楊永杰 高麗 章嵐 陳萬 李向東 陳巖 王朝暉 沈東穎

1 山東體育學(xué)院（濟(jì)南 250102）

2 山東省千佛山醫(yī)院

運動對生長期大鼠外周血單個核細(xì)胞中wnt途徑相關(guān)骨重塑基因的影響

楊永杰1高麗1章嵐1陳萬1李向東2陳巖1王朝暉1沈東穎1

1 山東體育學(xué)院（濟(jì)南 250102）

2 山東省千佛山醫(yī)院

目的：研究水平跑臺訓(xùn)練后生長期大鼠外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中wnt信號途徑的Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2 mRNA表達(dá)水平，揭示其與骨重塑的關(guān)系。方法：24只2月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分成對照組（n=12）和運動組（n=12），運動組以25 m/min，50 min/d，5 d/w水平跑臺運動12 w；訓(xùn)練結(jié)束進(jìn)行大鼠體重、全身肌肉含量、整體BMD和BMC檢測，股骨BMD和骨形態(tài)學(xué)測量，Micro-CT掃描觀察股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)；分離PBMC，QRT-PCR檢測其Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2 mRNA表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，運動組大鼠除了體重顯著下降外，全身肌肉含量、整體BMD、BMC和股骨BMD增加，但均不具有統(tǒng)計學(xué)意義；股骨長度、厚度和寬度均無顯著性變化；股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)除骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁分離度（Tb.Sp）無顯著性變化外，骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）顯著增加（P＜0.05），骨表面積和體積比（BS/BV）及骨小梁模式因子（Tb.Pf）顯著降低（P＜0.05）；股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨小梁數(shù)量增多，小梁間隔小、斷裂少；大鼠PBMC中Msx2 mRNA表達(dá)上調(diào)，Jun、Mmp9和Cox-2 mRNA表達(dá)下調(diào)，Tnf無表達(dá)差異。結(jié)論：運動后PBMC中Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2 mRNA表達(dá)變化與骨重塑變化一致，提示上述基因可作為反映運動對骨重塑影響的候選分子標(biāo)記。

生長期大鼠；跑臺運動；PBMC；骨重塑；wnt

青春期是骨骼發(fā)育的關(guān)鍵時期，適宜的機(jī)械負(fù)荷是增加骨量最有效的方式之一。由于骨的重塑過程進(jìn)展緩慢，對骨量和骨密度的檢測不能實時反映運動對骨重塑的干預(yù)。目前分子標(biāo)記在實時預(yù)測骨重塑上更占優(yōu)勢，但體育鍛煉等機(jī)械應(yīng)力下能反映骨吸收和骨形成的分子標(biāo)記尚待研究。據(jù)報道原癌基因（c-Jun）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase，Mmp9）、前列腺素環(huán)氧合酶-2（Prostaglandin synthase 2，Ptgs 2或Cyclooxygenase-2，Cox-2）、腫瘤壞死因子α（Tumor ne?crosis factor-α，Tnf-α）和Msh同源異形基因2（Msh ho?meobox 2，Msx2）參與Wnt信號途徑，并對骨重塑起作用[1-3]。Wnt/β-catenin信號是骨合成的重要信號，該信號被阻斷可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。其中c-Jun和Cox2是wnt信號的下游靶基因[2]；Mmp9是反映骨重塑的關(guān)鍵酶[4]，通過Cox-2間接受到wnt信號的調(diào)控[3]；Tnf抑制Wnt通路介導(dǎo)的全身骨形成和局部骨修復(fù)[1]；Msx2增強(qiáng)Wnt信號促進(jìn)成骨分化[5]。

外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononucle?ar cell，PBMC）主要指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，與骨重塑密切相關(guān)[6，7]，與骨組織相比PBMC具有易獲得、創(chuàng)傷小、可反復(fù)獲取等優(yōu)點。目前應(yīng)力誘導(dǎo)PBMC基因表達(dá)改變[8-10]與骨重塑關(guān)系的研究多集中于細(xì)胞因子和免疫方面，研究對象多為各種原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松模型，以健康機(jī)體作為研究對象的很少。本研究以2月齡雄性SD大鼠作為研究對象，經(jīng)12周跑臺訓(xùn)練，研究大鼠骨密度、骨微結(jié)構(gòu)和股骨形態(tài)學(xué)變化，分離大鼠PBMC并檢測wnt信號途徑中Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2基因的mRNA表達(dá)，尋找PBMC中對運動敏感的骨重塑基因，為運動健骨提供形態(tài)學(xué)和分子水平的依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 動物分組

