吳衛(wèi)君劉士力李倩王雨辰練青平胡廷尖賈永義蔣文枰李喜蓮

（1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313001；2. 浙江省慶元縣水利局水產(chǎn)技術(shù)推廣站，慶元 323800；3. 上海海洋大學(xué)，上海 201306）

泥鰍角蛋白18（K18）基因的克隆與表達(dá)分析

吳衛(wèi)君1，2劉士力1，3李倩1王雨辰1練青平1胡廷尖1賈永義1蔣文枰1李喜蓮1

（1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313001；2. 浙江省慶元縣水利局水產(chǎn)技術(shù)推廣站，慶元 323800；3. 上海海洋大學(xué)，上海 201306）

角蛋白18（K18）是角蛋白的一種，為中間纖維蛋白，是細(xì)胞骨架的組成部分。為了解泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）K18序列特征及其在不同組織中的表達(dá)，研究采用3'-和5'-RACE法克隆K18基因cDNA全長序列，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探討其在不同組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，泥鰍K18基因cDNA全長序列1 694 bp，其中包含開放閱讀框1 299 bp，編碼432個(gè)氨基酸，其序列具有Ⅰ型角蛋白序列DGKVVS，以及非常相似序列DNA（R/K）LAADDF。相似度分析顯示，泥鰍K18與大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）的相似度最高為98%，與其它物種K18也存在不同程度的相似度。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，泥鰍與其他物種的K18系統(tǒng)發(fā)育同源，且同陸生脊椎動(dòng)物和硬骨魚類同源，并與大鱗副泥鰍的關(guān)系最為密切。通過定量分析，K18基因在泥鰍腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等8種組織都有表達(dá)，其中，腸表達(dá)最高，心臟最低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，K18基因的表達(dá)在不同組織間存在顯著性差異。

角蛋白18（K18）；cDNA克隆；泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）；定量表達(dá)

角蛋白是一種細(xì)胞骨架蛋白，屬于中間纖維蛋白（intermediate filament proteins，IF蛋白），并進(jìn)一步組裝成中間纖維（intermediate filament，IF）。中間纖維（IF）、微絲、微管等是細(xì)胞骨架的主要成份［1，2］，對(duì)維持細(xì)胞的一定形態(tài)，保持細(xì)胞的適應(yīng)穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用［1，3］。IF蛋白構(gòu)成了一個(gè)龐大的多基因家族，目前，已經(jīng)確定在人體中包含60多個(gè)不同基因［4］，70多種家族成員［4，5］。在幾乎所有細(xì)胞骨架體系中1/3是中間纖維（IF），而最突出的是角蛋白［6］，約占IF的75%［5，7］，是IF蛋白中迄今最復(fù)雜的一組蛋白［8，9］。角蛋白不僅是上皮細(xì)胞骨架的組成部分，而且還充當(dāng)分化標(biāo)記蛋白［8］，確定上皮細(xì)胞類型以及代謝終端分化和胚胎發(fā)育過程中分化的狀態(tài)；也有助于確定上皮腫瘤的來源，某些情況下，是良性和惡性上皮腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物。為此，角蛋白在分化標(biāo)記、疾病預(yù)防、臨床等方面具有重要意義［10］。角蛋白18（keratin 18，K18）是角蛋白的一種，目前，劉紅山等［11］研究了K18的免疫特異性，Knudson等［12］研究了角蛋白的同位素分析，席慶［13］、魏飛力等［14］研究了K18單克隆抗體的制備鑒定及應(yīng)用，朱匯等［15］已研究了角蛋白基因啟動(dòng)子，崔新潔等［16］則運(yùn)用K18等抗體的表達(dá)研究上皮細(xì)胞的培養(yǎng)或鑒定。此外，迄今為止，斑馬魚（Danio rerio）、鯊魚（Scyliorhinus stellaris）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、金魚（Carassius auratus）、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）等多種魚類K18基因cDNA已被成功克隆［3，8，17，18］，但有關(guān)泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）K18基因的研究尚未見報(bào)道。

