林珊珊　朱波　付高勇

(宜賓市第一人民醫(yī)院　1. 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，2. 血管外科，四川 宜賓 644000)

·論著·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)*

林珊珊1朱波2付高勇1

(宜賓市第一人民醫(yī)院1. 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，2. 血管外科，四川 宜賓 644000)

【摘要】目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)條件培養(yǎng)液 (CM)對(duì)氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。方法采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁法分離SD大鼠BMSC，采用流式細(xì)胞術(shù)，成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定BMSC，提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液。制作過氧化氫損傷PC12細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2損傷組以及共培養(yǎng)組。MTT檢測(cè)BMSC-CM對(duì)損傷PC12細(xì)胞活性的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡率的變化，免疫印跡法分別檢測(cè)硫氧還蛋白(Trx)、B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)水平的變化。結(jié)果分離提取的BMSC高表達(dá)CD29，CD44，不表達(dá)CD31，CD45。BMSC-CM能提高H2O2損傷PCI2細(xì)胞的活力，使細(xì)胞凋亡率下降，Trx和Bcl-2的蛋白量增加，Bax蛋白水平下降。結(jié)論BMSC-CM通過提高受損細(xì)胞內(nèi)Trx、Bcl-2水平，降低Bax蛋白水平，一定程度上抑制了過氧化氫致PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；條件培養(yǎng)液；過氧化氫；PC12細(xì)胞；氧化應(yīng)激

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是一類慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病的總稱，包括阿爾茨海默病(AD)、小腦萎縮癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、帕金森氏病(PD)、多發(fā)性硬化(MS)、亨廷頓病(HD)等，此類疾病的病因及其機(jī)制目前尚未完全闡明。但近年研究表明，氧化應(yīng)激損傷在阿爾茨海默病及多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用，可導(dǎo)致神經(jīng)元胞膜的破壞、通透性增加，進(jìn)而引起Ca2+大量涌入胞內(nèi)，激活細(xì)胞內(nèi)鈣依賴性激酶、促進(jìn)自由基的產(chǎn)生，造成生物分子物質(zhì)氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚或死亡[1]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NGF、BDNF、bFGF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)因子可通過不同的機(jī)制起著神經(jīng)保護(hù)的作用，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)組織與細(xì)胞損傷修復(fù)及功能改善[2-4]。近年研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞移植可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的損傷修復(fù)以及功能的改善[5-8]。但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植人體后，由于多種不利因素的影響，細(xì)胞很快發(fā)生死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮治療作用更有可能與其分泌的細(xì)胞因子有關(guān)[9, 10]。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)、純化BMSCs并收集其條件培養(yǎng)液，觀察BMSCs分泌物對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的PCI2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用?？蔀樯窠?jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療提供新的解決方案。

1材料和方法

1.1主要材料PC12細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供。2周齡SD大鼠(雌雄不限)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，F(xiàn)icoll-hypague(天津血液學(xué)研究所提供)，馬血清(Gibco公司)，胎牛血清(HyClone公司)， MTT (Sigma公司)，地塞米松、1-甲基-3異丁基-黃嘌呤和吲哚美辛(美國(guó)Sigma 公司)，β-甘油磷酸鈉鹽和維生素C (美國(guó)Fluka 公司)抗鼠CD29、CD31、CD44、CD45抗體(PharMingen公司)，Bcl-2、Bax抗體、兔抗Trx (美國(guó)Cell Signaling公司)、GAPDH小鼠抗大鼠多克隆抗體、兔抗小鼠抗體、羊抗兔抗體(英國(guó)Abcam公司) 、凱基AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物)。

1.2BMSCs分離與培養(yǎng)SD大鼠脫臼處死，75%酒精浸泡5min，無菌條件下取出大鼠脛骨和股骨，用含10%血清的 a-MEM 培養(yǎng)基沖洗髓腔，采用密度梯度離心法分離獲取單個(gè)核細(xì)胞，接種于含 10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液中，接種密度為1×106cells/cm2，將細(xì)胞置于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)，48h后半量換液，4d后全量換液以去除未貼壁細(xì)胞，以后每2天換液一次。待細(xì)胞克隆團(tuán)生長(zhǎng)至80～90%融合時(shí)，用0.05%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