2月齡雄性SD大鼠24只，體重247.9±8.0 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，生產(chǎn)許可證SCXK（京）2009-0004，動物批號11401300010335，使用許可證SYXK（京）2011-0034。動物單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。環(huán)境溫度24±2℃，相對濕度55% ±5%，每天光照時間12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后隨機(jī)分為對照組（n=12）和運動組（n=12）。

1.2 運動方案

參照Bedford[11]運動負(fù)荷的制定標(biāo)準(zhǔn)制定運動方案。對照組自然籠養(yǎng)，運動組大鼠在動物跑臺（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，ZH-PT）上進(jìn)行水平跑訓(xùn)練12周：第1周從10 m/min，10 min/d，逐漸增加到15 m/min，30 min/d；第2周逐漸增加到15 m/min，40 min/d；第3周逐漸增加到20 m/min，50 min/d；第4周逐漸增加到25 m/min，50 min/d，維持25 m/min，50 min/ d這一強(qiáng)度至第12周，每周運動5 d。見表1。

表1 大鼠運動方案

1.3 股骨的獲取、骨密度檢測、股骨形態(tài)測量及骨微結(jié)構(gòu)觀察

最后一次運動訓(xùn)練結(jié)束后，利用雙能X射線骨密度儀（DEXA，XR-600）檢測大鼠體重、全身肌肉含量、整體骨密度（BMD）和骨礦含量（BMC）；并于運動結(jié)束24 h后，乙醚麻醉并處死大鼠，剝離右側(cè)股骨，測量離體股骨的遠(yuǎn)端骨密度（BMDff）和中端骨密度（BMDfm），股骨密度檢測如圖1所示。游標(biāo)卡尺（精確到0.02mm）測量股骨長度及股骨近端、中段和遠(yuǎn)端的厚度與寬度。用Skyscan1076 micro-CT掃描，將新鮮的股骨沿長軸平行于掃描床長軸放置，對距股骨遠(yuǎn)端2 cm的區(qū)域掃描，層間距18 μm。興趣區(qū)定位于股骨遠(yuǎn)端生長板剛消失后開始上方100層的區(qū)域范圍內(nèi)。以micro-CT自帶軟件進(jìn)行定量分析，獲得大鼠股骨松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)：骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume，BV/ TV，%）、骨表面積和體積比（bone surface area/bone vol?ume，BS/BV，μm-1）、骨小梁厚度（trabecularthickness，Tb. Th，μm）、骨小梁數(shù)量（trabeculae number，Tb.N，μm-1）、骨小梁分離度（trabecular spacing，Tb.Sp，μm）、骨小梁模式因子（trabeculae patternfactor，Tb.Pf，μm-1）。采用Spss11.1統(tǒng)計處理軟件對形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組指標(biāo)之間差異采用獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異顯著。

圖1 雙能X射線吸收法測量股骨骨密度的區(qū)域

1.4 外周血液PBMC提取、總RNA的提取和QRT PCR檢測

最后一次運動訓(xùn)練結(jié)束24 h后，腹主動脈取血。為平衡個體差異把同組的隨機(jī)5只大鼠血液等量充分混合后，取2 ml，加入3 ml大鼠 Ficoll-Paque（GE healthcare），室溫400×g水平離心20 min，吸取分離液層及單個核細(xì)胞層。D-PBS清洗2次，250×g離心10 min獲得純PBMC。

利用總RNA提取試劑盒RNeasy Fibrous Tissue （OMEGA）提取外周血PBMC的C-Bmix、L-Bmix總mRNA，用 DNAase處理清除基因組DNA，利用QUANT-IT RNA ASSAY KIT（invitrogen）質(zhì)檢（A260/ A280≥1.90；總量≥1 μg）。用Primer5.0軟件設(shè)計引物，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermen?tas）將純化的總RNA（500 ng）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 加0.5 uM primers，35個循環(huán)，溶解溫度60℃，以β-actin作為參照，在實時定量PCR儀（Bio-Rad）用SYBR-Green （Roche）進(jìn)行QRT-PCR，擴(kuò)增的mRNA水平用2-△△CT表示，且2-△△CT值＞2（或＜0.5）為表達(dá)具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 運動結(jié)束后兩組大鼠體重、肌肉含量、骨密度、骨礦含量和股骨形態(tài)的比較

