王香莉鄭天送賈妮娜肖晉美高虹張繼萍張桓虎

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活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中CD11c+髓樣樹突狀細胞頻數(shù)和細胞表型的變化

王香莉1鄭天送1賈妮娜2肖晉美2高虹2張繼萍3張桓虎2

【摘要】目的 探討活動期潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者外周血中CD11c+髓樣樹突狀細胞（mDC）頻數(shù)和細胞表型的變化，以及與患者臨床嚴重程度的關(guān)系。方法 流式細胞儀檢測外周血中CD11c+mDC占外周血單個核細胞（PBMC）的比率；磁珠分選方法分離純化CD11c+mDC，流式細胞儀檢測CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達率。結(jié)果 與健康對照組比較，活動期UC患者外周血中CD11c+mDC 占PBMC的比率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義[（0．31%±0．40%）vs．（0．78%±0．40%），P＜0．05]；患者組不同臨床嚴重程度CD11c+mDC頻數(shù)存在差異；新鮮分離的CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達較低，但患者組CD80和CD86的表達均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義[（6．83%±3．22%） vs．（2．50%±1．23%），（43．95%±16．42% ）vs． （17．22%±7．53%），P＜0．05]。結(jié)論 活動期UC患者外周血中CD11c+mDC頻數(shù)降低，但CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達率并未嚴重受損；活動期UC患者外周血中CD11c+mDC頻數(shù)降低可能與患者臨床嚴重程度相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】潰瘍性結(jié)腸炎；活動期；CD11c+髓樣樹突狀細胞；頻數(shù)；細胞表型

作者單位：1 030001太原，山西醫(yī)科大學；2 030001太原，山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院肝病科；3 030001太原，山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院科技處

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種多因素的腸道疾病，表現(xiàn)為慢性非特異性。免疫應答異常和免疫調(diào)節(jié)失衡是導致UC發(fā)病的重要原因。UC免疫反應中主要的免疫細胞有T細胞和將其活化的抗原遞呈細胞。樹突狀細胞（dendritic cells，DC）作為人體內(nèi)功能最強并且是唯一能夠活化初始型T細胞的抗原遞呈細胞，在其中發(fā)揮著重要的聯(lián)絡作用。外周血中至少存在兩類不同亞型DC，對其進行分選研究將有助于進一步闡明各自在機體免疫中的不同作用。對CD11c+髓樣樹突狀細胞（myeloid dendritic cells，mDC）頻數(shù)、細胞表面共刺激分子的表達和功能特點進行研究可以幫助我們認識其在UC發(fā)病中的作用機制，也可能為今后尋找治療UC新方法提供依據(jù)。本研究主要對活動期UC患者外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率及細胞表型進行檢測，并分析其與患者臨床嚴重程度的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 資料

收集2014年7月～2015年10月山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內(nèi)科住院及門診活動期UC患者40例，設(shè)為UC患者組，所有患者診斷符合2012年我國中華醫(yī)學會消化病學分會炎癥性腸病診斷與治療的共識意見標準，并且有完整的結(jié)腸鏡及病理學診斷資料。排除合并其他重要器官嚴重疾病患者、腫瘤患者、妊娠期及哺乳期患者。所有患者未用過或復發(fā)前6個月未用過可能影響機體免疫功能的相關(guān)藥物，包括水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。收集同期30例健康體檢者作為健康對照組，性別、年齡與UC患者組相匹配，差異無統(tǒng)計學意義，見表1。所有患者及健康體檢者血液采集均經(jīng)本人知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。淋巴細胞分離液為天津灝洋生物制品科技有限責任公司產(chǎn)品；異硫氰酸（FITC）標記鼠抗人Lineage（包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56）單克隆抗體及同型對照鼠IgG1購自晶美公司；藻紅蛋白（PE）標記鼠抗人CD11c 單克隆抗體、別藻藍蛋白（APC）標記鼠抗人HLA-DR單克隆抗體、FITC標記鼠抗人CD80單克隆抗體、PE標記鼠抗人CD86單克隆抗體及同型對照鼠IgG2a /IgGb均由eBioscience公司生產(chǎn)；BDCA-1樹突狀細胞分離試劑盒購自德國美天妮公司；美國BD公司產(chǎn)流式細胞儀，F(xiàn)ACS Calibur。

