喻鵬飛，趙麗娟，董玲燕，方 明，宋玉勝，王進(jìn)波*

(1.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江寧波 315100；2.寧波中藥制藥有限公司，浙江寧波315806；3.寧波聚卿舫食品有限公司，浙江寧波315032)

姜黃提取物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑制作用

喻鵬飛1，趙麗娟2，董玲燕2，方 明2，宋玉勝3，王進(jìn)波1*

(1.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江寧波 315100；2.寧波中藥制藥有限公司，浙江寧波315806；3.寧波聚卿舫食品有限公司，浙江寧波315032)

摘要[目的]研究姜黃提取物對(duì)不同水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑制作用。[方法]采用水蒸汽蒸餾法和索氏提取法提取姜黃揮發(fā)油，采用80%乙醇浸提法制備姜黃素。利用濾紙片固相擴(kuò)散法研究3種姜黃提取物對(duì)4種水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑菌活性；利用平板涂布法研究姜黃提取物對(duì)4種病原菌的的最低抑菌濃度(MIC)。[結(jié)果]2種姜黃揮發(fā)油對(duì)4種水產(chǎn)動(dòng)物病原菌具有抑菌活性，姜黃素對(duì)銅綠假單胞菌沒(méi)有抑菌效果。姜黃揮發(fā)油的抑菌效果好于姜黃素，其中水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油抑菌效果最佳。3種提取物對(duì)嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和銅綠假單胞菌的MIC分別為：水蒸汽蒸餾姜黃揮發(fā)油6.25、12.5、6.25、100.0 mg/mL；索氏提取姜黃揮發(fā)油25.0、12.5、25.0、100.0mg/mL；姜黃素25.0、50.0、50.0、200.0 mg/mL。[結(jié)論]姜黃提取物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物主要病原菌具有抑制作用。

關(guān)鍵詞姜黃；揮發(fā)油；姜黃素；病原菌；抑制作用

姜黃是姜科多年生草本植物姜黃的根莖，在中國(guó)、印度等國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛，具有破血、行氣、通經(jīng)、止痛的功效，能夠用于治療心腹痞滿(mǎn)脹痛、臂痛、癥瘕、婦女血瘀經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀停腹痛、跌撲損傷和癰腫等諸多疾病。大量研究發(fā)現(xiàn)，姜黃中的主要有效成分姜黃素具有抗癌、保肝利膽、降血脂、抗菌消炎、防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病等功效[1-2]。姜黃已成為國(guó)際醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[3-4]，目前世界各國(guó)正在開(kāi)展的有關(guān)姜黃素類(lèi)藥物的臨床試驗(yàn)有100多項(xiàng)。近年來(lái)，針對(duì)姜黃素在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用也有一些研究[5-8]，但對(duì)姜黃揮發(fā)油的在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究尚未見(jiàn)報(bào)道；同時(shí)，姜黃提取物對(duì)水產(chǎn)病原菌的抑制效果也缺乏詳細(xì)的研究。該研究運(yùn)用水蒸汽蒸餾法、索氏提取法制備姜黃揮發(fā)油，并探討了不同方法制備的姜黃揮發(fā)油和姜黃素對(duì)嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和銅綠假單胞菌等4種水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑菌效果，測(cè)定了最低抑菌濃度(MIC)，旨在為姜黃提取物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病原菌。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L)；固體LB培養(yǎng)基中另加15 g/L瓊脂粉。上述培養(yǎng)基按常規(guī)方法，高壓滅菌后，置 4 ℃冰箱保存，備用。

1.2方法

1.2.1水蒸汽蒸餾法提取姜黃揮發(fā)油。取粉碎至40目的姜黃粉末50 g，置于1 000 mL 平底燒瓶中，加入適量的蒸餾水使其潤(rùn)濕，水蒸汽蒸餾4 h，收集水-姜黃揮發(fā)油餾出液，將餾出液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用石油醚(30～60 ℃)分次萃取，萃取液加入適量的無(wú)水硫酸鈉低溫干燥24 h 后過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去石油醚，，收集揮發(fā)油并稱(chēng)重。

