劉婷婷，王濤，楊翼，王澤建，莊英萍,2，儲(chǔ)炬,2，郭美錦,2 華東理工大學(xué)　生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?！?00272 上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上?！?0027 上海紐邁電子科技有限公司，上海　20027

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低場(chǎng)核磁共振技術(shù)快速檢測(cè)小球藻油脂含量及其在高通量選育中的應(yīng)用

劉婷婷1，王濤1，楊翼3，王澤建1，莊英萍1,2，儲(chǔ)炬1,2，郭美錦1,2
1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237
2 上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200237
3 上海紐邁電子科技有限公司，上海200237

劉婷婷, 王濤, 楊翼, 等. 低場(chǎng)核磁共振技術(shù)快速檢測(cè)小球藻油脂含量及其在高通量選育中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(3): 385–396.

Liu TT, Wang T, Yang Y, et al. Low field nuclear magnetic resonance for rapid quantitation of microalgae lipid and its application in high throughput screening. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 385–396.

摘 要:為了建立一個(gè)高效的高產(chǎn)油微藻誘變育種流程，微藻中油脂含量快速和準(zhǔn)確的測(cè)定在其中具有重要作用。在本研究中，首先利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)，建立了直接檢測(cè)干藻粉和培養(yǎng)液中小球藻油脂含量的方法，其信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞中油脂含量存在特異的線性關(guān)系，干藻粉和藻液中油脂含量與信號(hào)值擬合的R2均高于0.99，說(shuō)明該方法用于小球藻油脂含量的檢測(cè)是準(zhǔn)確和可行的。同時(shí)該方法與傳統(tǒng)油脂測(cè)量方法相比，具有快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。但其通量不及尼羅紅染色法，因此，我們開(kāi)發(fā)了將尼羅紅染色法用于初篩，低場(chǎng)核磁共振技術(shù)用于復(fù)篩的新型高通量藻種復(fù)合篩選方法，并將此篩選方法應(yīng)用于一種異養(yǎng)高產(chǎn)油原殼小球藻的誘變育種過(guò)程中。首先從3 098株誘變?cè)宸N中初篩得到108株具有較高油脂含量的藻株，然后利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)復(fù)篩得到9株高產(chǎn)油性能的藻株，其中一株甘油三酯含量超過(guò)20%，比原始藻株提高1倍，培養(yǎng)168 h后培養(yǎng)液油脂濃度達(dá)到5 g/L，證明此誘變育種流程不僅提高了篩選的效率還可靠且可行。

關(guān)鍵詞:低場(chǎng)核磁共振，誘變育種流程，微藻，油脂檢測(cè)

Received: November 18, 2015; Accepted: January 6, 2016

Supported by: National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2011CB200900).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB200900) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160126.0932.001.html

當(dāng)今主要利用的石油資源是不可再生的，且會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，產(chǎn)生溫室效應(yīng)[1]。生物柴油 (Biodiesel) 是比較理想的可再生能源，其利用生物的光合作用進(jìn)行合成，是一種新型碳中性的能源。利用微藻進(jìn)行生物柴油原材料的開(kāi)發(fā)和利用近年來(lái)受到全球廣泛的關(guān)注，相較于傳統(tǒng)農(nóng)作物而言，微藻具有明顯優(yōu)勢(shì)，如單位細(xì)胞油脂含量高、不僅能固定二氧化碳，同時(shí)還能吸收廢水中的氮和磷等。因此，利用微藻生產(chǎn)生物柴油在未來(lái)是非常具有潛力的對(duì)象[2-3]。

但是，目前微藻作為生物柴油的原料成本仍然較高，是阻礙生物柴油工業(yè)化生產(chǎn)的最大因素之一。為了降低成本，采用微生物育種以期待獲得具有更高油脂含量以及更好生長(zhǎng)性能的小球藻藻種是比較可靠的方法之一[4]。由于通過(guò)基因改造改良藻種受到單細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展緩慢，高效的誘變育種方法成為小球藻育種的最佳選擇[5]，Ota和馬玉濱等用重離子誘變技術(shù)選育到高產(chǎn)油脂擬微球藻與小球藻[6-7]。