表1 兩組一般資料比較[n，（±s）]

表1 兩組一般資料比較[n，（±s）]

注：兩組比較，P＞0.05

組別 　　例數(shù) 　　性別（男/女） 　　年齡（歲）UC患者組 　40 　19/21 　36.4±14.2健康對照組 　30 　15/15 　37.8±13.6

1.2 方法

1.2.1 PBMC分離 將肝素抗凝新鮮外周血2 ml緩慢加至淋巴細胞分離液液面上（注意不要使血液混入分離液），置于水平式離心機內(nèi)以1 500 r/min離心30 min，吸取環(huán)狀乳白色細胞層，獲取PBMC。

1.2.2 外周血中CD11c+mDC頻率檢測 上述方法分離獲得的PBMC用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，100 μl PBS懸浮細胞，加入FITC標記鼠抗人Lineage（包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56）mAb，PE標記鼠抗人CD11c mAb，APC標記鼠抗人HLA-DR mAb各10 μl，同時設(shè)同型對照，室溫避光孵育30 min，置于水平式離心機內(nèi)以1 500 r/min離心5 min，4%多聚甲醛固定，上流式細胞儀檢測。先圈出Lineage陰性，再圈出CD11c 和HLA-DR雙陽性的細胞即為mDC。

1.2.3 外周血中CD11c+mDC的分離 PBMC行細胞計數(shù)，300 μl PBS懸浮細胞，加入100 μl FcR-阻斷劑混勻，再加入100 μl BDCA-1磁珠混勻，4℃冰箱孵育15 min后用5 ml PBS洗滌，在磁分選單位上用MS柱陽選出BDCA-1+mDC即為CD11c+mDC。

1.2.4 新鮮分離的CD11c+mDC細胞表型測定 收集上述新鮮分離的CD11c+mDC，?。?×104細胞，用FITC標記鼠抗人CD80 mAb 和PE標記鼠抗人CD86 mAb各10 μl標記細胞，同時設(shè)同型對照，室溫避光孵育30 min，置于水平式離心機內(nèi)以1 500 r/min離心5 min，4%多聚甲醛固定，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 活動期UC患者疾病嚴重程度分級 采用改良Truelove和Witts疾病嚴重程度分型標準[1]，按疾病活動性的嚴重程度分為輕、中、重度，見表2。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用（均數(shù)±標準差）（±s）表示。兩組均數(shù)比較采用t 檢驗，單因素方差分析用于多組均數(shù)的顯著性檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率

流式細胞儀檢測出lineage陰性，CD11c和HLA-DR雙陽性細胞占PBMC的比率。對40例活動期UC患者及30例健康對照者外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率進行t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），活動期UC患者外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率低于健康對照組[（0.31%±0.40%）vs. （0.78%±0.40%）]，P＜0.05，如圖1。

圖1 外周血中CD11c+mDC頻率的變化

圖2 不同臨床嚴重程度CD11c+mDC頻數(shù)

2.2 不同臨床嚴重程度活動期UC患者外周血中CD11c+mDC頻數(shù)比較

活動期UC患者按疾病活動性的嚴重程度分為輕、中、重度3組，其中輕度患者12例，中度15例，重度13例。3組CD11c+mDC頻數(shù)分別（0.76%±0.50%），（0.13%±0.05%），（0.11%±0.05%）。中度組和重度組CD11c+mDC頻數(shù)均低于輕度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中度組和重度組CD11c+mDC頻數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義，如圖2。