由表2可知：12周水平跑臺訓(xùn)練后，運動組大鼠體重顯著低于對照組；整體BMD和BMC、股骨BMD（股骨遠(yuǎn)端骨密度和股骨中部骨密度）及全身肌肉含量高于對照組，但均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。股骨長度、厚度和寬度均略有變化，但都不具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果表明該強(qiáng)度的持續(xù)耐力運動對健康生長期雄性大鼠的全身肌肉含量、BMD、BMC及股骨形態(tài)影響不顯著。

表2 兩組大鼠體重、肌肉含量、骨密度、骨礦含量和股骨形態(tài)比較

2.2 大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨micro-CT掃描的骨微結(jié)構(gòu)觀察

通過Micro-CT掃描獲得大鼠股骨遠(yuǎn)端骨松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)2D結(jié)構(gòu)參數(shù)（見圖2），運動組股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的BV/ TV、Tb.Th和Tb.N均高于對照組，其中BV/TV和Tb.Th存在顯著差異（P＜0.05）；Tb.Sp有下降趨勢（P＞0.05），BS/ BV和Tb.Pf顯著性降低（P＜0.05）。

運動組和對照組大鼠股骨遠(yuǎn)端micro-CT骨掃描的二維切片圖（圖3）顯示，運動組股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨小梁排列呈密集網(wǎng)狀，骨小梁數(shù)量增多、小梁間隔小，骨小梁斷裂少，提示12周跑臺運動對骨微結(jié)構(gòu)有促進(jìn)作用。

2.3 QRT-PCR檢測Mmp9、Cox2、Jun、Tnf和Msx2基因mRNA 的表達(dá)變化

與對照組相比，運動組Jun、Mmp9和Cox2的mRNA表達(dá)下降，表達(dá)變化倍數(shù)分別為0.18（即降低5.56）、0.39（即降低2.56）和0.1（即降低10）；二組間Tnf的mRNA表達(dá)無顯著性差異，表達(dá)倍數(shù)為0.63（即降低1.58）；運動組Msx2的mRNA表達(dá)上調(diào)，表達(dá)變化倍數(shù)為12.67，其中Jun、Cox2和Msx2基因表達(dá)變化幅度大，表達(dá)變化倍數(shù)大于5倍。見表3。

表3 運動結(jié)束后大鼠PBMC中Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2的mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

3.1 跑臺運動對生長期大鼠體重、全身肌肉含量、BMD、BMC 和股骨形態(tài)的影響

對人和動物的實驗證明生長期合理的耐力運動均使骨形成增加。有研究證明成骨負(fù)荷主要源于肌肉的主動收縮而不是體重。本研究中運動組大鼠體重顯著下降，而全身肌肉含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義；骨密度和骨礦含量也均未檢測到有統(tǒng)計學(xué)意義的變化。推測在一定肌力范圍內(nèi)，成骨與破骨相對平衡，骨量不變。另外，峰值骨量主要受控于遺傳，運動可能只影響預(yù)期骨量最大值的最終獲得及獲得的速度，骨的力學(xué)強(qiáng)度增加是骨質(zhì)改善的本質(zhì)特征。除骨量外，骨小梁的結(jié)構(gòu)變化對骨強(qiáng)度起著重要作用。對大鼠股骨遠(yuǎn)端的Mi?cro-CT掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，水平跑臺訓(xùn)練后盡管股骨遠(yuǎn)端骨密度沒有發(fā)生顯著性變化，但其骨微結(jié)構(gòu)如骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨表面積和體積比及骨小梁模式因子都發(fā)生了顯著性變化（P＜0.05），骨微結(jié)構(gòu)改善。Ju等以尾吊致骨質(zhì)疏松的Wistar大鼠為模型，以25 m/min、60 min/d、5 d/w運動5 w，發(fā)現(xiàn)運動組大鼠右股骨骨密度、骨微結(jié)構(gòu)都有不同程度的改善[12]。我們的骨微結(jié)構(gòu)結(jié)果與Ju等報道的結(jié)果一致[12]。至于骨密度結(jié)果不同可能與測量部位、測量方法及動物年齡等因素的差異有關(guān)。在骨微結(jié)構(gòu)改善的同時骨骼長度及厚度協(xié)調(diào)增長，將對充分積累峰值骨量有利。為此，我們對股骨的長度形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果表明鍛煉沒有影響大鼠縱向骨生長，這與其他研究[13]一致。但也有運動抑制或增加縱向骨生長的不同報道。本實驗中股骨形態(tài)無顯著變化可能與負(fù)載條件以及動物年齡有關(guān)。本實驗對象為正常生長期的大鼠，各組大鼠骨骼在實驗過程中均在快速生長，運動對骨長度、厚度和寬度等的影響可能需要更長的時間才可檢測到。上述結(jié)果表明生長期大鼠跑臺訓(xùn)練后骨質(zhì)有所改善，同時也進(jìn)一步證明骨量、骨密度和骨形態(tài)等指標(biāo)的檢測靈敏度低，不能實時反映運動對骨重塑的干預(yù)。