在優(yōu)良藻種獲得中，高通量篩選技術(shù)的出現(xiàn)是傳統(tǒng)篩選技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的快速和高效的篩選方法，但油脂 (Lipid) 的快速檢測(cè)是影響藻種進(jìn)行高通量篩選的重要限制因素，因此尋找一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的油脂測(cè)定方法，不僅能夠提高篩選的效率，同時(shí)能夠?qū)?yōu)良藻種的培養(yǎng)研究過(guò)程中油脂含量的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，從而用于對(duì)藻種生產(chǎn)性能的評(píng)估和培養(yǎng)過(guò)程的優(yōu)化。

微藻總脂含量的測(cè)定方法有傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法、索氏提取法、熒光染料測(cè)定法、傅里葉變換紅外光譜法、磷酸香草醛法、銅試劑法、蘇丹黑染色法和核磁共振法等[8]。近來(lái)，基于低場(chǎng)核磁共振原理的油脂檢測(cè)技術(shù)受到廣泛的關(guān)注，低場(chǎng)核磁共振雖然分辨率不及高場(chǎng)核磁共振，不能得到精細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信息，但能得到分子之間的相互作用引起的信號(hào)變化[9]，憑借成本低廉、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，在石油[10]、礦石[11]、食品加工和分析[12]、廢物原料的分析[13]和制藥工業(yè)等許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，但在微藻油脂檢測(cè)中的應(yīng)用還甚少。

低場(chǎng)核磁共振測(cè)量油脂是基于氫質(zhì)子在不同物質(zhì)中弛豫時(shí)間的差異而實(shí)現(xiàn)的[14]，蛋白和碳水化合物中氫核的弛豫時(shí)間很短，能夠與油脂明顯區(qū)分開(kāi)。而自由水和油脂中的弛豫時(shí)間接近，但通過(guò)添加一些順磁性離子 (例如錳離子)能夠大大加快自由水中氫核的弛豫，因此可以去除水對(duì)油脂信號(hào)的干擾[15-16]。

以上這些油脂檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，不論在藻種的篩選還是過(guò)程培養(yǎng)中，不能依賴單一的方法來(lái)滿足油脂檢測(cè)的需求[17]。因此，本文提出了1種基于尼羅紅染色初篩和低場(chǎng)核磁共振復(fù)篩的新型誘變育種方法，并建立了高效的藻種育種流程，獲得高產(chǎn)油的藻株。

表1　培養(yǎng)基成分Table 1 Medium component

1　材料與方法

1.1藻種和培養(yǎng)方法

原殼小球藻Chlorella protothecoides IOCAS038F由中國(guó)科學(xué)院青島海洋所劉建國(guó)教授贈(zèng)送。

所用的培養(yǎng)基為經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的異養(yǎng)培養(yǎng)基，成分如表1所示，配好后調(diào)pH至8.0。在初篩和復(fù)篩中，依次在孔板、搖瓶和5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行。平板篩選所用的培養(yǎng)基是在上述培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂，待其冷卻凝固后涂布藻細(xì)胞，置于30 ℃培養(yǎng)?？装迮囵B(yǎng)先在無(wú)菌的48孔板中每個(gè)孔中添加2.4 mL滅菌培養(yǎng)基，接種之后于30 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)在500 mL的搖瓶中進(jìn)行，其裝液量為200 mL，接入10% (V/V) 的種子，于30 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)。反應(yīng)器培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行 (上海國(guó)強(qiáng)生化工程技術(shù)有限公司，上海)，反應(yīng)器的裝液量為3 L，并加入0.1%的消泡劑，滅菌后接入10%的搖瓶種子，通氣量 1.8 L/min，在30 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，初始轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)逐步提高轉(zhuǎn)速使得溶氧水平 (DO) 維持在20%飽和濃度以上，全程用2 mol/L HCl溶液將pH自動(dòng)調(diào)控為7.0。