2.3 新鮮分離外周血中CD11c+mDC細胞表型的變化

流式細胞儀檢測新鮮分離的CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86，活動期UC患者組CD80和CD86表達率分別為（6.83%±3.22%），（43.95%±16.42%），健康對照組CD80和CD86表達率為（2.50%±1.23%），（17.22%±7.53%）。活動期UC患者組CD80和CD86表達率均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），如圖3。

表2 改良Truelove和Witts疾病嚴重程度分型

3 討論

UC屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）范疇，近年來患病率明顯增加，日益成為嚴重影響人類健康的消化系統(tǒng)疾病之一。研究認為，包括環(huán)境、遺傳、自由基損傷、免疫等多種因素共同導致UC的發(fā)病[2]，而免疫應答異常和免疫調(diào)節(jié)失衡被認為是發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[3]。DC是人體內(nèi)功能強大的抗原遞呈細胞，通過活化初始型T細胞并將抗原遞呈給T細胞，使UC免疫反應中最重要的效應細胞發(fā)揮免疫作用。外周血DC根據(jù)其表型和功能可分為髓樣樹突狀細胞（mycloid dendritic cell，mDC）和漿樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）[4]。既往研究多以單核細胞來源的樹突狀細胞（monocyte-derived dendritic cells，moDC）在細胞因子刺激下長時間體外培養(yǎng)，DC本身的免疫應答會發(fā)生改變。因此，將外周血CD11c+mDC和CD123+pDC分選研究可能有助于進一步闡明不同亞型DC在機體免疫中的不同作用以及與活動期UC患者臨床嚴重程度的關(guān)系。CD11c+mDC在體內(nèi)主要發(fā)揮抗原提呈功能，促進Th1細胞極化和細胞免疫的發(fā)生[5]。pDC激活后主要產(chǎn)生機體內(nèi)源性Ⅰ型干擾素（Ⅰ-IFN），它既能直接抑制病毒復制，又能激活NK細胞、淋巴細胞和mDC，從而誘導并增強免疫應答反應[6]。所以，我們對mDC和pDC進行分離研究可以完善以往對DC缺陷引起機體免疫功能紊亂的新認識。

圖3 新鮮分離CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達率

近來有研究表明，腸道DC在UC的病理過程中發(fā)揮重要作用[7]，Drakes等[8]在小鼠結(jié)腸炎的模型中將結(jié)腸DC與自體固有層的T細胞共同培養(yǎng)，刺激IFN-γ和IL-6的產(chǎn)生時，其數(shù)量顯著高于DC與同源或異源脾臟T細胞共同培養(yǎng)時產(chǎn)生的IFN-γ 和IL-6。DC與UC密切相關(guān)[9-10]。若單純比較DC亞群數(shù)量變化意義不大，本實驗結(jié)合患者臨床嚴重程度指標來探討臨床現(xiàn)象與免疫研究之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：活動期UC患者外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率下降，可能與下列因素有關(guān)：（1）腸道病原微生物及其產(chǎn)物直接感染CD11c+mDC，誘導其凋亡，導致CD11c+mDC數(shù)量下降。（2）CD11c+mDC參與腸道免疫活動而轉(zhuǎn)移到炎癥部位。本研究根據(jù)疾病嚴重程度分級，將活動期不同疾病嚴重程度UC患者CD11c+mDC相對數(shù)量作比較，發(fā)現(xiàn)中度組和重度組CD11c+mDC占PBMC的比率均低于輕度組，提示外周血中CD11c+mDC激活后遷移到腸道炎癥部位，從而使外周血中CD11c+mDC數(shù)量減少，這與之前Baumgart等[11]研究結(jié)果一致。Baumgart等研究還發(fā)現(xiàn)IBD患者結(jié)腸黏膜上pDC高表達，并且其分泌的TNF-α、IL-6、IL-8也較正常對照增高[12]。

