.05).ConclusionThe recombinant plasmid GFP-momp is constructed and expressed successfully in the NIH3T3 cells.DNA vaccine and DNA protein vaccine induced by Legionella pneumophila bacteria momp gene have immunogenicity which can generate cellular and humoral immune responses.

Key words:Legionella pneumophila;momp gene;vaccine

* 基金項目：國家自然科學基金資助項目(30860264)。

作者簡介：竇嬌瑩，女，技師，主要從事微生物與免疫學檢驗研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.001

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1449-04

(收稿日期：2016-01-28修回日期：2016-03-22)