1.2原殼小球藻誘變方法

紫外 (UV) 誘變：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原殼小球藻培養(yǎng)液10 mL于培養(yǎng)皿中，在15 W的紫外燈下距離40 cm分別照射一定時(shí)間，稀釋后均勻涂布于平板上培養(yǎng)7 d。LiCl誘變：取一定量LiCl母液加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原殼小球藻培養(yǎng)液中混勻，30 min后稀釋以終止誘變，再稀釋適當(dāng)倍數(shù)涂布于平板上培養(yǎng)7 d。UV-LiCl聯(lián)合誘變：根據(jù)原殼小球藻UV誘變和LiCl誘變的致死曲線得到各自的最佳處理?xiàng)l件進(jìn)行處理，稀釋后均勻涂布于平板上培養(yǎng)7 d。LV (LiCl-UV) 誘變：將原殼小球藻按照適當(dāng)?shù)臈l件先進(jìn)行LiCl誘變，再進(jìn)行UV誘變，涂平板得到單藻落；VL (UV-LiCl) 誘變：將原殼小球藻進(jìn)行UV誘變?cè)儆眠m當(dāng)濃度的LiCl處理，涂平板得到單藻落；LVL (LiCl-UV-LiCl) 誘變：將原殼小球藻依次進(jìn)行LiCl誘變、UV誘變和LiCl誘變，涂平板得到單藻落。常壓室溫等離子體 (Atmospheric and room temperature plasma, ARTP) 誘變：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原殼小球藻藻液于裝有無(wú)菌玻璃珠的瓶中振蕩數(shù)次，然后取10 μL于載片上，載片置于ARTP誘變儀(ARTP-II，無(wú)錫思清源生物科技有限公司) 誘變一定時(shí)間后，用1 mL無(wú)菌水洗下載片上的藻液，均勻涂布于平板上培養(yǎng)7 d。

為了增加誘變后平板上長(zhǎng)出的單藻落的正突變率，選用了奧利司他作為誘變后的篩選壓力，以便提高篩選效率。即待平板培養(yǎng)的培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50–70 ℃后，添加一定量奧利司他，再按照平板培養(yǎng)的方法培養(yǎng)。將誘變后的小球藻平板培養(yǎng)至長(zhǎng)出單藻落后，挑單藻落至48孔板進(jìn)行孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后初篩，然后復(fù)篩，最后將篩選出的藻株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證。藻株搖瓶培養(yǎng)5 d為第一代，以10%接種量接種后搖瓶培養(yǎng)5 d即為第二代，以此類(lèi)推，一共傳6代即可。取10 mL每1代藻株培養(yǎng)8 d的藻液用低場(chǎng)核磁共振儀檢測(cè)，油脂含量相同或者相近即為遺傳穩(wěn)定性較好。

1.3檢測(cè)方法

小球藻生物量用細(xì)胞干重 (Dry cell weight, DCW) 進(jìn)行表示，取40 mL對(duì)應(yīng)發(fā)酵液，6 000 r/min離心5 min，棄上清后洗滌2次，離心，80 ℃烘干后稱其干重，計(jì)算得到DCW。

油脂檢測(cè)分別采用尼羅紅染色、索氏提取和GC-MS，以及低場(chǎng)核磁共振方法。尼羅紅染色是先取100 μL培養(yǎng)好的原殼小球藻于黑色酶標(biāo)板中，加100 μL 30 mg/L的尼羅紅二甲基亞砜溶液，混勻1 min，染色20 min，用熒光酶標(biāo)儀 (BioTek SYNERGY H1) 測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm的熒光強(qiáng)度[18]。索氏提取法檢測(cè)含油量步驟是先將樣品于80 ℃烘干至恒重，然后用研缽研磨成細(xì)粉，再準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的藻粉，將其置于脫脂濾筒中放于索氏提取儀器中，連接好儀器后由冷凝管上方加入1∶2的氯仿和甲醇混合液，于55 ℃水浴加熱12 h后取下燒瓶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后置于烘箱烘干，記錄其重量并計(jì)算含油率[19]。GC-MS檢測(cè)含油量的步驟是先將原殼小球藻藻液離心洗滌后烘干，再將干燥的藻體研磨成均一的細(xì)粉。精確稱取0.02–0.1 g研磨后的藻粉，在稱量好的藻粉中加1 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液后置于70 ℃中水浴30 min，冷卻后加入1 mL 0.3 mol/L H2SO4-CH3OH溶液和0.5 mL 14%的BF3-CH3OH溶液 (Sigma-Aldrich, USA)，再次置于70 ℃中水浴30 min，冷卻后加入2 mL正己烷反復(fù)振蕩多次，靜置10 min，然后加水至10 mL，3 000 r/min離心5 min。最后將正己烷層用0.2 μm油性過(guò)濾頭過(guò)濾后與400 mg/L 十九烷酸甲酯按照1∶1 (V/V) 的比例混勻，將混勻的樣品用GC-MS儀器 (安捷倫 7 890C GC系統(tǒng)和5 975C inert MSD，美國(guó)) 檢測(cè)，在分析軟件上計(jì)算得到各脂肪酸組分的濃度和各組分的百分比。