第三代 BMSCs生長(zhǎng)融合至 70～80%，PBS洗滌兩遍后用 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置體積分?jǐn)?shù) 1%O2、5%CO2、94% N2孵箱條件培養(yǎng)，培養(yǎng) 12h 后收上清，2 000 r/min 離心 10 min 棄去細(xì)胞碎片，將獲取的 BMSCs 條件培養(yǎng)基-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定收獲大鼠BMSCs，PBS洗滌2次后，每管5×105個(gè)細(xì)胞，分別加入FITC/PE標(biāo)記的抗鼠單克隆抗體CD29、CD31、CD44、CD45，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌兩次，將洗滌后的細(xì)胞懸于300μL PBS 中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀收集數(shù)據(jù)(BD公司FACSCALIBUR型)，WinMDI2.9軟件分析結(jié)果。

體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞按2×104/孔接種于24孔板中，待細(xì)胞60～70%融合時(shí)，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含胎牛血清10%，1-甲基-3異丁基-黃嘌呤0.5μM，地塞米松10-6M，吲哚美辛10-4M，胰島素10ng/ml)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含胎牛血清10%，地塞米松10-7M，維生素C 50 μM，β甘油磷酸鈉10 mM)，每3天更換一次。約2周后，分別使用油紅O和堿性磷酸酶染色，以鑒定成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。

1.4PC12細(xì)胞培養(yǎng)及H2O2損傷模型的建立PCI2細(xì)胞用含有5%胎牛血清、10%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞增殖至80%時(shí)進(jìn)行傳代接種。實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)液更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，以終止血清對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。12h后再次換液，加入含有終濃度為200μmmol/L H2O2的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)0，6h，12h，24h，加入 20 μL MTT，繼續(xù)孵育 4 h，棄去上清，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL 溶解結(jié)晶。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm 時(shí)的吸光度 A 值。每組均設(shè) 6 個(gè)副孔，取平均值計(jì)算細(xì)胞的抑制率。觀察H2O2作用不同時(shí)間對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響，建立損傷模型。

1.5BMSC-CM 對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用將正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞進(jìn)行傳代接種，實(shí)驗(yàn)分為正常培養(yǎng)組 (DMEM)、模型組 (DMEM+0.2 mmol/L H2O2)、MSC-CM 組(MSC-CM+0.2 mmol/L H2O2)，每組6個(gè)副孔。正常培養(yǎng) 2 d，無血清培養(yǎng) 12 h 后，換各組培養(yǎng)液作用12h，MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活性。收集各組細(xì)胞，AnnexinV-PI 凋亡試劑盒說明檢測(cè)凋亡率。

1.6免疫印跡分析將各組培養(yǎng)瓶中細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的D-Hank′s液洗3遍，RIPA裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度，取40μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉2h。兔抗Trx，鼠抗Bcl-2抗體、Bax抗體或GAPDH抗體4℃孵育過夜。經(jīng)洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗小鼠二抗，室溫反應(yīng)2 h，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯示結(jié)果，并曝光于膠片上。

2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3結(jié)果

3.1BMSCs培養(yǎng)與鑒定分離培養(yǎng)的BMSC流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示高表達(dá)CD29，CD44，不表達(dá)或低表達(dá)CD31，CD45(圖1A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所獲取的BMSC得到高度純化。通過誘導(dǎo)可以分化脂肪細(xì)胞(圖1B)成骨細(xì)胞(圖1C)。符合國(guó)際干細(xì)胞協(xié)會(huì)關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

圖1BMSC鑒定。圖A：流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果；圖B：BMSC成脂分化；圖C：BMSC成骨分化