3.2 跑臺運動后Jun、Mmp9、Cox2、Tnf 和Msx2 表達(dá)水平

核因子κB受體活化因子（receptor activator of nu?clear factor-κB，RANK）、細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）是決定骨量的重要因素。調(diào)節(jié)OPG/RANK/RANKL通路可維持骨重塑的動態(tài)平衡。Wnt/β-catenin信號是骨合成的重要信號，位于OPG/RANK/RANKL通路上游調(diào)節(jié)骨重塑?；騄un、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2參與Wnt途徑調(diào)節(jié)骨重塑過程[1-3，5]。

3.2.1 跑臺運動后Jun、Mmp9和Cox2表達(dá)水平對骨重塑的影響

Jun、Mmp9和Cox2是wnt信號的下游靶基因[2，3]。RANKL與受體結(jié)合激活c-Jun。Jun組成AP-1（fos/ Jun的二聚體），許多骨形成相關(guān)基因的啟動子序列中均含AP-1結(jié)合位點，在長骨生長過程中起重要作用。AP-1也調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化，參與破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因NFATc1的轉(zhuǎn)錄激活[14]。Mmp9是反映骨重塑的關(guān)鍵酶，發(fā)揮骨吸收作用[4]。Mmp9表達(dá)水平與骨吸收活性有關(guān)，抑制破骨細(xì)胞分化Mmp9表達(dá)降低。Mmp9因參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的細(xì)胞因子的蛋白水解間接地調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化[15，16]。Cox-2是合成前列腺素如PGE2等的限速酶。Cox-2/PGE-2/RANKL是骨吸收的重要信號之一。低濃度的 PGE-2促成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨形成；高濃度PGE-2促進(jìn)破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，刺激骨吸收，其劑量受 Cox-2的調(diào)節(jié)[17-19]。

運動等應(yīng)力刺激促進(jìn)骨重塑。體內(nèi)、體外實驗表明機(jī)械負(fù)荷可以激活 Wnt/β-catenin信號[20，21]，促使下游目的基因 Cox-2、c-Fos、c-Jun等表達(dá)[2]。骨組織的成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)Cox-2，調(diào)節(jié)PGE2對骨發(fā)揮作用。長期持續(xù)應(yīng)力和過度應(yīng)力刺激作用下，Cox-2/PGE-2生成呈正反饋積累，高濃度的PGE-2刺激成骨細(xì)胞分泌大量的 RANKL，導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨強(qiáng)度下降，骨損傷易感性增高。同時c-Jun和c-Fos通過Wnt/β-catenin信號激活，也被大量表達(dá)，參與破骨細(xì)胞的分化。有報道Cox-2高表達(dá)可通過刺激血小板活化因子而誘導(dǎo)Mmp 9表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，啟動骨吸收[3]。在本實驗中，運動組大鼠PBMC 中Jun、Mmp9和Cox-2的mRNA表達(dá)均下降。這可能是運動組大鼠對應(yīng)力刺激敏感性下降，覓食活動等低強(qiáng)度的機(jī)械應(yīng)力刺激對Cox-2生成的刺激能力減弱。同時運動結(jié)束24 h后，運動訓(xùn)練刺激誘導(dǎo)的促破骨的基因表達(dá)效應(yīng)消失，導(dǎo)致Jun、Mmp9和 Cox-2的mRNA表達(dá)下降。 Cox-2表達(dá)的下降可通過降低PGE-2促進(jìn)骨形成。這在骨微結(jié)構(gòu)改善中得以證實。