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），俗稱：真泥鰍、本地泥鰍等，隸屬鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、泥鰍屬（Misgurnus），其適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、數(shù)量多、雜食性，同時(shí)，營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，具較高的藥用價(jià)值，是重要的小型經(jīng)濟(jì)淡水魚類。目前，泥鰍的研究基本集中在繁殖、育苗、養(yǎng)殖、生長、餌料、發(fā)育等領(lǐng)域［19，20］，有關(guān)分子生物學(xué)的研究較少。該研究采用3'-和5'-RACE法，克隆泥鰍K18基因cDNA全長序列，并對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTQ-PCR）技術(shù)研究其在不同組織中的表達(dá)，旨在了解K18基因序列特征及其表達(dá)，為泥鰍的分子生物學(xué)研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所用健康泥鰍，采自浙江省淡水水產(chǎn)研究所的綜合實(shí)驗(yàn)基地，取泥鰍的腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等組織，迅速放入液氮冷凍，隨后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主 要 試 劑 TRIzol?Reagent購 自 美 國Invitrogen公司。RACE試劑盒購自Clontech公司。DEPC購自上海生工生物技術(shù)有限公司。M-MLV RT-ase cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、Ex Taq（5 U/μL）、DNA回收試劑盒、pMD18-T載體試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照TRIzol?Reagent一步法提取各組織總RNA，用核酸蛋白測定儀檢測總RNA的濃度和質(zhì)量，同時(shí)用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。之后，取各組織總RNA 500 ng按照M-MLV RTase cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 泥鰍K18基因部分cDNA序列擴(kuò)增 根據(jù)斑馬魚（GenBank登錄號(hào)：NM_178437.2），虹鱒（GenBank登錄號(hào)：NM_001124724.1），和稀有鮈鯽（上海海洋大學(xué)蔡生力教授提供）K18基因序列，設(shè)計(jì)兼并引物cDNA-F和cDNA-R（表1，圖1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增泥鰍K18部分cDNA序列，模板為總RNA濃度和質(zhì)量檢測最高的卵巢cDNA。反應(yīng)體系50 μL，PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min進(jìn)入循環(huán)；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃結(jié)束程序。PCR產(chǎn)物按照DNA回收試劑盒純化回收。之后，按照pMD18-T載體試劑盒說明，連接pMD18-T載體，再轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，PCR檢測后篩選陽性克隆，送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。測序所得序列由NCBI的BLAST比對(duì)檢驗(yàn)，以初步確定是否為K18基因部分cDNA序列。

表1 引物序列

1.2.3 泥鰍K18基因3'-和5'-RACE技術(shù)克隆 根據(jù)已確定得到K18基因部分cDNA序列設(shè)計(jì)RACE引物GSP-K18-5'和GSP-K18-3'（表1，圖1），按照RACE試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄合成總RNA濃度和質(zhì)量檢測最高的卵巢cDNA，作為模板，分別進(jìn)行3'-和5'-RACE擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL，擴(kuò)增程序：94℃30 s，72℃ 3 min，共5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，共5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離檢測，按照1.2.2方法，進(jìn)行回收純化，連接載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送上海桑尼生物科技有限公司測序。