低場(chǎng)核磁共振 (Low field nuclear magnetic resonance, LF-NMR) 技術(shù)檢測(cè)方法為將一定體積或一定質(zhì)量的原殼小球藻抽提藻油或三油酸甘油酯 (Sigma-Aldrich，美國(guó)) 標(biāo)準(zhǔn)液置于玻璃小瓶中，用PQ001型LF-NMR核磁共振分析儀(PQ001-010，上海紐邁電子科技有限公司) 檢測(cè)其響應(yīng)值。在直接測(cè)定含游離水的油脂樣品中(小球藻培養(yǎng)液或含水樣)，則添加15% MnCl2以排除水信號(hào)對(duì)油脂信號(hào)的干擾。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

致死率計(jì)算是先按照稀釋涂布法統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本的藻落數(shù)，然后根據(jù)處理后藻落數(shù)與總藻落數(shù)計(jì)算致死率。

致死率= (未處理藻落數(shù)–相應(yīng)條件處理后藻落數(shù))/未處理藻落數(shù)×100%。正突變率計(jì)算中尼羅紅染色法測(cè)得的熒光強(qiáng)度高于原始藻株的熒光強(qiáng)度20%的藻株為正突變?cè)逯辍?/p>

正突變率=正突變?cè)逯陻?shù)/所檢測(cè)的藻株數(shù)×100%。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

2　結(jié)果與討論

2.1低場(chǎng)核磁共振技術(shù)快速檢測(cè)小球藻油脂方法的建立

2.1.1三油酸甘油酯標(biāo)液 (TAG) 和干藻粉中油脂量 (GC-MS測(cè)得) 與LF-NMR響應(yīng)值的關(guān)系

為了考察低場(chǎng)核磁共振技術(shù)在檢測(cè)原殼小球藻油脂中的可行性和適用性，首先考察了標(biāo)準(zhǔn)品三油酸甘油酯及2種形式細(xì)胞中油脂量(用GC-MS測(cè)得) 與低場(chǎng)核磁信號(hào)響應(yīng)值之間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可看出，不管是三油酸甘油酯、抽提藻油和存在于干藻粉中的油脂與低場(chǎng)核磁信號(hào)之間都呈良好的線性關(guān)系，特別是TAG標(biāo)液與響應(yīng)值線性擬合R2大于0.999 9，表明低場(chǎng)核磁共振技術(shù)對(duì)TAG的定量具有非常高的準(zhǔn)確性。同時(shí)，比較分析圖1中A、B和C可發(fā)現(xiàn)，三者線性擬合的斜率是不同的，這是因?yàn)椴煌瑯悠分械挠椭坎町愒斐傻?，抽提藻油由于含有蛋白、色素等雜質(zhì)油脂含量低于標(biāo)品，而藻粉油脂含量?jī)H為13.47%，所以其信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度均小于標(biāo)品三油酸甘油酯。因此，結(jié)果表明低場(chǎng)核磁信號(hào)與原殼小球藻中的油脂量是專(zhuān)一性的正比關(guān)系，能夠用于原殼小球藻油脂量的測(cè)量。

另外，從圖1D中可看出，不同含油率干藻粉質(zhì)量相同的情況下，低場(chǎng)核磁信號(hào)值與GC-MS所測(cè)得的含油量也呈很好的線性關(guān)系，經(jīng)過(guò)線性擬合，得到公式(1)：

式中x為核磁信號(hào)，y為用GC-MS測(cè)得的細(xì)胞內(nèi)油脂含量。

這也驗(yàn)證了低場(chǎng)核磁共振技術(shù)用于直接測(cè)定藻粉中油脂含量的可行性，用于微藻中油脂含量快速和直接的測(cè)定。

圖1　不同類(lèi)型油脂與低場(chǎng)核磁信號(hào)之間的關(guān)系Fig. 1 The linear relationship between LF-NMR signal intensities and the lipids quantity or lipid contents. (A) Glycerol trioleate. (B) Extracted algal lipids by Soxhlet method from C. protothecoides. (C) Dry microalgae cells. (D) The calibration curve of LF-NMR signal intensity with algal lipid content (GC-MS determination) in dry cells.