3.2.2 跑臺運動后Tnf 表達(dá)水平對骨重塑的影響

Tnf-α是由單核巨噬細(xì)胞釋放的骨吸收細(xì)胞因子，對成骨細(xì)胞有抑制作用[22]。Dickkopf1（Dkk1）是Wnt信號通路的天然拮抗物。Dkk1過表達(dá)可減少OPG的表達(dá)，從而增強(qiáng)RANKL發(fā)揮誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的生物學(xué)效應(yīng)。據(jù)報道Tnf可誘導(dǎo)DKK-1表達(dá)，抑制通過Wnt通路介導(dǎo)的全身骨形成和局部骨修復(fù)[1]。Tnf可促進(jìn)RANKL表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和活化[22]。不同運動負(fù)荷對Tnf-α的影響有不同觀點，Bernecker等[23]的研究發(fā)現(xiàn)運動引起血漿Tnf-α升高，而外周血單個核細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)水平在運動前后則無顯著性差異，提示血漿內(nèi)TNF-α升高與外周血單個核細(xì)胞無關(guān)。另有報道[10]普拉提運動后PBMC的Tnf-α表達(dá)升高。這種研究結(jié)果的不同可能與運動強(qiáng)度有關(guān)。低于閾值的強(qiáng)度Tnf-α mRNA表達(dá)不升高[24]。只要高于閾值的強(qiáng)度才能使Tnf-α mRNA表達(dá)相應(yīng)運動而增加。我們用QRT-PCR沒有在外周血中檢測到Tnf-α mRNA表達(dá)變化，可能與運動強(qiáng)度和檢測時間有關(guān)；另外，本實驗沒有對血漿Tnf-α進(jìn)行檢測，在該實驗條件下血漿Tnfα變化與骨重塑及其在PBMC中表達(dá)量之間的關(guān)系尚需研究。Tnf-α mRNA表達(dá)水平揭示運動后24 h骨吸收不占優(yōu)勢，這與骨質(zhì)改善相符合。

3.2.3 跑臺運動后Msx2表達(dá)水平對骨重塑的影響

Msx2可通過減少Dkk1的表達(dá)調(diào)節(jié)骨發(fā)育，以增強(qiáng)Wnt信號促進(jìn)成骨分化[5]。據(jù)報道Msx2在骨形成的早期階段起作用，在骨形成的后期作用則減少[25]。在體外，Msx2促進(jìn)干細(xì)胞的成骨。Msx2轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細(xì)胞數(shù)量增加，骨形成增加[5]。應(yīng)力刺激影響Msx2表達(dá)的研究尚少。據(jù)研究Msx2對張壓應(yīng)力作用敏感，周期性張應(yīng)力可以抑制牙周膜干細(xì)胞 Msx2 mRNA表達(dá)[26]。但牙周膜在機(jī)械應(yīng)力作用后的恢復(fù)期牙周成纖維細(xì)胞，成牙骨質(zhì)以及成骨細(xì)胞的Msx2隨著時間的推移表達(dá)增強(qiáng)，在機(jī)械應(yīng)力后24 h后成骨細(xì)胞依然表現(xiàn)出較強(qiáng)Msx2表達(dá)[27]。與已有報道一致，我們檢測到運動后24 h PBMC中Msx2 mRNA表達(dá)增加，表明此時機(jī)體內(nèi)環(huán)境有利于骨形成，這與骨微結(jié)構(gòu)結(jié)果相符合。

由上可知，PBMC中Tnf、Jun、Mmp9、Cox2和Msx2 mRNA表達(dá)不管是上調(diào)、下調(diào)，還是無顯著性表達(dá)差異，都與骨質(zhì)變化相符。其中Jun基因表達(dá)變化超過5倍，Cox2和Msx2基因表達(dá)變化≥10倍。本實驗沒有檢測到運動對骨量、骨密度及骨形態(tài)等產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)意義上的變化。PBMC中Tnf、Jun、Mmp9、Cox2和Msx2表達(dá)水平能夠更靈敏反映運動對骨重塑的影響。但上述基因表達(dá)對運動的敏感性及其與骨重塑的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。此外，我們對運動后PBMC中Jun、Mmp9、Cox2和Msx2的mRNA表達(dá)與骨重塑的關(guān)系進(jìn)行了報道。PBMC取材具有易獲得、創(chuàng)傷小、可反復(fù)獲取的優(yōu)點，該研究為運動影響骨重塑的組織取材提供了思路，也為運動影響骨重塑提供了分子生物學(xué)資料。

