袁芳　武艷強(qiáng)　袁靜　朱琳　侯愛軍　張維

(1.邯鄲市中心醫(yī)院心內(nèi)4科， 河北 邯鄲 056001;2.武安市第一人民醫(yī)院， 河北 武安 056300;3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 成都 四川 610500)

·論著·

低氧環(huán)境下厄貝沙坦通過調(diào)控HIF-1α對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

袁芳1武艷強(qiáng)1袁靜2朱琳1侯愛軍1張維3

(1.邯鄲市中心醫(yī)院心內(nèi)4科， 河北 邯鄲 056001;2.武安市第一人民醫(yī)院， 河北 武安 056300;3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 成都 四川 610500)

【摘要】目的探討厄貝沙坦(irbesartan)對于低氧誘導(dǎo)的大鼠H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及相關(guān)的分子機(jī)制。方法將大鼠H9C2心肌細(xì)胞分為3組，分別為常氧組(Normoxia組)、低氧+厄貝沙坦組(Hypoxia+Irbesartan組)和低氧組(Hypoxia組)。在低氧環(huán)境下對H9C2心肌細(xì)胞使用10μmol/L厄貝沙坦進(jìn)行干預(yù)。在干預(yù)24h后，使用qPCR法和western blotting法對H9C2心肌細(xì)胞iNOS、HIF-1α和Bax的mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測。結(jié)果在低氧環(huán)境干預(yù)24h后H9C2心肌細(xì)胞iNOS、HIF-1α和Bax mRNA和蛋白表達(dá)較常氧環(huán)境下顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；但低氧+厄貝沙坦組H9C2心肌細(xì)胞iNOS、HIF-1α和Bax mRNA和蛋白的表達(dá)水平較低氧組細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論該基礎(chǔ)研究提示厄貝沙坦(irbesartan)可能可以通過下調(diào)iNOS的合成和抑制Bax的表達(dá)對低氧誘導(dǎo)的大鼠H9C2心肌細(xì)胞損傷和凋亡產(chǎn)生保護(hù)作用，同時(shí)該機(jī)制可能與調(diào)控HIF-1α的表達(dá)密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】厄貝沙坦；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；Bax；H9C2心肌細(xì)胞

減輕和抑制缺血缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷(injury)和凋亡(apoptosis)，是心臟大手術(shù)(如瓣膜置換和冠脈搭橋手術(shù)以及心肌梗塞等)患者預(yù)后質(zhì)量的關(guān)鍵性問題[1-4]。血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(angiotensin-Ⅱ receptor blocker, ARB)目前已廣泛應(yīng)用于心臟疾病(如原發(fā)性高血壓和冠狀動脈硬化性心臟病等)的臨床治療。近年有多個(gè)研究證實(shí)ARB類藥物存在獨(dú)立于抑制血管緊張素系統(tǒng)作用以外的包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制炎癥反應(yīng)、抑制器官纖維化以及抑制氧化應(yīng)激和抑制凋亡等多種藥理學(xué)活性[5-10]。同時(shí)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)ARB的部分生物活性來源于對于缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的調(diào)控作用[11]。在組織器官缺血缺氧狀態(tài)下HIF-1α的過度表達(dá)是誘導(dǎo)大量炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激產(chǎn)物大量釋放的重要原因之一[12, 13]。研究表明下調(diào)HIF-1α的合成和表達(dá)對于缺氧狀態(tài)下的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[14]。該基礎(chǔ)研究的目的是探索在低氧狀態(tài)下血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑厄貝沙坦對于大鼠H9C2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料RNA提取試劑盒購買于美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自日本TaKaRa株式會社；兔抗鼠iNOS抗體、兔抗鼠Bax抗體、兔抗鼠HIF-1α抗體和兔抗鼠β-actin抗體均購于美國Santa Cruz公司；厄貝沙坦購買于美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司；小牛血清購買于澳大利亞Gibco公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)大鼠H9C2心肌細(xì)胞常規(guī)接種在含15%胎牛血清，100g/L青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2，孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每72h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。H9C2心肌細(xì)胞分為分別為常氧組(Normoxia組)、低氧+厄貝沙坦組(Hypoxia+Irbesartan組)和低氧組(Hypoxia組)，共3組。其中常氧組和低氧組細(xì)胞加入PBS，低氧+厄貝沙坦組加入溶于0.5% DMSO終濃度為10μmol/L的厄貝沙坦溶液，而后將低氧組和低氧+厄貝沙坦組細(xì)胞移置于低氧環(huán)境(1%O2、5%CO2和94% N2)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞iNOS、Bax和HIF-1α mRNA表達(dá)檢測干預(yù)24h后，按照RT-PCR試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。引物：iNOS正義5′-ACAC CGA TTCC ACTCAACTA-3′，反義5′-ACCAC CTGTTAG TTCAA GCC-3′；HIF-1α正義 5′-CCTACTATG TCGCTTTC TTGG-3′，反義5′-GTTTCTG CTGCC TTGTA TGGG-3′；Bax正義 5′- AGGGTGGCTGGGAAGGC-3′，反義5′- TGAGCGAGGCGGTGAGG-3′；β-actin正義：5′-CGGTCA GGTCATC ACTATCG-3′，反義：5′-TTCCAT ACCCAG GAAGGAAG-3′。按照試劑盒說明書介紹進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。使用2-ΔΔCt法對iNOS和HIF-1α mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測定，ΔΔCt=(Ct,目標(biāo)-Ct,β-actin)干預(yù)組-(Ct,目標(biāo)-Ct,β-actin)對照組[15]。

