張盼盼 鄭寧 張翠 劉玉倩 王海濤

河北師范大學(xué)體育學(xué)院人體運(yùn)動生物信息測評重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（石家莊 050024）

有氧運(yùn)動對12月齡大鼠腓腸肌PGC-1α/Sirt3的影響

張盼盼 鄭寧 張翠 劉玉倩 王海濤

河北師范大學(xué)體育學(xué)院人體運(yùn)動生物信息測評重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（石家莊 050024）

目的：探討運(yùn)動預(yù)防增齡性骨骼肌衰減中去乙酰化酶3（Sirtuin3，Sirt3）的調(diào)控機(jī)制，為運(yùn)動預(yù)防肌肉衰減提供理論依據(jù)。方法：20只12月齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組（CG）和運(yùn)動組（EG，15 m/ min，第1周30 min/d，每周遞增5min，跑臺坡度為5%，6 d/w，4 w），每組10只。腓腸肌切片HE染色計(jì)算橫截面積百分比；測定大鼠腓腸肌Mn-SOD、MDA含量；ELISA法測定8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2deoy?guanosine，8-OHdG）含量；Western Blot法檢測大鼠腓腸肌細(xì)胞內(nèi)Sirt3和PGC-1α蛋白含量變化。結(jié)果：（1）HE染色的組織切片中運(yùn)動組大鼠腓腸肌所占面積百分比顯著高于對照組（P＜0.05）。（2）運(yùn)動組大鼠腓腸肌Mn-SOD活性高于對照組（P＜0.01）；MDA、8-OHdG含量低于對照組（P＜0.05，P＜0.01）；（3）運(yùn)動組大鼠腓腸肌PGC1-α和Sirt3蛋白表達(dá)量高于對照組（P＜0.01）。結(jié)論：適度有氧運(yùn)動通過促進(jìn)12月齡大鼠腓腸肌PGC1-α和Sirt3蛋白表達(dá)，提高抗氧化酶活性，減輕骨骼肌過氧化損傷，預(yù)防增齡性骨骼肌衰減。

有氧運(yùn)動；增齡性骨骼肌衰減；去乙酰化酶3

衰老會導(dǎo)致骨骼肌結(jié)構(gòu)與功能的退化，這與骨骼肌細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增齡性聚積密切相關(guān)。近年研究表明定位于細(xì)胞線粒體中的去乙?；?（Sirtuin3，Sirt3）與細(xì)胞能量代謝、氧化應(yīng)激密切相關(guān)。Sirt3是過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α（peroxisome proliferators activated receptor-gamma coactivator 1 α，PGC-1α）的下游靶基因，可對細(xì)胞ROS的生成與線粒體生物合成產(chǎn)生影響。已有研究證實(shí)運(yùn)動能提高骨骼肌的機(jī)能，增加骨骼肌的質(zhì)量與力量[1]。過表達(dá)的Sirt3和PGC-1α可以抑制體外培養(yǎng)的肌細(xì)胞中的ROS水平[2]。雖然確切的分子機(jī)制還尚未明確，但是增齡相關(guān)的Sirt3和PGC-1α的含量的下降會增加細(xì)胞的氧化損傷，引起基因突變、線粒體功能的退化和肌肉萎縮等[3]。Sirt3是否參與了運(yùn)動預(yù)防增齡性骨骼肌衰減的過程，尚需深入研究。本研究旨在通過對12月齡的大鼠進(jìn)行有氧運(yùn)動，測定其腓腸肌Sirt3和PGC-1α蛋白含量、DNA損傷和抗氧化能力的變化，探討PGC-1α/Sirt3通路在運(yùn)動預(yù)防骨骼肌增齡性衰減的作用，為運(yùn)動預(yù)防衰老提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 動物分組和運(yùn)動方案

