梁航華，高洪燕，徐曼，譚鵬，崔紅娟西南大學　家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶　400716

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家蠶BmBrat基因的克隆與鑒定

梁航華，高洪燕，徐曼，譚鵬，崔紅娟
西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶400716

梁航華, 高洪燕, 徐曼, 等. 家蠶BmBrat基因的克隆與鑒定. 生物工程學報, 2016, 32(3): 375–384.

Liang HH, Gao HY, Xu M, et al. Cloning and characterization of BmBrat in silkworm, Bombyx mori. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 375–384.

摘 要:NHL家族蛋白具有調控細胞增殖與分化的功能，在哺育動物中被廣泛研究。本文克隆得到家蠶NHL蛋白家族成員BmBrat基因，通過RACE技術獲得該基因cDNA全長序列為3 614 bp，其ORF為2 580 bp，編碼859個氨基酸，預測其蛋白分子量為94.3 kDa，等電點為6.65。利用RT-PCR技術檢測其在五齡3 d家蠶各組織表達情況，結果表明其在幼蟲各組織均有表達，包括絲腺、中腸、脂肪體、馬氏管等，且卵巢和頭部表達量最高；胚胎時期表達譜分析顯示其在胚胎發(fā)育第4天和第5天有高量表達。經原核表達、蛋白純化及免疫小鼠后獲得家蠶BmBrat多克隆抗體，且Western blotting及免疫熒光檢測顯示該抗體可以特異檢測家蠶BmBrat蛋白；免疫熒光結果表明BmBrat蛋白定位于家蠶血細胞胞質中，為進一步研究BmBrat基因的生物學功能奠定了基礎。

關鍵詞:家蠶，BmBrat基因，表達譜，抗體制備，亞細胞定位

Received: July 17, 2015; Accepted: November 14, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81201551), the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. 20130182110003), the Natural Science Foundation of Chongqing (No. CSTC2013jcyjys0007), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. XDJK2013B020, SWU111014).

國家自然科學基金 (No. 81201551)，高等學校博士學科點專項科研基金 (No. 20130182110003)，重慶市科委自然科學院士基金 (No. CSTC2013jcyjys0007)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金 (Nos. XDJK2013B020, SWU111014) 資助。

NHL家族的名字源于發(fā)現(xiàn)的3個成員：NCL-1、HT2A和LIN-41，這3個因子與RNA代謝有關系，可能參與轉錄后基因的表達調控[1]。研究表明，NHL家族的成員均含有3個保守的基序：1個RING、1個或是2個B-box和1個coiled-coil[2]。在調節(jié)Brat (Brain tumor) 蛋白的活性中NHL結構起了至關重要的作用[3]。Brat本身是一類腫瘤抑制基因，但同時也是一個控制細胞增殖的候選基因，屬于NHL蛋白家族的成員[4]。在果蠅神經系統(tǒng)中，Brat的表達在很大程度上限制了胚胎時期周圍神經系統(tǒng)、腹神經索和腦的發(fā)育[5]。在干細胞發(fā)生系統(tǒng)中，Brat 與Prospero、Numb等作為細胞命運決定因子，促進細胞命運的變化[6]。Numb是一種膜結合蛋白，參與Notch 信號通路的調控[7]。在神經前體細胞分裂期間，Numb聚集到細胞的一端，與細胞膜結合形成新月板，細胞分裂期間通過不對稱分裂進入神經節(jié)母細胞中，Numb蛋白結合α-泛素介導蛋白質活性調節(jié)因子Sanpodo抑制Notch蛋白[8-9]。Notch 信號通路在神經母細胞的增殖分化過程中起著至關重要的作用。Notch信號通路受到抑制可以使細胞從自我更新逐漸開始分化分裂[10]。而Prospero是轉錄調節(jié)蛋白，在胚胎和幼蟲的神經母細胞中均存在，最終在分化的膠質細胞中持續(xù)表達[11]，在決定細胞命運和細胞增殖調控中Prospero作為Brat下游的一個調控因子起著關鍵的作用。研究Brat在細胞分化和增殖中的作用，能為干細胞的分化提供理論依據。在人與哺乳動物中brat的同源蛋白是TRIM蛋白家族，它們在發(fā)育、分化和宿主細胞的抗病毒防御以及癌癥中都起到作用。TRIM家族是NHL結構域的一個亞群，該亞群包含哺乳動物的TRIM2、TRIM3、TRIM32和TRIM71等，包括果蠅中的Brat、Mei-p26、Abba 和Wech，以及秀麗隱桿線蟲中的Ncl-1、Nhl-1、Nhl-1、Nhl-3和Lin41[12]，其中TRIM3是一個腫瘤抑制因子，能結合到cdk抑制因子p21WAF1/CIP1，通過隔絕p21并阻止它積累Cyclin D1-CDK4抑制癌癥的發(fā)生[13-14]。在小鼠中降低TRIM3的表達將增加并加速血小板生長因子(PDGF，platelet-derived growth factor) 引起的神經膠質瘤發(fā)生率[15]。