圖1 引物在序列中的位置

1.2.4 泥鰍K18序列分析 根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行拼接得到泥鰍K18基因的cDNA全長序列，應(yīng)用ORF Finder 程 序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/ gorf/），確定開放閱讀框，翻譯氨基酸序列，并進(jìn)行NCBI的BLAST比對(duì)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。預(yù)測氨基酸的物理參數(shù)用ExPASy在線Protparam 程序（http://web.expasy.org/protparam/），預(yù)測二硫鍵用Scratch程 序（http://www.ics.uci.edu/~baldig/scratch/ index.html），分析跨膜結(jié)構(gòu)為TMHMM程序（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），預(yù)測信號(hào)肽用SignalP程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)用bioinf程序（http://bioinf. cs.ucl.ac.uk）分析結(jié)合Predictprotein程序（https：//www. predictprotein.org/），分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域用SMART程序（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析結(jié)合NCBI的Conserved Domains（CD-Search）程序（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd/），預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)用SWISS-MODEL程 序（http://www.swissmodel.expasy. org/）［21-23］。 用ClustalX 和DNAMAN軟 件 對(duì) 經(jīng)BLAST比對(duì)的泥鰍K18與其他物種角蛋白氨基酸序列（表2）進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。然后用MEGA軟件，采取鄰位相接法（neighbor-joining，NJ），以Bootstrap重復(fù)1000次計(jì)算各分枝的置信度，構(gòu)建泥鰍K18與其他物種角蛋白（表2）的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 泥鰍K18基因組織差異表達(dá)檢測 根據(jù)上述已克隆的泥鰍K18基因cDNA全長序列，設(shè)計(jì)定量PCR特異性引物K18-F和K18-R（表1，圖1）。以泥鰍β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物β-actin-F和β-actin-R（表1）。用于校正。以各組織合成的cDNA為模板，按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明，進(jìn)行RTQ-PCR檢測K18基因組織差異，PCR程序：95℃ 4 min進(jìn)入循環(huán)；95℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。采用2-△△Ct方法計(jì)算每個(gè)樣品組織目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用軟件SPSS對(duì)泥鰍K18基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算結(jié)果，以單因素方差分析法（one-wayANOVA）的多重比較等分析各組織基因表達(dá)的差異顯著性。統(tǒng)計(jì)學(xué)上以P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

表2 泥鰍與其他物種角蛋白氨基酸序列及其相似度比對(duì)

2 結(jié)果

2.1 泥鰍K18基因的cDNA全長序列

克隆得到泥鰍K18基因cDNA全長序列1 694 bp，其中，包含5'-非翻譯區(qū)（5'-untranslated region，5'-UTR）81 bp和3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）314 bp，開放閱讀框1 299 bp。3'-UTR有1個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)位點(diǎn)（AATAAA）和1個(gè)多聚A尾巴（poly A tail）（圖2）。所得泥鰍K18基因cDNA全長序列提交于NCBI的GenBank中，登錄號(hào)為JQ269652.1。

2.2 泥鰍K18基因氨基酸序列分析

泥鰍K18基因cDNA全長序列開放閱讀框共編碼432個(gè)氨基酸，該K18氨基酸序列具有角蛋白特征，N-端含重復(fù)的甘氨酸（G）；C-端富含絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和纈氨酸（V）（圖2）。另外，還具有I型角蛋白共有序列DGKVVS，以及I型角蛋白非常相似的序列DNA（R/K）LAADDF（圖3）。通過預(yù)測，蛋白質(zhì)分子式：C2088H3447N613O692S16，相對(duì)分子質(zhì)量為48.7239 kD，理論等電點(diǎn)為5.42。其中，亮氨酸（L）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）的含量較高，分別為10.6%、10.0%、8.8%，色氨酸（W）的含量最少為0.2%。同時(shí)，66個(gè)負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp + Glu），57個(gè)正電荷氨基酸殘基（Arg + Lys）。脂肪族氨基酸指數(shù)為87.13。泥鰍K18基因氨基酸預(yù)測無二硫鍵，也無跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽。所得泥鰍K18基因氨基酸序列提交于NCBI的GenBank中，登錄號(hào)為AFD54864.1。

圖2 泥鰍K18基因cDNA全長序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

通過結(jié)構(gòu)域分析（圖2）表明，泥鰍K18的結(jié)構(gòu)域含：3個(gè)卷曲螺旋區(qū)域（82 aa-125 aa、189 aa-233 aa、286 aa-391 aa）和1個(gè)保守的IF蛋白結(jié)構(gòu)域（84 aa-395 aa）。通過蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果（圖4）表明，泥鰍K18的二級(jí)結(jié)構(gòu)含：13個(gè)（α-）螺旋、7個(gè)（β-）折疊股及20個(gè)其他無規(guī)則卷曲，分別占二級(jí)結(jié)構(gòu)的32.5%、17.5%及50.0%。并通過SWISS-MODEL程序，構(gòu)建了K18的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5）。