20只12月齡清潔級健康雄性SD大鼠（山東魯抗醫(yī)藥公司），體重500±40 g，許可證號：SCXK魯20080002。實(shí)驗(yàn)大鼠單籠飼養(yǎng)，不限制飲食，每天12 h自然光照，動物房內(nèi)溫度平均23℃～28℃，相對濕度為50% ±5%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)將其分為對照組（control group，CG）和運(yùn)動組（exercise group，EG），每組10只。運(yùn)動組大鼠進(jìn)行為期4周的跑臺運(yùn)動，每周訓(xùn)練6天，跑臺速度為15 m/min，正式實(shí)驗(yàn)第1周每天訓(xùn)練30 min，此后每周遞增5 min，跑臺坡度為5%（運(yùn)動強(qiáng)度約為50%～60%VO2max[4-6]）。為了研究運(yùn)動預(yù)防骨骼肌增齡性衰老中Sirt3的作用，本研究選用的是處于老齡前的12月齡大鼠。

1.2 指標(biāo)檢測

1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.5 ml/100 g），取腓腸肌外側(cè)頭浸泡于4%多聚甲醛中固定；取另一腓腸肌外側(cè)頭投入液氮，以備其它指標(biāo)測定。常規(guī)石蠟包埋，制作腓腸肌切片（6 μm），常規(guī)蘇木精-伊紅染色（HE染色），采用北航圖像分析系統(tǒng)對所有圖片進(jìn)行肌細(xì)胞橫截面積百分比計(jì)算。每張切片取左上、右上、左下、右下以及中心點(diǎn)五點(diǎn)統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)每張切片中肌細(xì)胞所占面積與整個視野面積的百分比[7-8]。

提取骨骼肌線粒體，檢測Mn-SOD、MDA及8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2deoyguanosine，8-OHdG）含量測定的試劑盒由南京建成生物科技公司提供，檢測方法均按照說明書的步驟進(jìn)行操作。

采用Western Blot法進(jìn)行Sirt3和PGC-1α蛋白含量的測定，首先Bradford法測定腓腸肌總蛋白濃度，再進(jìn)行SDS-PAGE電泳，其中加入1∶3000的Sirt3抗體（Santa Cruz）、1∶3000的PGC-1α抗體（Santa Cruz）、β-actin抗體（Santa Cruz）的兔抗大鼠蛋白的一抗，4℃過夜，洗膜后加入1∶5000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG）?；瘜W(xué)發(fā)光法統(tǒng)計(jì)目的蛋白與βactin的MaxOD比值。實(shí)驗(yàn)在河北師范大學(xué)人體信息測評重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），組間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有顯著性，P＜0.01表示差異具有高度顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重和肌細(xì)胞橫截面積比較

與對照組相比，運(yùn)動組大鼠體重上升趨勢平緩，且經(jīng)過4周運(yùn)動大鼠體重也無明顯上升，運(yùn)動組大鼠體重小于對照組大鼠（P＜0.05）。對照組大鼠腓腸肌細(xì)胞呈現(xiàn)松散、不規(guī)則排列等特點(diǎn)，細(xì)胞核內(nèi)移；而運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞排列較為整齊、規(guī)則，細(xì)胞核皆位于細(xì)胞邊緣。見表1、圖1。

表1 各組大鼠體重和肌細(xì)胞橫截面積比較（n=10）

圖1 大鼠骨骼肌HE染色（×100）

2.2 各組大鼠腓腸肌過氧化水平比較

運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞Mn-SOD活性高于對照組（P＜0.01）；運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞MDA含量低于對照組（P＜0.05）；運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞8-OHdG含量低于對照組（P＜0.01）。見表2。

表2 大鼠腓腸肌Mn-SOD活性、MDA含量及8-OHdG含量（n=10）

2.3 Sirt3與PGC-1α蛋白結(jié)果

運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞Sirt3蛋白含量（0.94± 0.09）明顯高于對照組（0.68±0.07）（P＜0.01）；運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞PGC1-α蛋白含量（1.75±0.26）明顯高于對照組（1.36±0.24）（P＜0.01），統(tǒng)計(jì)結(jié)果呈現(xiàn)非常顯著性差異。見圖2。