1.2.2索氏提取法提取姜黃揮發(fā)油。取粉碎至40目的姜黃粉末50 g，用濾紙包成小包放入索氏提取器中，提取瓶?jī)?nèi)加入石油醚200 mL，然后固定在鐵架臺(tái)上，置于55～60 ℃恒溫水浴鍋中，同時(shí)冷凝水回流至提取器中液體無(wú)色，取出提取液，加無(wú)水硫酸鈉低溫干燥24 h 過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去濾液中的石油醚，收集揮發(fā)油并稱(chēng)重。

1.2.3姜黃素的提取。取粉碎至40目的姜黃粉與80%乙醇以質(zhì)量體積比1∶5～1∶10混合均勻，200 r/min，提取2 h，過(guò)濾并收集濾液，重復(fù)提取3次，將3次提取的濾液合并。濃縮至飽和，置于4 ℃結(jié)晶，得純度≥95%的精制姜黃素。

1.2.4菌體懸液及平板的制備。將供試菌分別從4 ℃冰箱中取出，接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化后，用無(wú)菌接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上分別挑取各供試菌，將細(xì)菌接種在LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)24 h。通過(guò)平板計(jì)數(shù)法，確定菌液的稀釋度，使最后的菌懸液含量為107cfu/mL，待用。

1.2.5不同姜黃提取物的抑菌效果。用無(wú)菌移液槍吸取200 μL菌懸液于培養(yǎng)基的表面，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布。用無(wú)菌鑷子夾取滅菌圓形濾紙片(直徑6 mm)，浸于50.0 mg/mL的姜黃素、姜黃揮發(fā)油(索氏提取)、姜黃揮發(fā)油(水蒸汽蒸餾)中，20 min后取出瀝干，將上述濾紙片輕輕貼在固體平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿貼3片，每組做3個(gè)平行。姜黃揮發(fā)油以1%的吐溫80水溶液作為對(duì)照，姜黃素以含有等濃度二甲亞砜的蒸餾水作為對(duì)照，同時(shí)設(shè)置無(wú)菌濾紙片的培養(yǎng)皿作為空白對(duì)照，放入恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算抑菌圈直徑大小的平均值。抑菌圈直徑大小(含濾紙片直徑)在7～9 mm時(shí)，為低度敏感抑菌作用；在10～15 mm時(shí)，為中度敏感抑菌作用；抑菌圈直徑>15 mm時(shí)，為高度敏感抑菌作用；無(wú)抑菌圈或抑菌圈直徑<5 mm，為沒(méi)有敏感抑菌作用。

1.2.6姜黃提取物MIC的測(cè)定。用吐溫80水溶液(1%)稀釋成不同濃度(100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.560、0.780 mg/mL)的姜黃揮發(fā)油稀釋液；姜黃素以適量二甲亞砜溶解后，用蒸餾水配制成不同濃度(200.000、150.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/mL)的姜黃素溶液。菌懸液與各濃度揮發(fā)油的稀釋液(或姜黃素溶液)1∶1混合均勻成為混合液。取0.2 mL混合液于平板中，涂布均勻，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌體生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)菌體為陽(yáng)性(+)，不生長(zhǎng)菌體為陰性(-)，以不生長(zhǎng)菌體的最低濃度為該成分的最低抑菌濃度(MIC)。姜黃揮發(fā)油以1 %的吐溫80水溶液作為對(duì)照，姜黃素以含有等濃度二甲亞砜的蒸餾水作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1不同姜黃提取物的抑菌效果該研究利用濾紙片法，分析了50 mg/mL不同姜黃提取物對(duì)嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和銅綠假單胞菌等水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的抑菌效果。從表1可以看出，姜黃揮發(fā)油對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑菌效果明顯好于姜黃素，水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油對(duì)4種病原菌抑菌活性明顯高于索氏提取的姜黃揮發(fā)油。嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌等3種病原菌對(duì)2種姜黃揮發(fā)油高度敏感，對(duì)姜黃素低度敏感；銅綠假單胞菌對(duì)水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油中度敏感，對(duì)索氏提取的姜黃揮發(fā)油低度敏感，姜黃素則對(duì)銅綠假單胞菌沒(méi)有抑制作用。

表1　不同姜黃提取物的抑菌效果

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference among groups(P<0.05).