通過NCBI經(jīng)BLAST蛋白質(zhì)相似度比對(duì)分析，泥鰍K18基因氨基酸序列與大鱗副泥鰍的相似度最高為98%，與斑馬魚、金魚、虹鱒、白斑狗魚（Esoxlucius）的K18相似度也較高，分別為90%、84%、77%、76%，此外同其他一些物種角蛋白基因氨基酸序列也存在不同程度的相似度（表2）。

圖3 泥鰍與其他物種I型角蛋白基因氨基酸序列比對(duì)

2.3 泥鰍K18基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用軟件ClustalX多重序列比對(duì)和軟件MEGA構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖6）表明，不同物種及不同類型的角蛋白，分別獨(dú)立占據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的不同分枝。其中，角蛋白K1、K3、K5、K8與其他類型角蛋白（K10、K11、K13、K17、K18、K20、K42、K97）獨(dú)立占據(jù)一個(gè)大分枝，同時(shí)，K18又獨(dú)立占據(jù)一個(gè)分枝，并分為兩個(gè)分枝：一枝為人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）等脊椎動(dòng)物；另一枝為魚類，包括該研究所得泥鰍K18，表明泥鰍與其他物種的K18系統(tǒng)發(fā)育同源，進(jìn)一步證實(shí)此基因?qū)儆贙18類型家族。此外，泥鰍K18與在分類地位上也同屬鰍科的大鱗副泥鰍聚在一起，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切。

圖4 泥鰍K18氨基酸序列及預(yù)測的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 SWISS-MODEL程序預(yù)測的泥鰍K18的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4 泥鰍K18基因在各組織中的表達(dá)分析

以β-actin為內(nèi)參，用RTQ-PCR檢測泥鰍K18基因在腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等8種組織的表達(dá)情況，結(jié)果（圖7）表明，K18基因在泥鰍8種不同組織中都有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯的組織差異性，其中，在腸表達(dá)最高，心臟最低，在胃、肝臟、精巢、脾臟等組織也有較高表達(dá)，腸的相對(duì)表達(dá)量是心臟的22.4倍。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，K18基因的表達(dá)在不同組織間存在顯著性差異，其中，腸同其他組織間的差異極顯著（P<0.01）；心臟除與卵巢外，同其他組織存在顯著性差異（P<0.05），并與腸、胃、肝臟、脾臟的差異極顯著（P<0.01）。

3 討論

3.1 泥鰍K18基因的序列特征

IF蛋白可分為：Ⅰ型（角蛋白）；Ⅱ型（角蛋白）；Ⅲ型（包含波形蛋白、外周蛋白、結(jié)蛋白等）；Ⅳ型（包含α-介連蛋白、神經(jīng)纖維蛋白等）；Ⅴ型（核纖層蛋白）；Ⅵ型（聯(lián)絲蛋白、平行蛋白、微管卷曲蛋白等）等類型［8］。通過研究，首次克隆得到泥鰍K18基因cDNA全長序列，經(jīng)NCBI的BLAST分析為K18基因cDNA序列，屬于IF蛋白。預(yù)測的分子量為48.7239 kD，在40 kD-64 kD范圍內(nèi)，理論等電點(diǎn)為5.42，在4-6范圍內(nèi)，符合Ⅰ型角蛋白（酸性角蛋白）特征，這與Infante等［5］的觀點(diǎn)一致。同時(shí)，泥鰍K18基因氨基酸帶66個(gè)負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp + Glu），多于57個(gè)正電荷氨基酸殘基（Arg + Lys），也呈現(xiàn)酸性角蛋白。另外，研究所得泥鰍K18基因氨基酸序列中，N-端也發(fā)現(xiàn)了所有角蛋白共有特征，如富含重復(fù)的甘氨酸（G）。C-端富含絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和纈氨酸（V），這同在其他角蛋白中也發(fā)現(xiàn)類似的氨基酸［24］。在C-端中還發(fā)現(xiàn)了其他 許多IF蛋白的I型角蛋白序列DGKVVS，以及許多I型角蛋白非常相似的序列DNA（R/K）LAADDF［24］。但研究也發(fā)現(xiàn)，個(gè)別物種在這兩個(gè)序列存在一些差異：大黃魚（Larimichthys crocea）K17的I型角蛋白序列卻為DGRVVS，I型角蛋白非常相似的序列卻為DNARLAAEDF；大黃魚K20的I型角蛋白非常相似的序列卻為DNAQLAADDF，這可能是由于物種在進(jìn)化過程中發(fā)生了一定的突變，尚待研究。該研究還對(duì)K18的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析，但目前對(duì)這方面研究較少，其結(jié)構(gòu)與功能等關(guān)系及機(jī)理也尚待研究。