Figure 1Identification of BMSCs

3.2H2O2對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響將終濃度為200μmmol/LH2O2作用于PC12細(xì)胞0，6，12，24h后，采用MTT法檢測(cè)H2O2對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明，隨著作用時(shí)間的增加，PC12細(xì)胞活性逐漸下降，各組細(xì)胞活性分別為100.00±1.98%(Con)，89.53±4.67%(6h)，74.26±3.19%(12h)，65.68±4.09%(24h)。培養(yǎng)12h和24h后，H2O2損傷組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05 vs. Con)，見圖2。

圖2H2O2作用不同時(shí)間后對(duì) PC12細(xì)胞活性的影響

Figure 2Effects of H2O2on the cell viability of PC12 cells

3.3BMSC-CM對(duì)損傷細(xì)胞活性的影響MTT結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)，共培養(yǎng)組細(xì)胞活性與H2O2組相比顯著增加，各組細(xì)胞活性分別為100.00±1.59%(Con)，73.09±5.13%(H2O2)，87.91±5.29%(H2O2+CM)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05 vs. control;P<0.05 vs. H2O2)，見圖3 。

圖3BMSC-CM對(duì)H2O2損傷細(xì)胞的保護(hù)作用

Figure 3Effects of BMSC-CM on cell viability of H2O2-injured PC12 cells

3.4BMSC-CM對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)。BMSC-CM共培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率與損傷組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組細(xì)胞凋亡率分別為3.52±1.79%(Con)，30.47±4.38%(H2O2)，19.58±3.81%(H2O2+CM)(P<0.05 vs. Control;P<0.05 vs. H2O2)，見圖4。

圖4BMSC-CM影響PC12細(xì)胞凋亡的結(jié)果分析

Figure 4Protection of BMSC-CM against apoptosis of PC12 cells

3.5BMSC-CM對(duì)Trx、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組PCI2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Trx蛋白兩者均升高，Bax蛋白水平有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖5BMSC-CM對(duì)損傷PC12細(xì)胞Trx、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

Figure 5Western blot analysis of the effects of BMSC-CM on Trx, Bax and Bcl-2 levels in PC12 cells

4討論

氧化應(yīng)激在多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有中心調(diào)節(jié)作用，是神經(jīng)退行性疾病中引起細(xì)胞損傷的一個(gè)主要原因。氧化應(yīng)激可以引起細(xì)胞成分的破壞，繼而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷、凋亡或者壞死[1,11]。H2O2是一類活性氧，可以與胞膜及胞內(nèi)物質(zhì)反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的氧自由基，造成細(xì)胞損傷，因而，在氧化應(yīng)激損傷的體外研究中，H2O2被廣泛用作氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑[12]。PC12細(xì)胞，為大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株，由于其具有類似神經(jīng)細(xì)胞的特性，而被廣泛應(yīng)用于體外神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型[13]。

作為一種新興的細(xì)胞學(xué)治療方法，干細(xì)胞移植在基礎(chǔ)與臨床實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)對(duì)組織損傷及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病具有治療作用，但具體機(jī)制并未完全清楚。近來研究表明，移植入體內(nèi)的BMSCs，由于缺血缺氧、PH、炎癥以及凋亡因子等惡劣移植環(huán)境的影響，在短期內(nèi)即發(fā)生大量死亡，因此，移植細(xì)胞多向分化、替代損傷學(xué)說受到質(zhì)疑[9]?，F(xiàn)普遍認(rèn)為BMSCs 的旁分泌作用可能是發(fā)揮損傷修復(fù)作用的主要機(jī)制[9, 14]。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中含有多種與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、組織修復(fù)、血管生成及抗凋亡等作用相關(guān)的生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，抑制細(xì)胞的凋亡和壞死，提高細(xì)胞生存的作用[15,16]。