2.2水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油對(duì)各種供試菌的MIC由表2可見(jiàn)，水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的MIC各不相同。嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和銅綠假單胞菌的MIC值分別為6.25、12.50、6.25和100.00 mg/mL。

表2水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油對(duì)供試菌的MIC

Table 2TheMICof volatile oil extracted by water steam distillation to tested bacteria

濃度Concentrationmg/mL嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophilia鰻弧菌Vibrioanguillarum遲緩愛(ài)德華氏菌Edwardsiellatarda銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa100.000----50.000---+25.000---++12.500---+++6.250-+-+++3.125+++++++1.560++++++++++0.780++++++++++++對(duì)照CK++++++++++++MIC∥mg/mL6.2512.506.25100.00

注：“+”代表平板上有菌落生長(zhǎng)，“+”越多代表菌落數(shù)越多。“-”代表平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。

Note：“+” stands for bacterial colony growth on the plate，more “+” indicates more colonies.“-”indicates no bacterial colony growth on the plate.

2.3索氏提取的姜黃揮發(fā)油對(duì)各種供試菌的MIC從表3可以看出，索氏提取的姜黃揮發(fā)油對(duì)嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和銅綠假單胞菌的MIC值分別為25.0、12.5、25.0和100.0 mg/mL。由表2～3可知，索氏提取的姜黃揮發(fā)油對(duì)水產(chǎn)病原菌的MIC較水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油高，說(shuō)明水蒸汽蒸餾法獲得的姜黃揮發(fā)油具有更高的抑菌效率。

2.4姜黃素對(duì)各種供試菌的MIC由表4可見(jiàn)，姜黃素對(duì)嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和銅綠假單胞菌的MIC值分別為25.0、50.0、50.0和200.0 mg/mL。從表2～4的數(shù)據(jù)可以看出，姜黃素對(duì)水產(chǎn)病原菌的MIC明顯高于2種姜黃揮發(fā)油，表明姜黃素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑菌能力低于姜黃揮發(fā)油。

3結(jié)論與討論

該研究探討了不同姜黃提取物對(duì)嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和銅綠假單胞菌等水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑制作用，測(cè)定了姜黃提取物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的最低抑菌濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油抑菌能力最強(qiáng)，索氏提取法提取的姜黃揮發(fā)油的抑菌能力次之，姜黃素的抑菌能力最弱。

表3索氏提取的姜黃揮發(fā)油對(duì)供試菌的MIC

Table 3TheMICof volatile oil extracted by Soxhlet method to tested bacteria

濃度Concentrationmg/mL嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophilia鰻弧菌Vibrioanguillarum遲緩愛(ài)德華氏菌Edwardsiellatarda銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa100.000----50.000---+25.000---++12.500+-++++6.250++++++++3.125+++++++++++1.560++++++++++++0.780++++++++++++對(duì)照CK++++++++++++MIC∥mg/mL25.012.525.0100.0

注：“+”代表平板上有菌落生長(zhǎng)，“+”越多代表菌落數(shù)越多。“-”代表平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。

Note：“+” stands for bacterial colony growth on the plate，more “+” indicates more colonies.“-”indicates no bacterial colony growth on the plate.

表4　姜黃素對(duì)供試菌的MIC

注：“+”代表平板上有菌落生長(zhǎng)，“+”趙多代表菌落數(shù)越多?！?”代表平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。

Note：“+” stands for bacterial colony growth on the plate，more “+” indicates more colonies.“-”indicates no bacterial colony growth on the plate.