圖6 泥鰍與其他物種角蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖7 K18基因在泥鰍不同組織中的表達(dá)水平

3.2 泥鰍K18基因的系統(tǒng)進(jìn)化

按照表達(dá)不同，角蛋白又可細(xì)分為若干表達(dá)類型：E型、S型、H型、IRS型、ET型等［6，10］。K18屬于S型角蛋白，存在于目前研究的所有脊椎動(dòng)物中［3］，且迄今為止，在已知的E型和S型系統(tǒng)發(fā)育分析中，這對(duì)經(jīng)典的角蛋白被認(rèn)為是所有脊椎動(dòng)物類中唯一的角蛋白［25］。在人類中，經(jīng)典的S型角蛋白K8和K18同陸生脊椎動(dòng)物和硬骨魚類有真正的同源基因［5，18］。研究也發(fā)現(xiàn)，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，泥鰍與其他物種的K18在進(jìn)化樹中占據(jù)一個(gè)分枝，在這K18分枝中又分為兩枝：一分枝為人、牛、褐家鼠等陸生脊椎動(dòng)物；另一分枝為泥鰍、大鱗副泥鰍、斑馬魚等硬骨魚類，進(jìn)一步表明K18的系統(tǒng)發(fā)育同源，且同陸生脊椎動(dòng)物和硬骨魚類同源。此外，在進(jìn)化樹中，K8也獨(dú)立占據(jù)一個(gè)分枝，并也分為兩枝：一分枝為人、牛等陸生脊椎動(dòng)物；另一分枝為大西洋鮭（Salmo salar）、斑馬魚、金魚等硬骨魚類，也表明K8同陸生脊椎動(dòng)物和硬骨魚類同源。通過NCBI經(jīng)BLAST蛋白質(zhì)相似度分析，泥鰍K18基因氨基酸序列與大鱗副泥鰍具有98%的相似度，與斑馬魚、金魚、虹鱒、白斑狗魚等的K18相似度也較高，表明K18在進(jìn)化中相對(duì)比較保守。

3.3 泥鰍K18基因的組織差異表達(dá)

IF蛋白顯示組織特異性［26］，K18是在皮膚內(nèi)主要表達(dá)于汗腺和頂泌腺分泌細(xì)胞的一種廣泛分布的角蛋白［10］。在人類和小鼠的肝臟來源的細(xì)胞中，K18是唯一表達(dá)的角蛋白。該研究也發(fā)現(xiàn)，K18基因在泥鰍所檢測的8種組織中均有表達(dá)，但腸表達(dá)最高，心臟最低，在胃、肝臟、精巢、脾臟等組織也有較高表達(dá)，表明K18基因表達(dá)水平存在明顯的組織差異。K18是細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，是細(xì)胞的重要組成部分［1］，在各組織器官細(xì)胞中廣泛存在，該研究中K18基因在泥鰍腸、胃、肝臟、脾臟等上皮組織中有較高表達(dá)，進(jìn)一步表明角蛋白通常表達(dá)于上皮組織，這與Schaffeld等［3，6］的觀點(diǎn)一致。此外，有研究表明，角蛋白的表達(dá)不限定于上皮組織［2，24］，還被發(fā)現(xiàn)在幾種卵母細(xì)胞和精子中［2］。同時(shí)，角蛋白還存在于多種間質(zhì)細(xì)胞和組織中［18］。Druger等［2，24］研究表明，角蛋白還在金魚等視神經(jīng)中表達(dá)，S型角蛋白在硬骨魚中還表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞中，這可能有助于抵御滲透壓，并在視神經(jīng)中可能再生這種抵御滲透壓能力［5，6］。研究結(jié)果也顯示，K18既在上皮組織表達(dá)外，還在肌肉、精巢、卵巢等組織表達(dá)。另外，心臟也有小部分表達(dá)，這可能是由于覆蓋于心臟腔面的上皮所致，但由于心臟的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能，心臟腔面的上皮僅是心臟的一小部分，為此，通常表達(dá)于簡單上皮的S型角蛋白——K18在心臟中表達(dá)較低?？偠灾琄18基因的表達(dá)顯示組織特異性，其組織表達(dá)的差異及機(jī)理有待進(jìn)一步研究。K18基因的組織表達(dá)存在差異性，在各組織器官細(xì)胞中廣泛存在，體現(xiàn)了K18在細(xì)胞骨架中承擔(dān)重要作用，同時(shí)，揭示了泥鰍K18的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域以及三級(jí)結(jié)構(gòu)等特征，并為了解泥鰍細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的研究奠定了一定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