圖2 Western Blot法測得大鼠腓腸肌細(xì)胞Sirt3 及PGC1-α蛋白（n=10）

3 討論

3.1 有氧運(yùn)動對12月齡大鼠骨骼肌組織學(xué)的影響

骨骼肌細(xì)胞的橫截面積是骨骼肌是否發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能退化的重要指標(biāo)。衰老進(jìn)程中骨骼肌質(zhì)量會逐漸下降，伴隨著骨骼肌質(zhì)量的明顯下降，脂肪組織會漸漸增加[9]。經(jīng)過CT掃描，發(fā)現(xiàn)老年人四肢中的非肌肉組織（脂肪和其他組織）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于年輕人，老年人骨骼肌橫斷面積僅為年輕人的70%左右。超聲影像學(xué)表明老年人相比較年輕人，股四頭肌橫斷面積減小了25%～35%，非肌肉組織增加了59%[10]。本研究結(jié)果顯示，4周跑臺運(yùn)動后12月齡大鼠的腓腸肌細(xì)胞橫截面積百分比高于對照組，說明有氧運(yùn)動增加了大鼠骨骼肌的含量，運(yùn)動可有效預(yù)防骨骼肌的增齡性衰減。HE染色觀察組織切片表明，4周運(yùn)動有氧運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞核多位于細(xì)胞邊緣，且肌纖維排列緊密、整齊。而隨著年齡的增長，對照組大鼠出現(xiàn)肌纖維萎縮，組織學(xué)主要表現(xiàn)為出現(xiàn)小角化纖維、細(xì)胞橫切面圓形化、細(xì)胞核內(nèi)移等，這與相關(guān)衰老骨骼肌的組織學(xué)特征一致[11]。

3.2 有氧運(yùn)動對腓腸肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

Mn-SOD存在于生物體細(xì)胞的線粒體中，能更好地清除超氧自由基，抵御氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞Mn-SOD活性高于對照組，說明中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動有效地提高了運(yùn)動組大鼠腓腸肌的抗氧化能力，使細(xì)胞減少ROS損害。這與以往長時間的耐力運(yùn)動提高組織Mn-SOD活性的研究一致[12-14]。

MDA的含量高低與細(xì)胞受ROS攻擊及損傷的程度成正比[15]。運(yùn)動對骨骼肌細(xì)胞MDA含量的影響通常會與運(yùn)動類型相關(guān)。力竭運(yùn)動會引起大鼠骨骼肌細(xì)胞過氧化增強(qiáng)，MDA含量明顯增加[16]。長期適量的運(yùn)動才可以有效降低骨骼肌細(xì)胞MDA的含量[17-18]。本研究顯示，4周有氧運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞MDA含量低于對照組，這主要是由于有氧運(yùn)動后增加的Mn-SOD活性有效地降低了老齡大鼠的MDA，說明有氧運(yùn)動能有效地保護(hù)老齡大鼠骨骼肌細(xì)胞，使其所受的氧化應(yīng)激損傷得到緩解。

8-OHdG可以用來評價生物體細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷的程度[19]，近年被應(yīng)用到關(guān)于衰老及退行性疾病的研究中。有學(xué)者提出線粒體DNA（mtDNA）更容易遭受氧化損傷，其誘發(fā)因素是8-OHdG的聚積進(jìn)而引發(fā)的堿基的損害[20]。本研究顯示，4周的跑臺運(yùn)動干預(yù)后，運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞線粒體8-OHdG含量低于對照組，這說明運(yùn)動可以減少mtDNA的氧化損傷，保持肌細(xì)胞線粒體功能和結(jié)構(gòu)的完整，緩解骨骼肌的衰減，這與組織學(xué)的研究結(jié)果一致。

3.3 有氧運(yùn)動對大鼠腓腸肌細(xì)胞Sirt 3和PGC-1α蛋白含量的影響

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過4周的跑臺運(yùn)動后，大鼠腓腸肌細(xì)胞Sirt3和PGC-1α蛋白含量均有所上升。PGC-1α作為細(xì)胞能量代謝的重要的調(diào)節(jié)因子，在骨骼肌細(xì)胞呼吸及其細(xì)胞與線粒體的能量生成中發(fā)揮重要的作用[21]。研究結(jié)果表明運(yùn)動能夠誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞PGC-1α表達(dá)量上升。過表達(dá)的PGC-1α可以促進(jìn)Sirt3的表達(dá)，PGC-1α基因敲除的小鼠其Sirt3的表達(dá)也有所降低[2]。這與實(shí)驗(yàn)中4周有氧運(yùn)動后大鼠腓腸肌細(xì)胞Sirt3上升是一致的。