不同學(xué)者對(duì)姜黃提取物的抗菌活性進(jìn)行了探索，結(jié)果表明，姜黃素及姜黃揮發(fā)油均具有較強(qiáng)的抑菌作用[1，4]。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠顯著抑制蠟樣芽胞桿菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)、增殖。Chen等[10]分析指出，姜黃素具有明顯的抗真菌活性，能夠抑制假絲酵母、隱球酵母、曲霉菌、絲孢酵母、副球孢子菌等真菌的增殖。Temba等[11]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠顯著降低黃曲霉孢子的數(shù)量，抑制黃曲霉造成的食物污染。Kamazeri等[12]利用水蒸汽蒸餾法提取姜黃揮發(fā)油并分析其抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃揮發(fā)油能夠抑制枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、新型隱球酵母等菌的生長(zhǎng)增殖。Gupta等[13]研究也證明，索氏提取的姜黃揮發(fā)油能夠抑制金黃色葡萄球菌的增殖。該研究分析了姜黃提取物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的抑制作用，結(jié)果與上述研究結(jié)論一致，姜黃揮發(fā)油和姜黃素均具有較好的抗菌效果。

從不同姜黃提取物的抑菌效果來(lái)看，水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油>索氏提取的姜黃揮發(fā)油>姜黃素。這可能是由于水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油中姜黃烯、龍腦(2-莰醇)、姜黃酮等成分含量較高[14]，這些成分具有較強(qiáng)的殺菌作用，索氏提取的姜黃揮發(fā)油中上述成分含量明顯較低，導(dǎo)致其抗菌活性較弱；而姜黃素為一種二酮類(lèi)化合物，其抗菌效率遠(yuǎn)不及多種混合成分構(gòu)成的姜黃揮發(fā)油高。

綜上所述，姜黃提取物能夠明顯抑制水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的生長(zhǎng)、增殖，具有顯著的抗菌活性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。作為姜黃素生產(chǎn)副產(chǎn)物，姜黃揮發(fā)油具有更為顯著的抗菌效果，這對(duì)姜黃的綜合開(kāi)發(fā)利用具有十分重要的意義。

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Antimicrobial Activities of the Extracts fromCurcumalongaon Pathogenic Bacteria in Aquatic Animals

YU Peng-fei1, ZHAO Li-juan2, DONG Ling-yan2, WANG Jin-bo1*et al

(1.Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo, Zhejiang 315100; 2. Ningbo Traditional Chinese Pharmaceutical Co. Ltd., Ningbo, Zhejiang 315806)

Abstract[Objective] The aim was to study antimicrobial effect of the extracts from Curcuma longa on pathogenic bacteria in aquatic animals. [Method] The volatile oil was extracted from Curcuma longa by water steam distillation and Soxhlet method. Curcumin was extracted with 80% ethanol. The antimicrobial activities of the extracts were determined by plate diffuse to 4 pathogenic bacteria. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the extracts were investigated by plate spread. [Result] The results indicated that 2 kinds of volatile oils showed antibacterial activity to 4 pathogenic bacteria, curcumin had no antimicrobial effect on Pseudomonas aeruginosa. Compared to the antimicrobial activity of curcumin, the volatile oils showed stronger antimicrobial activity. The MIC to Aeromonas hydrophilia, Vibrio anguillarum, Edwardsiella tarda and Pseudomonas aeruginosa was as followed. The volatile oil extracted by water steam distil lation was 6.25, 12.5, 6.25 and 100.0 mg/mL; the volatile oil extracted by Soxhlet method was 25.0, 12.5 25.0 and 100.0 mg/mL; curcumin was 25.0, 50.0, 50.0 and 200.0 mg/mL.[Conclusion] Curcuma longa extract has inhibitory effect on the main pathogenic bacteria of aquatic livestock.

Key wordsCurcuma longa; Volatile oil; Curcumin; Pathogenic bacteria; Inhibitory effect

基金項(xiàng)目寧波市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014B11005，2013C11031，2014C 92001，2014C92017)。

作者簡(jiǎn)介喻鵬飛(1995- )，男，河南信陽(yáng)人，本科生，專(zhuān)業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物藥理作用研究。

收稿日期2016-03-08

中圖分類(lèi)號(hào)S 567.23+9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)11-148-03