家蠶是我國重要的經濟昆蟲，同時也越來越多地作為無脊椎模式動物進行研究。目前家蠶BmBrat基因未見報道，本研究利用RACE技術獲得BmBrat基因全長，通過誘導大腸桿菌原核表達獲得重組蛋白進而制備抗體，為更深入研究Brat基因在細胞增殖分化與個體發(fā)育中的作用奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料

實驗所用家蠶品種為大造，由西南大學家蠶基因庫提供。蠶卵在25 ℃相對濕度60%–80%下催青，孵化后幼蟲在25 ℃下桑葉飼育。感受態(tài)細胞購自全式金公司。質粒提取試劑盒購自Omega公司。膠回收試劑盒購自Axygen公司。Trizol試劑和RACE試劑盒購自Invitrogen公司。PMD19-T simple載體、限制性內切酶、Taq酶和T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司。反轉錄試劑購自Promega公司。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。多聚甲醛為上海生工生物工程公司產品。DAPI和抗熒光猝滅劑為碧云天生物技術公司產品。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成

取各發(fā)育時期的蠶卵和5齡3 d幼蟲的頭、體壁、血液、中腸、精巢、卵巢、馬氏管、脂肪體等組織器官，除血液直接加入Trizol外，其他組織經液氮研磨后加入Trizol，按照Invitrogen公司Total RNA操作指南提取總RNA。利用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計分別檢測RNA產物的完整性、純度和濃度。使用DNA酶在37 ℃消化30 min后，依照反轉錄試劑盒說明書反轉錄獲得cDNA。

1.2.2RACE法擴增全長序列

設計基因特異RACE引物GSP1、NGSP1、 GSP2、NGSP2，引物序列見表1。隨后按照RACE試劑盒進行5′RACE和3′RACE擴增。擴增產物經1%瓊脂糖電泳后，回收目的條帶，連接到PMD19-T simple載體上，轉化后提取陽性克隆，測序后進行拼接，獲得BmBrat基因全長cDNA序列。

1.2.3蛋白序列分析

拼接得到的序列在ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 網站進行ORF預測以及氨基酸序列翻譯。使用Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org)，SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)，SignalP 4.1 Serve (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)，ExPasy (http://www.expasy.org/tools/)等在線軟件預測蛋白結構域、分子量和等電點等信息。

1.2.4表達譜分析

分別以家蠶5齡3 d各組織及胚胎各發(fā)育時期cDNA為模板對BmBrat進行半定量PCR 檢測，檢測引物為BmBrat (引物序列見表1)，以肌動蛋白3 (BmActin3) 為內參[16]。PCR總反應體系為25 μL：10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，HiFi-Taq酶0.2 μL，模板1 μL，加滅菌的雙蒸水至總體積為25 μL。反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，共28個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增產物經1%瓊脂糖電泳，EB 染色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像進行分析。

1.2.5原核表達、蛋白純化及抗體制備

用軟件預測BmBrat的抗原特異性，截取部分片段設計引物Bmbrat-P2 (引物序列見表1)，將擴增產物連接到pET-32a載體上，獲得pET32a-BmBrat重組質粒。將重組質粒pET32a-BmBrat轉化到Rosetta感受態(tài)細胞，獲得單菌落并擴大培養(yǎng)，分別用0.6 mmol/L IPTG在15 ℃誘導12 h及37 ℃ 6 h后，收集菌液，超聲裂解離心分離上清和沉淀，然后進行SDS-PAGE檢測目的蛋白?？捡R斯亮藍染色分析蛋白在上清和沉淀中的表達情況，最終選擇37 ℃大規(guī)模誘導。振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，用0.6 mmol/L IPTG 37 ℃誘導表達6 h后，收集菌體，用PBS重懸，裂解后超聲破碎收集沉淀，尿素溶解后用0.45 μm濾膜抽濾進行Ni離子親和柱純化，使用不同咪唑濃度的洗脫液進行梯度洗脫，收集洗脫液后用SDS-PAGE分析蛋白純化情況。注射重組蛋白前利用谷胱甘肽稀釋還原法對其進行復性，加PBS將蛋白濃度稀釋至0.5 mg/mL，加入氧化型谷胱甘肽 (GSH) 至終濃度為2 mmol/L，同時加入還原性谷胱甘肽 (GSSG) 至終濃度為10 mmol/L，4 ℃復性過夜，PBS透析，PEG2000濃縮[17]。使用純化復性好的重組蛋白注射健康的成年雄性昆明小鼠3只，每只小鼠注射前剪尾尖取血，收集約50 μL正常血清，作為陰性對照，室溫靜置后離心收集上清，上清與甘油以1∶1的比例混合后于–80 ℃保存。小鼠進行免疫時每只腹腔注射5次蛋白，第一次與弗式完全佐劑等體積混合，后4次均與弗式不完全佐劑等體積混合，所用蛋白量依次為50、70、90、110和120 μg，前3次間隔10 d進行免疫，后2次間隔14 d免疫，最后1次免疫1周后，摘眼球取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min將血清取出，加入0.02%的NaN3后，–80 ℃中保存。