1.4Western blot法檢測細(xì)胞中iNOS、Bax和HIF-1α蛋白表達(dá)干預(yù)24h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗鼠抗體iNOS (1∶800)、兔抗鼠抗體Bax (1∶1000)兔抗鼠抗體HIF-1α (1∶900)和兔抗鼠抗體β-actin (1∶1200)，4°C孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)在干預(yù)24h后，低氧環(huán)境下大鼠H9C2心肌細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白表達(dá)較常氧環(huán)境下顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；同時(shí)與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白表達(dá)相對較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表1、圖1。

2.2HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)在干預(yù)24h后，低氧環(huán)境下大鼠H9C2心肌細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)較常氧環(huán)境下明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；同時(shí)與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)相對較低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1和圖1。

2.3Bax mRNA和蛋白的表達(dá)在干預(yù)24h后，低氧環(huán)境下大鼠H9C2心肌細(xì)胞Bax mRNA和蛋白表達(dá)較常氧環(huán)境下顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；同時(shí)與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細(xì)胞Bax mRNA和蛋白表達(dá)相對較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2、圖2。

表1　大鼠H9C2心肌細(xì)胞iNOS和HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)

注：與常氧組相比較①P<0.05，②與低氧組相比較P<0.05。

圖1大鼠H9C2心肌細(xì)胞iNOS和HIF-1α表達(dá)的western blot結(jié)果

Figure 1Western blot results of iNOS and HIF-1α in rat H9C2 cardiomyocytes

表2　大鼠H9C2心肌細(xì)胞Bax mRNA和蛋白的表達(dá)

注：與常氧組相比較①P<0.05，與低氧組相比較②P<0.05

圖2大鼠H9C2心肌細(xì)胞Bax表達(dá)的western blot結(jié)果

Figure 2Western blot results of Bax in rat H9C2 cardiomyocytes

3討論

血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(angiotensin-Ⅱ receptor blocker, ARB)作為一種有效而安全的降壓藥物已廣泛應(yīng)用于原發(fā)性高血壓和冠狀動脈性心臟病等疾病的臨床治療。ARB類藥物如厄貝沙坦、替米沙坦和頡沙坦等還具有抑制腫瘤、抑制炎癥反應(yīng)和緩解器官纖維化的藥理作用[5-7]。

研究顯示ARB的藥理作用與調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1)密切相關(guān)[11]。HIF-1在細(xì)胞對低氧狀態(tài)反應(yīng)過程中扮演著重要的角色[6-11]。HIF-1是一種由HIF-1α和HIF-1β亞基構(gòu)成的異二聚體，在常氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α通過E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligases)作用導(dǎo)致持續(xù)的泛素化降解而使細(xì)胞內(nèi)HIF-1α含量很低，但低氧環(huán)境可以直接抑制E3泛素蛋白連接酶的活性而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的含量明顯增加，最終形成HIF-1α/HIF-1β異二聚體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6-11]。目前發(fā)現(xiàn)大量的炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激分子(如iNOS等)基因啟動子部位存在HIF-1的結(jié)合部位，表明HIF-1對于這些基因的表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄水平和心肌細(xì)胞凋亡具有重要的調(diào)控作用[16-18]。