4 總結(jié)

生長期大鼠跑臺運動12 w后BMD、BMC、股骨形態(tài)變化不明顯；而骨微結(jié)構(gòu)顯示骨小梁排列密集，骨小梁數(shù)量增多、小梁間隔小，骨小梁斷裂少，表明運動訓(xùn)練后骨質(zhì)改善。本實驗結(jié)果表明骨密度和骨形態(tài)等指標(biāo)在運動對骨重塑的干預(yù)中靈敏度低。目前分子標(biāo)記在實時預(yù)測骨重塑上更占優(yōu)勢，機(jī)械應(yīng)力下能反映骨吸收和骨形成的分子標(biāo)記尚待研究。PBMC中wnt信號途徑的基因Tnf、Jun、Mmp9、Cox2和Msx2的QRTPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動后24 h破骨細(xì)胞的活性減弱，骨重塑以骨形成為主，這與骨微結(jié)構(gòu)變化相吻合，表明運動后PBMC中上述基因的表達(dá)變化與骨重塑變化相一致，提示上述基因可作為反映運動對骨重塑影響的候選分子標(biāo)記。

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The Effect of Treadmill Running on Wnt Pathway Related Bone Remodeling Genes in Growing Rats

Yang Yongjie1，Gao Li1，Zhang Lan1，Chen Wan1，Li Xiangdong2，Chen Yan1，Wang Zhaohui1，Shen Dongying1

1 Shandong Institute of Physical Education and Sports，Ji’nan 250102，China
2 Qianfoshan Hospital of Shandong Province，Ji’nan 250102，China

Yang Yongjie，Email：yangyongjie@sdpei.edu.cn

ObjectiveTo explore the expression of the Wnt pathway related genes--Jun，Mmp9，Cox2，Tnf and Msx2 in peripheral blood monocytes（PBMC）in growing rats after treadmill training，so as to un?covertherelationship between thesegenesand boneremodeling.MethodsTwo-month-old male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into a control group（n=12）and an exercise group（n= 12）.The rats in the exercise group

50min treadmill running at 25 m/min，5 days per week for 12 weeks.Slope gradient of the treadmill was adjusted at 0°.At the end of experiment，the body weight，the muscle weight，the bone mineral content（BMC）and the bone mineral density（BMD）of all rats were evaluated in vivo using dual-energy x-ray absorptiometry（DEXA，XR-600）.All rats were sac?rificed in 24 hours after the final training.The BMD and the morphological change of the right femur were examined.And the bone microarchitecture in the distal femoral metaphysis was evaluated using a microcomputed tomography（micro-CT）system.PBMC was harvested，and the mRNA expression of Jun，Mmp9，Cox2，Tnf and Msx2 were detected using QRT-PCR.ResultsCompared with the control group，the body weight in vivo，bone surface/bone volume and trabecular bone pattern factor decreased signifi?cantly，whereas volume fraction and trabecular thickness increased significantly in the exercise group（P＜0.05）.No significant differences were observed in the trabecular number and trabecular separation be?tween the two groups，as were the BMC，BMD and muscle weight of rat as well as the BMD and the morphological change（length，thickness and width）of the femur.The results of trabecular microstructure in the distal femoral metaphysis showed that running exercises increased the trabecular number and re?duced the breakage of bony trabeculae.The treadmill training up-regulated the Msx2 mRNA transcrip?tion，down-regulated that of the Jun，Mmp9 and Cox-2，but had no effect on Tnf transcription.Conclu?sionsThe mRNA transcript alteration of the Wnt Pathway Related Genes Jun，Mmp9，Cox2，Tnf and Msx2 in PBMC matched the changes of bone remodeling caused by exercise very well，and these genes may serve as perfect molecular marker candidates for bone remodeling.

growing rat，treadmill，peripheral blood mononuclear cell，bone remodeling，Wnt

2016.06.24

山東省自然科學(xué)基金青年基金資助項目（ZR2013CQ034）；山東省自然科學(xué)基金資助項目（ZR2014CL017）

楊永杰，Email：yangyongjie@sdpei.edu.cn