表1　引物列表Table 1 Primer list

1.2.6BmBrat抗體特異性檢測

將原核表達并純化得到的重組蛋白作為樣品，進行Western blotting檢測免疫血清的特異性。蛋白經SDS-PAGE電泳及轉膜后，于5%的牛奶封閉液中，室溫緩慢搖蕩封閉2 h。分別將免疫血清和免疫前血清以1∶1 000稀釋后于4 ℃孵育過夜。之后將膜用TBST洗3次，每次15 min，用1×TBST 稀釋二抗 (1∶5 000)，將PVDF膜浸沒于二抗液中，室溫緩慢搖蕩2 h。再次用TBST洗3次，每次10 min，用ECL顯色液進行顯色及用成像儀進行曝光。家蠶胚胎細胞系BME-SWU3鋪到有爬片的24孔板中，爬片過夜。使用4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton-100打孔15 min。室溫條件下用10%山羊血清封閉2 h后分別用免疫前血清和抗BmBrat的免疫血清，4 ℃孵育過夜。孵育完二抗漂洗后DAPI染色，使用抗熒光猝滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察檢測。

1.2.7血細胞定位BmBrat

將家蠶血細胞用4%多聚甲醛固定30 min，加入1% Triton-100靜置10 min后PBS漂洗。用10%山羊血清封閉液室溫封閉2 h，之后分別用免疫前血清和抗BmBrat的免疫血清4 ℃孵育過夜。孵育完二抗漂洗后DAPI染色，使用抗熒光猝滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察檢測。

2　結果

2.1家蠶BmBrat基因全長克隆與分析

從NCBI下載不同物種的Brat基因序列，并在家蠶基因組數據庫進行Blast分析以確定家蠶同源基因。以家蠶5齡3 d的頭部cDNA為模板進行PCR擴增。通過RACE技術，得到了3′端的序列和5′端的序列，連接到pMD19T- simple載體測序，拼接后獲得了3 614 bp全長序列，包括239 bp的5′UTR和795 bp的3′UTR，預測得到其ORF為2 580 bp，編碼859個氨基酸殘基，蛋白分子量為94.3 kDa，等電點為6.65 (圖1A–1C)。通過在線預測軟件進行結構域分析，家蠶的Brat蛋白質序列中存在1個保守的RING結構域，2個B-BOX結構域、1個保守的BBC結構域和3個連續(xù)的NHL結構域 (圖1C)。利用SignalP 4.1 Server預測，發(fā)現(xiàn)在N端區(qū)域沒有信號肽 (圖1D)。

圖1　BmBrat全長克隆及信息分析Fig. 1 Cloning and bioinformatic analysis of BmBrat. (A) Full-length cDNA was cloned by RACE method. (B) Diagram of BmGATA6 complete cDNA sequence was analyzed. (C) Analysis of BmGATA6 protein domain and amino acid sequence was presented. (D) BmBrat protein signal peptide was predicted.

2.2BmBrat基因在家蠶胚胎及幼蟲各組織表達譜

分別以等量的家蠶胚胎期1–9 d和幼蟲5齡3 d (L5D3) 各組織的cDNA為模板，以肌動蛋白3 (Actin3) 為內參進行半定量PCR檢測該BmBrat基因的表達情況。結果顯示BmBrat在胚胎4 d、5 d的時候高量表達，之后其表達量開始逐步下降 (圖2B)；而在L5D3幼蟲各組織中均有表達，其中卵巢和頭表達量最高，其次是絲腺、中腸、精巢和脂肪體，馬氏管和表皮中BmBrat表達量相對較低 (圖2A)。