大量研究顯示缺血缺氧狀態(tài)下的心肌細(xì)胞保護(hù)對于心臟大手術(shù)和冠心病患者的預(yù)后極其重要重要[6-10]。缺氧狀態(tài)可直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體功能障礙，誘導(dǎo)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、凋亡甚至死亡[17, 18]。Shyu KG等的研究顯示在主動脈-腔靜脈分流術(shù)(aorta-caval shunt)模型誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭動物模型中腎上腺素β受體阻斷劑卡維地洛可以有效改善大鼠的心臟功能，并認(rèn)為該過程與抑制HIF-1α的合成下調(diào)VEGF和BNP的表達(dá)密切相關(guān)[17]。部分研究表明不適宜的或過度的低氧刺激可致使心肌細(xì)胞凋亡[18]。由于iNOS的過度表達(dá)可直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的損傷，在低氧狀態(tài)時(shí)iNOS的表達(dá)主要受到HIF-1的調(diào)控[19, 20]。在本研究中我們使用qPCR和western blotting法對大鼠H9C2心肌細(xì)胞iNOS和Bax mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)在干預(yù)24小時(shí)后，低氧環(huán)境下大鼠H9C2心肌細(xì)胞iNOS 和Bax mRNA和蛋白表達(dá)較常氧環(huán)境下顯著上升(P均<0.05)；同時(shí)與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細(xì)胞iNOS和Bax mRNA和蛋白表達(dá)相對較低(P均<0.05)。該結(jié)果表明在低氧狀態(tài)下厄貝沙坦可以有效抑制H9C2心肌細(xì)胞iNOS和Bax的表達(dá)，緩解異常的應(yīng)激反應(yīng)和凋亡過程。

同時(shí)我們進(jìn)一步對HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)在干預(yù)24小時(shí)后，低氧環(huán)境下大鼠H9C2心肌細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)較常氧環(huán)境下明顯上升 (P均<0.05)；同時(shí)與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)相對較低(P均<0.05)。該結(jié)果表明在厄貝沙坦可以有效下調(diào)低氧誘導(dǎo)的HIF-1α的合成。

4結(jié)論

以上結(jié)果提示血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑厄貝沙坦(irbesartan)可能可以通過調(diào)控HIF-1α抑制低氧誘導(dǎo)狀態(tài)下大鼠H9C2心肌細(xì)胞iNOS的合成以及Bax的表達(dá)，對心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)揭示相關(guān)的信號通路和分子機(jī)制。

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Irbesartan protects hypoxia-induced cardiomyocytes injury through mediation of HIF-1α in vitro

YUAN Fang1, WU Yanqiang1, YUAN Jing2,et al

(1.TheFourthDepartmentofCardiology,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China; 2.TheFirstHospitalofWu’an,Handan056300,Hebei,China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610500,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the protective role of angiotensin-II receptor blocker (ARB) irbesartan on hypoxia-induced cardiomyocytes injury in rat H9C2 cardiomyocytes, and its underlying mechanism. MethodsRat H9C2 cardiomyocytes were divided into 3 groups, including Control group, Hypoxia+Irbesartan and Hypoxia group. After 24h interventions, qPCR was performed to analyze the mRNA expression of iNOS, Bax and HIF-1α. Meanwhile, Western blotting was used to observe the protein expression of iNOS, Bax and HIF-1α. ResultsAfter 24h hypoxia stimulation, the mRNA and protein expressions of iNOS, Bax and HIF-1α were significantly increased. Moreover, hypoxia-induced the up-regulation of iNOS, Bax and HIF-1α was largely inhibited by irbesartan in rat H9C2 cardiomyocytes. Conclusion In current study, our data indicated that hypoxia-induced rat H9C2 cardiomyocytes injury can be attenuated by angiotensin-II receptor blocker (ARB) irbesartan, involving inhibition of HIF-1α signaling pathway.

【Key words】Irbesartan; Hypoxia-inducible factor-1α; Inducible nitric oxide synthase; Bax; H9C2 cardiomyocytes

基金項(xiàng)目：四川省教育廳課題(11ZB172)

【中圖分類號】R 542.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.009

(收稿日期：2015-09-17； 編輯： 張文秀)