2.1.2培養(yǎng)液中小球藻用GC-MS測(cè)得含油量與LF-NMR響應(yīng)值之間的關(guān)系

快速檢測(cè)無(wú)論在藻種篩選和過(guò)程控制中都具有重要的作用。為了實(shí)現(xiàn)低場(chǎng)核磁共振技術(shù)能夠直接檢測(cè)藻培養(yǎng)液中的油脂含量，考察了不同原殼小球藻培養(yǎng)液 (體積均為10 mL) 用GC-MS測(cè)得的油脂濃度與用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)測(cè)得的響應(yīng)值的關(guān)系，結(jié)果表明不同原殼小球藻培養(yǎng)液的含油量與響應(yīng)值呈線性關(guān)系 (圖2)。經(jīng)過(guò)線性擬合，得到公式(2)：

式中x為核磁信號(hào)，y為用GC-MS測(cè)得細(xì)胞中總油脂量后計(jì)算所得的油脂濃度。

由此可知，利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)不僅可直接檢測(cè)干藻粉中的油脂含量，還可以直接測(cè)定培養(yǎng)液中的油脂濃度，在獲得細(xì)胞濃度后還可計(jì)算得到細(xì)胞含油率。

2.1.3低場(chǎng)核磁共振技術(shù)與現(xiàn)有小球藻含油量定量方法比較

目前，小球藻油脂含量分析的方法主要包括稱重法、染色法、核磁共振法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等。為了從現(xiàn)有的小球藻含油量檢測(cè)方法中選出適合于小球藻誘變后篩選的方法，對(duì)GC-MS、索氏提取、尼羅紅染色常用微藻油脂定量方法與低場(chǎng)核磁定量方法進(jìn)行比較。對(duì)比的數(shù)據(jù)來(lái)自于相關(guān)參考文獻(xiàn)[8,10,18]以及本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可以看出低場(chǎng)核磁共振技術(shù)操作最簡(jiǎn)單、耗時(shí)最短且準(zhǔn)確性高，可以用于小球藻誘變篩選流程中的復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證，尼羅紅染色可以快速檢測(cè)多個(gè)樣品，適用于高通量篩選，可以用于初篩。因此，小球藻誘變流程中的初篩選擇尼羅紅染色法，復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證則采用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)。

圖2　不同原殼小球藻培養(yǎng)液細(xì)胞油脂利用低場(chǎng)核磁直接測(cè)定結(jié)果 (油脂含量都是用GC-MC法測(cè)得)Fig. 2 The calibration curve of LF-NMR signal intensity with lipid concentration in algal broth. All the lipid contents were quantified by GC-MS method.

表2　低場(chǎng)核磁和傳統(tǒng)油脂測(cè)定方法的比較Table 2 Comparison of lipid determination between conventional determination methods and LF-NMR method

2.2低場(chǎng)核磁共振快速檢測(cè)技術(shù)在小球藻誘變育種過(guò)程中的應(yīng)用

2.2.1不同誘變方法的致死曲線

為了確定各誘變方法適當(dāng)?shù)恼T變劑量，繪制了原殼小球藻UV誘變、LiCl誘變和ARTP誘變的致死曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。由于出發(fā)藻種是野生藻種，沒(méi)有經(jīng)過(guò)誘變處理，適合選擇致死率較高的條件進(jìn)行誘變[20]。在UV誘變致死曲線中，原殼小球藻致死率隨處理時(shí)間增加而增加，在處理6 min后致死率達(dá)到了95%以上，因此，原殼小球藻UV誘變的劑量為UV照射6 min。在LiCl致死曲線中，原殼小球藻致死率隨LiCl濃度的增加而增加，當(dāng)LiCl濃度達(dá)到9 g/L后致死率基本不再變化，達(dá)到70%左右，因此，選擇LiCl誘變的劑量為9 g/L。在ARTP致死曲線與UV致死曲線類(lèi)似，在25 s以后原殼小球藻的致死率達(dá)到了95%，因此，ARTP誘變中選擇25 s為處理時(shí)間。

圖3　不同誘變方法的致死曲線Fig. 3 Lethal percentages of C. protothecoides cells treated by different mutation methods. (A) UV radiation. (B) LiCl. (C) ARTP.