2.3BmBrat的原核誘導表達

PCR擴增得到777 bp的片段用于構建原核表達載體 (圖3A-a)，結構如圖3B所示。將載體經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證，有777 bp的片段出現(xiàn) (圖3A-b)，與預期結果相符，表明已成功構建重組表達質粒pET32a-BmBrat。在37 ℃和15 ℃溫度下誘導表達重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)BmBrat重組蛋白都屬于包涵體，且在37 ℃誘導條件下，重組蛋白的表達量要比15 ℃條件下產生的多 (圖3C)，于是后續(xù)采用37 ℃的條件下進行BmBrat重組蛋白大量誘導。根據重組蛋白上的6×His標簽進行Western blotting檢測，證明其確實為目的蛋白 (圖3D-a)。經不同濃度的咪唑洗脫液進行梯度洗脫后，對流出液進行SDS-PAGE分析 (圖3D-b)，結果表明200 mmol/L與500 mmol/L咪唑洗脫液中只有目的蛋白大小的單一條帶，而沒有其他雜帶，滿足后續(xù)實驗要求。

2.4抗BmBrat血清檢測

在完成5次免疫后，通過摘除小鼠眼球的方法，獲取免疫血清。使用重組蛋白通過Western blotting分析免疫血清的特異性。結果顯示，BmBrat免疫血清能特異性地識別大腸桿菌誘導產生的重組BmBrat蛋白 (圖4B)。隨后又以小鼠免疫前的正常血清作為對照，利用免疫血清對家蠶細胞系BME-SWU3進行免疫熒光檢測。對照組中無熒光信號，但是實驗組細胞中可以檢測到BmBrat蛋白的表達 (圖4A)。以上結果說明我們所制備的BmBrat抗體可以特異性識別BmBrat蛋白，可為后續(xù)研究BmBrat基因的功能提供抗體支持。

2.5Bmbrat蛋白在家蠶血細胞定位

前面的實驗結果顯示BmBrat在家蠶細胞系中有表達，為了進一步了解BmBrat的表達情況及其可能發(fā)揮的作用，我們對其在家蠶血細胞中的定位進行了分析。免疫熒光結果顯示，與使用陰性血清的對照組相比，實驗組中可以明顯檢測到熒光信號，即家蠶血細胞中有BmBrat蛋白的表達，并且該蛋白只表達于部分血細胞的細胞質中 (圖5)。

圖3　重組蛋白pET32a-BmBrat的誘導表達與純化Fig. 3 Induction and purification of recombinant protein pET32a-Bmbrat. (A) Construction of the BmBrat prokaryotic expression vector. (a) M: DNA marker; 1: PCR products. (b) M: DNA marker; 1: pET32a-BmBrat plasmid digested with EcoRⅠand XhoⅠ. (B) Structure of BmBrat prokaryotic expression vector. (C) The recombinant Bmbrat protein was induced with IPTG at 15 ℃ or 37 ℃. M: protein marker; 1,5: the induction of BmBrat with 0 mmol/L IPTG at 15 ℃ in supernatant and cell pellet respectively; 2,6: the induction of BmBrat with 0.6 mmol/L IPTG at 15 ℃ in supernatant and cell pellet respectively; 3,7: the induction of BmBrat with 0 mmol/L IPTG at 37 ℃ in supernatant and cell pellet respectively; 4,8: the induction of BmBrat with 0.6 mmol/L IPTG at 37 ℃ in supernatant and cell pellet respectively. (D) a) Detection of recombinant BmBrat protein by His tag antibody. b) Purification of the BmBrat recombinant protein. M: protein marker; 1: 100 mmol/L imidazole; 2: 120 mmol/L imidazole; 3: 200 mmol/L imidazole; 4: 500 mmol/L imidazole.

圖4　抗BmBrat血清檢測Fig. 4 Detection of anti-BmBrat serum. (A) BmBrat protein in silkworm cell line BME-SWU3 was detected by Immunofluorescence with anti-BmBrat serum and negative control. (B) Recombinant BmBrat protein was detected by Western blotting with anti-BmBrat serum. M: protein marker; 1: the purified recombinant BmBrat protein.

圖5　Bmbrat蛋白在家蠶血細胞中定位分析Fig. 5 Subcellular localization of BmBrat protein was analyzed in hemocytes with immunofluorescence staining.