成熟DC表達共刺激分子CD80（B7-1）和CD86（B7-2），它們與表達于T細胞表面的CD28結(jié)合，形成第二信號，刺激T細胞活化。當強烈的共刺激信號形成后，CTL等免疫活性細胞被激活，進而產(chǎn)生免疫應答。以往有研究測定UC患者結(jié)腸黏膜上CD80和CD86的表達，結(jié)果提示CD80僅在部分患者中能檢測到，CD86存在于所有患者，而健康對照組均未能檢出[13]。本研究對CD11c+mDC分離純化，通過直接檢測未經(jīng)刺激DC細胞表型來反映其在外周血中的活化狀態(tài)。研究結(jié)果顯示：UC患者組與健康對照組CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達率均低下，說明循環(huán)中DC絕大部分為未成熟DC。活動期UC患者CD86表達率高于健康對照組，原因可能是UC患者外周血中mDC加工遞呈抗原，通過淋巴管遷移至脾臟和淋巴結(jié)，完成成熟過程，同時表面共刺激分子表達增加；在這個過程中可能還會檢測到外周血中mDC的CD86表達升高。同時也提示：UC患者外周血CD11c+mDC在受到病原微生物及其產(chǎn)物刺激后形成共刺激信號，其能力并未受明顯影響[14]。

如果體內(nèi)DC免疫功能異常將會影響到機體免疫的各個環(huán)節(jié)。本研究表明，活動期UC患者外周血中CD11c+mDC數(shù)量減少可能與腸道病原微生物及其產(chǎn)物作用以及腸道炎癥均有關(guān)系。CD11c+mDC數(shù)量減少導致機體特異性免疫反應產(chǎn)生能力降低，但細胞表面共刺激分子生成能力卻并未嚴重受損。本研究對于探討活動期UC發(fā)病的免疫機制及今后尋找新的治療UC的藥物靶點具有重要意義。

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·臨床研究·

Changes in Frequency and Phenotype of Circulating CD11c+Myeloid Dendritic Cells in Patients With Active Ulcerative Colitis

WANG Xiangli1ZHENG Tiansong1JIA Ni’na2XIAO Jinmei2GAO Hong2ZHANG Jiping3ZHANG Huanhu2, 1 Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China, 2 Department of liver diseases, the second hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China, 3 Science and Technology Department of the second hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

[Abstract]Objective To investigate the frequency and phenotype of circulating CD11c+myeloid dendritic cells (mDC) in patients with active ulcerative colitis. Methods CD11c+mDC were isolated by immunomagnetic selection. Flow cytometry was used to analyze the frequency of circulating CD11c+mDC and costimulatory molecules CD80 and CD86 on freshly isolated mDCs. Results The frequency of peripheral CD11c+mDC in patients with active ulcerative colitis was significantly decreased as compared with that in the healthy controls [(0.31%±0.40%) vs. (0.78%±0.40%), P＜0.05]. Statistic differences of the CD11c+mDC frequency also existed among patients with different clinical severity. Both CD80 and CD86 expression on freshly isolated CD11c+mDC surface were lower, however, both CD80 and CD86 expression in the patients was relatively higher than that in the control [(6.83%±3.22%) vs. (2.50%±1.23%), (43.95%±16.42%) vs. (17.22%±7.53%), P＜0.05]. Conclusion Reduce the active UC patients and in the peripheral blood of CD11c+mDC frequency, but the surface of the CD11c+mDC costimulatory molecules CD80 and CD86 expression rate was not seriously damaged, active UC patients and in the peripheral blood of CD11c+mDC frequency decreased and were correlated with the clinical severity.

[Key words]Ulcerative colitis, Active, CD11c+myeloid dendritic cell, Frequency, Phenotype

【中圖分類號】R512

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）05-0033-03

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．05．022

基金項目：山西省衛(wèi)生廳科研課題（201201073）

通訊作者：張桓虎，E-mail：zhhh31@163．com