2.2.2原殼小球藻的誘變育種及初篩

由于單獨(dú)誘變效果不能滿足篩選要求，特別是所選的誘變方法中LiCl本身并無(wú)直接誘變作用，但是與其他誘變劑聯(lián)用能產(chǎn)生很好的協(xié)同作用[21]，因此對(duì)不同的復(fù)合誘變策略進(jìn)行考察。同時(shí)，奧利司他是一種脂肪酸合成酶抑制劑，可以抑制脂肪酸的合成[22]，將其作為選擇壓力，提高篩選的正突變率。首先對(duì)奧利司他的篩選效果進(jìn)行考察 (圖4A)，顯然，奧利司他在篩選過(guò)程中發(fā)揮了作用，提高了篩選的正突變率。此后將小球藻細(xì)胞用5種不同誘變方法處理后在添加20 μg/mL奧利司他的平板培養(yǎng)，然后從平板中共挑取3 098個(gè)單藻落至48孔板培養(yǎng)后用尼羅紅染色法對(duì)其進(jìn)行初篩，計(jì)算得到各自的正突變率 (圖4B)，從圖中可以看出ARTP、LVL和UV的正突變率在30%以上，明顯高于LV和VL。相較于LVL和UV而言，ARTP不僅正突稍高，而且操作更加簡(jiǎn)單、快捷，所以選取ARTP作為藻種誘變篩選流程中的誘變方法。

2.2.3基于低場(chǎng)核磁的高產(chǎn)油藻株復(fù)篩

正如2.1中結(jié)果，低場(chǎng)核磁能夠快速和準(zhǔn)確地定量分析微藻中的油脂含量，因此將其利用到高油脂藻細(xì)胞的篩選中。由于其篩選通量不及尼羅紅染色高，所以應(yīng)用到以上誘變?cè)宸N的復(fù)篩中，直接檢測(cè)微藻培養(yǎng)液，快速和準(zhǔn)確地獲得油脂濃度，共復(fù)篩108株藻株 (圖5)。圖5中所有的突變?cè)逯甑暮土慷急仍荚逯甏?，?yàn)證了此篩選流程的可靠性。圖5中除了大部分藻株油脂含量在1.5 g/L到2.3 g/L之間，還有9株藻株含油量較高，選取此9株藻株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳6代后結(jié)果見(jiàn)表3。表3中大部分藻株第6代的藻株油脂含量與復(fù)篩時(shí)即第一代的油脂含量相近，說(shuō)明其遺傳穩(wěn)定性良好。選取其中遺傳穩(wěn)定性好且油脂含量也較高的G1H3、4E4、D4G5這3株藻株在5 L攪拌式反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6A中D4G5、G1H3的生長(zhǎng)曲線和出發(fā)藻株WT相似，在48 h時(shí)微藻細(xì)胞量達(dá)到最大，微藻生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，而4E4在48 h還處于生長(zhǎng)期。G1H3、D4G5的最終生物量比WT高，而4E4和WT相近，表明高油脂含量突變株的生長(zhǎng)情況良好，并未受到突變的影響。在圖6B中，所有藻株培養(yǎng)24 h的油脂含量都有所下降，可能是由于藻株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)動(dòng)大部分能量生長(zhǎng)細(xì)胞引起，當(dāng)48 h細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期后，細(xì)胞中的油脂含量開(kāi)始快速累積，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)突變株的油脂含量均高于野生株，分別為21.8%、17.7%和16.9%，而野生株僅為10.2%，尤其是D4G5最終含油脂率為WT的2倍左右，這都說(shuō)明獲得的突變株不僅油脂含量高，而且生長(zhǎng)良好，產(chǎn)油脂的性能比原始藻株好，圖6C中油脂濃度的變化也能驗(yàn)證這一點(diǎn)，同時(shí)這些都證明了此藻細(xì)胞育種流程的可靠性。

圖4　原殼小球藻不同誘變處理方法的正突變率Fig. 4 Positive mutation rates of C. protothecoides cells treated by different mutation methods. (A) Treated by ARTP with or without orlistat. (B) Treated by five different mutation methods with orlistat.

圖5　復(fù)篩結(jié)果Fig. 5 The lipid concentration of rescreened C. protothecoides strains.