Sirt3可以通過控制線粒體中活性氧ROS的產(chǎn)生調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原平衡[22]。Sirt3基因敲除小鼠骨骼肌肌細(xì)胞ROS生成量有顯著增加[23]，并且線粒體Sirt3能夠通過增強(qiáng)Mn-SOD的活性來提升機(jī)體的線粒體ROS的清除能力[24]。同時，轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a經(jīng)Sirt3去乙?；饔煤?，進(jìn)入細(xì)胞核，可以提高抗過氧化氫酶（CAT）及Mn-SOD的mRNA的表達(dá)水平，并抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積[25-26]。本研究結(jié)果表明，4周跑臺運(yùn)動促進(jìn)了大鼠腓腸肌線粒體內(nèi)Mn-SOD的表達(dá)，Mn-SOD通過歧化反應(yīng)抑制自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進(jìn)而維持體內(nèi)的自由基平衡，避免在衰老進(jìn)程中細(xì)胞氧化應(yīng)激水平失衡，造成肌細(xì)胞損傷。運(yùn)動組大鼠腓腸肌細(xì)胞線粒體8-OHdG含量、MDA降低也證實(shí)其受到的過氧化損傷較輕。

4 結(jié)論

有氧運(yùn)動通過促進(jìn)12月齡大鼠骨骼肌PGC-1α/ Sirt3通路，增強(qiáng)骨骼肌Mn-SOD的表達(dá)，提高抗過氧化能力，保護(hù)骨骼肌細(xì)胞免受氧化損傷，進(jìn)而預(yù)防骨骼肌增齡性衰減。但關(guān)于運(yùn)動激活的Sirt3通路是否能逆轉(zhuǎn)衰老大鼠（20月齡）的骨骼肌衰減及運(yùn)動對青年鼠和衰老鼠在Sirt3激活中是否存在差異還需深入探討。

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Effects of Aerobic Exercises on PGC-1α/Sirt3 in Gastrocnemius of 12-month-old Rats

Zhang Panpan，Zheng Ning，Zhang Cui，Liu Yuqian，Wang Haitao
College of Physical Education，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China

Wang Haitao，Email：haitaoyq@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of aerobic exercises on the expression of PGC-1α and Sirt3 in gastrocnemius of aging rats，and explore the molecular mechanism of alleviating age-relat?ed muscle atrophy through exercises.MethodsTwenty male Sprague-Dawley rats were randomly divid?ed into a control group（CG）and an exercises group（EG），each of 10.The rats in EG underwent 4 weeks of 5%-gradient treadmill exercises at 15m/min，six days a week.They were trained 30min for the first week，with an increase of 5min for each week.The slices of their gastrocnemius were given he?matoxylin-eosin dying to evaluate the crosscut area percentage.The contents of Mn-SOD and MDA of gastrocnemius were observed using ultraviolet spectrophotometry，and the content of 8-OHdG was mea?sured using ELISA kits.The protein levels of Sirt3 and PGC1-α were examined using Western blot?ting.Results（1）The percentage of gastrocnemius cross-sectional area of EG was significantly higher than that of the CG（P＜0.05）.（2）The activity of Mn-SOD was significantly higher in EG than CG（P＜0.01），but the average contents of MDA（P＜0.05）and 8-OHdG（P＜0.01）of EG were significantly lower than the latter.（3）The expression of Sirt3 and PGC1-α in gastrocnemius increased significantly after 4-week running（P＜0.01）.ConclusionProper aerobic exercises can promote the expression of PGC1-α and Sirt3，increased antioxidase activities and relieve peroxidation damage in 12-month-old rats，which serves to prevent age-related muscle atrophy.

aerobic exercises，age-related muscle atrophy，Sirt3

2016.03.08

河北省自然基金（C2013205026）；河北師范大學(xué)重點(diǎn)基金（L2013Z08）；河北省體育教育訓(xùn)練學(xué)重點(diǎn)學(xué)科資助

王海濤，Email：haitaoyq@126.com