研究首次克隆得到泥鰍K18基因cDNA全長序列1 694 bp，其中，包含開放閱讀框1 299 bp，編碼432個(gè)氨基酸，其序列與大鱗副泥鰍的相似度最高為98%，與其它物種K18也存在不同程度的相似度，并與其他物種的K18系統(tǒng)發(fā)育同源。通過定量統(tǒng)計(jì)分析，K18基因在泥鰍腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等8種組織都有表達(dá)，其中，腸表達(dá)最高，心臟最低，且不同組織間存在顯著性差異。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Keratin 18 Gene in Loach（Misgurnus anguillicaudatus）

Keratin 18（K18），one of the keratin，is the intermediate filament proteins and an integral part of the cytoskeleton. In order to understand the sequence characteristics and expression of K18，cDNA full-length sequence of K18 gene was cloned from loach（Misgurnus anguillicaudatus）using RACE，and its expression in different tissues was explored using real-time quantitative PCR. The results showed that the cDNA full-length of cloned K18 gene was 1 694 bp，containing a 1 299 bp open reading frame encoding 432 amino acids. There were the sequence DGKVVS，and the very similar sequence DNA（R/K）LAADDF of type I keratin. Identity analysis revealed that loach had the highest identity up to 98% with large-scale loach（Paramisgurnus dabryanus）in K18，and there were various levels of identity with other species. Phylogenetic analysis demonstrated that the K18 gene of loach was in phylogenetic homology with other species，and in true orthologs with terrestrial vertebrates（tetrapods）and teleosts，moreover，closest with large-scale loach. K18 gene was expressed in the 8 tissues of intestine，muscle，heart，stomach，liver，testis，ovary，spleen，the highest in the intestine，and the lowest in the heart. Statistical analysis showed that the differences of expression among different tissues were significant.

keratin 18（K18）；cDNA clone；loach（Misgurnus anguillicaudatus）；quantitative expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.015

2015-08-03

浙江省重大科技專項(xiàng)（2013C02009），浙江省設(shè)施水產(chǎn)養(yǎng)殖科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011R50029），浙江省公益技術(shù)研究項(xiàng)目（2010C32033，2012C22059）

吳衛(wèi)君，男，碩士，工程師，研究方向：水產(chǎn)技術(shù)推廣、水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)、分子生物學(xué)等研發(fā)工作；E-mail：zjwuweijun@163.com

胡廷尖，男，教授級(jí)高工，研究方向：水產(chǎn)苗種繁育；E-mail：zjscmz@163.com

WU Wei-jun1，2LIU Shi-li1，3LI Qian1WANG Yu-chen1LIAN Qing-ping1HU Ting-jian1JIA Yong-yi1JIANG Wen-ping1LI Xi-lian1

（1. Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Agriculture Ministry Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture & Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic and Breeding of Zhejiang Province，Huzhou 313001；2. Extension Station of Fisheries Technology，Water Resources Bureau of Qingyuan County，Zhejiang Province，Qingyuan 323800；3. Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）