表3　高產(chǎn)油藻株的搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證Table 3 Verification of high lipid content strains grown in shaking flask

圖6　高油脂含量原殼小球藻突變株，G1H3、4E4、D4G5及野生株在5 L攪拌式反應(yīng)器中生長(zhǎng)和油脂含量變化曲線Fig. 6 Time courses of cell growth and lipid content of G1H3, 4E4, D4G5 and wild strains cultured in a 5-liter stirred bioreactor. (A) Cell growth. (B) Lipid content. (C) Lipid concentration.

3　結(jié)論

低場(chǎng)核磁共振技術(shù)檢測(cè)小球藻油脂含量是一個(gè)可靠的方法，可以用于小球藻油脂含量快速檢測(cè)，因此將低場(chǎng)核磁共振技術(shù)用于藻種篩選流程中可以使篩選更加簡(jiǎn)單快捷。

圖7所示為基于尼羅紅染色初篩和低場(chǎng)核磁共振復(fù)篩的一個(gè)簡(jiǎn)單、高效、易操作的高產(chǎn)油微藻誘變育種流程。藻種誘變篩選工藝流程：微藻細(xì)胞先經(jīng)ARTP誘變后在添加20 μg/mL奧利司他的平板中培養(yǎng)，挑單藻落至48孔板中培養(yǎng)3 d，尼羅紅染色后用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，將熒光強(qiáng)度大的藻種接種至搖瓶培養(yǎng)，8 d后用LF-NMR檢測(cè)，油脂含量較大的藻種再傳代檢驗(yàn)其遺傳穩(wěn)定性，遺傳穩(wěn)定性合格的藻種就是油脂含量較高的新藻種。

此流程不僅優(yōu)化了誘變方式，還選擇了適合的篩選方法，其中的低場(chǎng)核磁共振技術(shù)相較

于索氏提取以及GC-MS等方法，不需要將藻液離心干燥，更不需要索氏提取的復(fù)雜工藝和GC-MS復(fù)雜的前處理。在時(shí)間和操作步驟的簡(jiǎn)易程度上，低場(chǎng)核磁共振技術(shù)都優(yōu)勝于索氏提取和GC-MS。將低場(chǎng)核磁共振技術(shù)用于誘變流程的復(fù)篩中簡(jiǎn)化了篩選的步驟，縮短了篩選的周期，使篩選流程方便、快速和高效。

圖7　高產(chǎn)油脂微藻育種流程Fig. 7 Breeding procedure for high lipid producing strains of microalgae.

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Low field nuclear magnetic resonance for rapid quantitation of microalgae lipid and its application in high throughput screening

Tingting Liu1, Tao Wang1, Yi Yang3, Zejian Wang1, Yingping Zhuang1,2, Ju Chu1,2, and Meijin Guo1,2
1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
2 Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing, Shanghai 200237, China
3 Shanghai Niumag Corporation, Shanghai 200237, China

Abstract:A rapid and accurate determination method of lipids in microalgae plays a significant role in an efficient breeding process for high-lipid production of microalgae. Using low field nuclear magnetic resonance (LF-NMR), we developed a direct quantitative method for cellular lipids in Chlorella protothecoides cells. The LF-NMR signal had a linear relationship with the lipid content in the microalgae cells for both dry cell samples and algal broth samples (R2>0.99). These results indicated that we could use this method for accurate determination of microalgal lipids. Although LF-NMR is a rapid and easy lipid determination method in comparison to conventional methods, low efficiency would limit its application in high throughput screening. Therefore, we developed a novel combined high throughput screening method for high-lipid content mutants of C. protothecoides. Namely, we initially applied Nile red staining method for semi-quantification of lipid in the pre-screening process, and following with LF-NMR method for accurate lipid determination in re-screening process. Finally, we adopted this novel screening method in the breeding process of high-lipid content heterotrophic cells of C. protothecoides. From 3 098 mutated strains 108 high-lipid content strains were selected through pre-screening process, and then 9 mutants with high-lipid production were obtained in the re-screening process. In a consequence, with heterotrophical cultivation of 168 h, the lipid concentration could reach 5 g/L, and the highest lipid content exceeded 20% (W/W), which was almost two-fold to that of the wild strain. All these results demonstrated that the novel breeding process was reliable and feasible for improving the screening efficiency.

Keywords:low field nuclear magnetic resonance, mutated breeding process, microalgae, lipid determination

Corresponding author:Meijin Guo. Tel/Fax: +86-21-64251131; E-mail: guo_mj@ecust.edu.cn