我們利用200μmmol/L H2O2作用于PC12細(xì)胞不同時(shí)間，觀察其對(duì)細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2作用時(shí)間的增加，PC12細(xì)胞的活性有所下降，結(jié)果說明H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷與凋亡。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選用200μmmol/L H2O2作用12h作為損傷模型組。通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與損傷組相比，BMSC-CM與H2O2損傷細(xì)胞共培養(yǎng)后，可顯著提高損傷細(xì)胞的活性，降低細(xì)胞凋亡率。提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液可明顯減輕H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的損傷及凋亡誘導(dǎo)作用。

Trx是一類多功能蛋白，缺氧/復(fù)氧能誘導(dǎo)其產(chǎn)生，從而保護(hù)各類氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞，此外Trx還能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制其凋亡并調(diào)節(jié)各種炎癥反應(yīng)。Trx對(duì)維持體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)有重要的作用，通過結(jié)合抑制凋亡信號(hào)途徑的多種激酶而起到抗凋亡作用[17]。Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，其家族成員可分為抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-XL，以及促凋亡蛋白如Bax、Bad等[18]。兩類蛋白相互作用發(fā)揮對(duì)凋亡的調(diào)控作用，二者之間的比率失調(diào)，便會(huì)影響細(xì)胞的活性或凋亡。本研究中，BMSC-CM與H2O2損傷PC12細(xì)胞共培養(yǎng)后，Trx和Bcl-2蛋白水平較損傷組增加，而Bax蛋白表達(dá)水平較損傷組下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，BMSC-CM可能通過上調(diào)Trx蛋白發(fā)揮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PCI2細(xì)胞的抗氧化和抗凋亡作用。而Trx的抗凋亡作用可能與上調(diào)Bcl-2蛋白水平有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

5結(jié)論

氧化應(yīng)激是引起神經(jīng)細(xì)胞損傷、凋亡或者壞死的重要原因之一。本研究通過將BMSC-CM與H2O2損傷PCI2細(xì)胞共培養(yǎng)，一定程度上證實(shí)了BMSC-CM通過提高受損細(xì)胞內(nèi)Trx、Bcl-2水平，降低Bax蛋白水平發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和凋亡的作用。為進(jìn)一步研究BMSC-CM抗氧化及凋亡的作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells conditioned medium on protection of hydrogen peroxide injured PC12 cells

Lin Shanshan, Zhu Bo, Fu Gaoyong

(DepartmentofRehabilitationMedicine,TheFirstPeople′sHospitalofYibin,Yibin644000，Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the impact of bone marrow mesenchymal stem cells conditioned medium (BMSC-CM) on the oxidative stress and apoptosis of PC12 cells induced by hydrogen peroxide. MethodsBMSCs were isolated and purified with density-gradient centrifugation method. The surface markers of BMSCs reacted against different antibodies were collected and detected by flow cytometry. Experiment was divided into three groups including control group, H2O2-injured group and co-culture group. MTT test was used to evaluate the cell viability of PC12 cells and AnnexinV-FITC detecting kits were used to detect the apoptosis of PC12 cells. The expression level of Trx, Bcl-2 and Bax protein in PC12 cells were detected by Western Blot. ResultsBMSCs isolated from rat bone marrow were highly positive for CD29, CD44 and negative for CD31, and CD45. BMSC-CM increased cell viability of H2O2-injured PC12 cells, decreased Annexin-V/PI staining positive cells. The expressions of Trx and Bcl-2 protein were significantly increased, and the Bax protein level was decreased compared with the other two groups. ConclusionBMSC-CM could inhibit the oxidative stress and apoptosis in PC12 cells, which could be related to the up-regulation of Trx and Bcl-2 protein expression and decrease of the level of Bax protein.

【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Conditioned medium; Hydrogen peroxide; PC12 cells; Oxidative stress

基金項(xiàng)目：宜賓市科技計(jì)劃項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助(2014SF009)

通訊作者：付高勇，E-mail: 527121032@qq.com

【中圖分類號(hào)】R 446.8

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.010

(收稿日期：2015-08-04; 編輯： 張文秀)