3　討論

本實驗首先通過在NCBI和家蠶數據庫中檢索，獲得家蠶中Brat同源基因BmBrat。利用RACE技術得到該基因的全長。通過信息學分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白有4個相對保守的結構域，從N端到C端分別是1個RING、2 個B-Box和1個BBC結構域，具有典型的NHL結構域，暗示其可能在細胞的增殖分化中發(fā)揮功能[2]。對BmBrat在家蠶胚胎時期的表達譜分析中發(fā)現(xiàn)，該基因表達量在第4、5天達到高峰，之后逐天下降。蠶卵的催青期約需10 d，其間胚胎發(fā)育時期依次分為最長期、肥厚期、突起發(fā)生期、突起發(fā)達前期、突起發(fā)達后期、縮短期、反轉期、反轉終了期、氣管顯現(xiàn)期、點青期、轉青期，之后便孵化收蟻[18]。其中前6天即到反轉期屬于胚胎的器官形成時期，而4、5 d時處于突起發(fā)達期和縮短期，是器官形成的高峰，這一時期該基因高表達，到了第6天后器官發(fā)育基本完成，這時該基因的表達也出現(xiàn)了顯著下降。這表明BmBrat與家蠶胚胎發(fā)育過程中器官形成有關。而5齡3 d幼蟲各組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)，該基因在各組織中均有明顯表達，且在生殖腺和頭部表達量最高，這表示BmBrat在家蠶各組織的發(fā)育與生長中具有一定的功能。研究表明，在果蠅中Brat在正在分化的生殖細胞中有多種功能。已知生殖干細胞的維持是受Dpp信號途徑[19]和翻譯抑制因子Nanos (Nos)/Pumilio (Pum) 所調控的[20]。在卵巢中，Pum-Nos調節(jié)Brat的mRNA水平，限制其在包囊干細胞中的表達[21]。增大Dpp信號，能夠促進Pum-Nos對Brat mRNA生成的抑制作用[22]。在分裂過程中，Dpp信號途徑沉默，Dpp信號的減少使Nos下調，從而促進Brat的表達，與Pum形成新的復合物抑制了Dpp信號途徑中的Mad和dMyc mRNAs，降低了包囊干細胞對Dpp信號的反應能力，促進細胞分化[23]，使這個子細胞變成分化的包囊干細胞，另一個子細胞繼續(xù)接受Dpp自我更新的信號[24]。家蠶BmBrat是否具有類似功能還有待進一步研究。另外，利用我們自制的BmBrat抗體在家蠶血細胞中對BmBrat蛋白進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白只存在于部分血細胞中，且只在細胞質中表達。家蠶血細胞有原血球細胞 (Prohemocyte)、小球細胞 (Spherule cell)、擬絳色細胞 (Oenocytoid)、顆粒細胞 (Granular cell) 和漿細胞 (Plasmatocyte) 5類[25]，BmBrat只在部分細胞中表達，其是否與血細胞的分化有關也值得進一步研究。后續(xù)我們將利用不同種類血細胞的特異性分子標記，探索該蛋白具體存在于哪一類或幾類血細胞中，有助于更好地揭示其功能。綜上所述，BmBrat作為一個新基因至今鮮有報道，功能尚不清楚，猜測其與細胞增殖分化相關。本研究成功制備了BmBrat多克隆抗體，為后續(xù)實驗提供了抗體工具。

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(本文責編郝麗芳)

生物技術與方法

Cloning and characterization of BmBrat in silkworm, Bombyx mori

Hanghua Liang, Hongyan Gao, Man Xu, Peng Tan, and Hongjuan Cui
State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China

Abstract:NHL proteins, which play important roles in regulation of cell proliferation and differentiation, have beenextensively studied on mammals. Here, we cloned a member of NHL protein family namely BmBrat in silkworm. The full-length cDNA sequence of BmBrat was obtained by means of the rapid amplification of cDNA ends (RACE), including 3 614 bp. The ORF is 2 580 bp long, encoding a protein with 859 amino acid residues. The molecular weight is 94.3 kDa and the isoelectric point (pI) is 6.65. The BmBrat expression profile was detected by RT-PCR at L5D3 larval stage, and it was expressed in all tissues, including silk gland, midgut, fat body and malpighian tubule. However, it was highly expressed in ovary and head. The expression profile was also detected at different stage of embryo development, and reached a peak at the 4th and 5th days of the embryonic period. Anti-BmBrat polyclonal antibody was generated following prokaryotic expression, protein purification and mice immunization, which is highly specific and effective for recognizing BmBrat protein through Western blotting and immunofluorescence staining. Subcellular localization of BmBrat in hemocytes revealed that it was specifically expressed in cytoplasm. This study provides a foundation for further research of the biological function of BmBrat gene.

Keywords:Bombyx mori, BmBrat gene, expression profile, antibody preparation, subcellular localization

Corresponding author:Hongjuan Cui. Tel: +86-23-68251713; Fax: +86-23-68251128; E-mail: Hongjuan.cui@gmail.com