郝紅英，牛美蘭，王 研，樊亞蕾，孫莉紅

(黃河科技學院醫(yī)學院，河南鄭州 450063)

乙醇-硫酸銨雙水相提取馬齒莧總黃酮工藝研究

郝紅英，牛美蘭，王 研，樊亞蕾，孫莉紅

(黃河科技學院醫(yī)學院，河南鄭州 450063)

摘要[目的]優(yōu)化乙醇-硫酸銨雙水相提取馬齒莧總黃酮工藝。[方法]采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧中主要成分黃酮，以總黃酮得率為指標，采用單因素和正交試驗，考察提取溶劑濃度、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取工藝的影響，確定乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧總黃酮的工藝。[結(jié)果]試驗最佳提取條件為脫脂馬齒莧粉末2.0 g，乙醇用量27.50%(W)、硫酸銨16.00%(W)、料液比1∶20、溫度60 ℃、時間40 min，在此條件下，馬齒莧總黃酮提取率為7.23%。[結(jié)論]乙醇-硫酸銨雙水相提取法提取效率高、操作簡便，提取劑價格便宜，是一種很有發(fā)展前途的提取方法。

關(guān)鍵詞乙醇-硫酸銨雙水相；馬齒莧；總黃酮；提取工藝；正交設(shè)計

馬齒莧又名馬齒草、長壽菜、五行草等，為馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本植物[1]，具有清熱解毒、散血消腫、抗菌的功效，主治腸炎、菌痢、癰腫、惡瘡、丹毒、蛇蟲咬傷、痔瘡腫毒、濕疹、急性和亞急性皮炎等多種疾病[2]。馬齒莧中的主要成分為黃酮類物質(zhì)，其具有抗氧化、降糖、抗病毒、抗菌、消炎、抗?jié)兊乃幚碜饔肹3-4]。馬齒莧黃酮的提取工藝包括有機溶劑提取法[5]、超聲波法[6]、微波法[7]、酶解法[8]、樹脂法[9]等。近幾年，雙水相萃取技術(shù)因設(shè)備投資少、操作簡單，被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領(lǐng)域，且雙水相萃取體系具有價廉、低毒、較易揮發(fā)等特點[10]。筆者采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧中主要成分黃酮，以總黃酮得率為指標，采用單因素和正交試驗，考察提取溶劑濃度、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取工藝的影響，確定乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧總黃酮的工藝，為馬齒莧的合理利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料蘆丁標準樣品(中國藥品生物制定檢定所，生化試劑)，其他試劑均為分析純。馬齒莧(藥店所受中草藥)。電熱恒溫水浴箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，7230G可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1標準曲線的繪制。馬齒莧中黃酮類化合物含量的測定參照文獻[11-12]的方法，以蘆丁為標樣測定馬齒莧黃酮類化合物的含量，所得標準曲線回歸方程為Y=0.093 8X+0.000 1(R2=0.999 8)，式中，Y為蘆丁質(zhì)量濃度(g/mL)；X為吸光度。

1.2.2馬齒莧總黃酮的提取。稱取馬齒莧干細粉(過60目篩)于索氏提取器中，經(jīng)石油醚脫脂，并除去部分色素。稱取處理樣品2.0 g于 250 mL碘量瓶中，按一定的料液比加入乙醇-硫酸銨雙水相溶液，置于恒溫水浴箱，提取一段時間后，過濾，靜置分層，將濾液用分液漏斗將兩相分開，將醇相提取液高速離心 25 min，即得馬齒莧黃酮類化合物提取液，后經(jīng)微孔濾膜過濾，精密稱取一定量用甲醇定容至250 mL，以供分析測試用。

1.2.3馬齒莧總黃酮的測定。取2.5 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中，加5%(W)的NaNO21 mL，搖勻，放置5 min后加入10%(W)的Al(NO3)31 mL，5 min后再加入4%(W)的NaOH 10 mL，搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度，10 min后于7230G 型分光光度計上在510 nm處測定吸光度A，根據(jù)蘆丁標準曲線回歸方程，得到提取液濃度，總黃酮提取率按照公式Et=(C×V×D)/W×100%計算，式中，Et為提取率，C為測得的提取液濃度，V為提取液體積，D為稀釋倍數(shù)，W為原料的質(zhì)量。

1.2.4單因素試驗。

1.2.4.1乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響。水浴溫度為40 ℃，固定硫酸銨用量6.4 g[16.00%(W)]、料液比1∶20[m(馬齒莧)∶m(雙水相溶劑)]、提取時間30 min的條件下，稱取處理樣品2.0 g，選擇不同濃度乙醇[25.00%、27.50%、30.00%、32.50%、35.00%(W)]，分別考察其對馬齒莧總黃酮提取率的影響。

1.2.4.2料液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響。水浴溫度為40 ℃，在恒定的乙醇濃度32.50%、硫酸銨用量16.00%、提取時間30 min的條件下，稱取處理樣品2.0 g，選擇不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)，分別考察其對馬齒莧總黃酮提取率的影響。

1.2.4.3提取溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響。在恒定的乙醇濃度32.50%、硫酸銨用量16.00%、料液比1∶25、提取時間30 min的條件下，稱取處理樣品2.0 g，選擇不同超聲波處理溫度(30、40、50、60、70 ℃)，分別考察其對馬齒莧總黃酮提取率的影響。

1.2.4.4提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響。水浴溫度為40 ℃，在恒定的乙醇濃度32.50%(W)、硫酸銨用量16.00%(W)、料液比1∶25的條件下，稱取處理樣品2.0 g，選擇不同提取時間(20、30、40、50、60 min)，分別考察其對馬齒莧總黃酮提取率的影響。

1.2.5正交試驗。 稱取處理樣品2.0 g，以乙醇質(zhì)量濃度、提取溫度、料液比、提取時間為考察因素設(shè)計 L9(34)正交表，并按照此正交表安排試驗。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響。由圖1可知，在硫酸銨用量一定的情況下，隨著乙醇用量的增加，總黃酮提取率逐漸增加，當無水乙醇的用量為32.50%時達最大；此后，隨著無水乙醇用量的增加，總黃酮提取率顯著下降。其主要原因可能是：乙醇濃度過低不利于黃酮的浸出，隨著乙醇濃度的增加，雙水相體系的分相能力增加，乙醇在上層的體積也逐漸增加，總黃酮的溶解度增加，一些脂溶性有機物的溶出量也會增加，抑制了總黃酮的浸出，綜合考慮這些因素，確定最佳的無水乙醇含量為32.50%。

圖1　乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.1　Effects of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.2料液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響。由圖2可知，在硫酸銨和無水乙醇用量比例一定的情況下，隨著料液比的增加，總黃酮的提取率逐漸增加，當料液比為1∶25時達最大；此后，隨著料液比的增加，總黃酮提取率開始降低。原因可能是：料液比較小時，溶劑滲透并擴散到細胞內(nèi)的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴散的速度小，如果料液比較大時，雖然有利于溶劑進入細胞內(nèi)破壞疏水鍵，利于黃酮化合物向溶劑中擴散，但會耗費大量的溶劑和硫酸銨，綜合考慮，料液比選1∶25較好。

圖2　料液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響 Fig.2　Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.3提取溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響。從圖3可看出，當提取溫度為40 ℃時，馬齒莧中總黃酮提取率達最大；此后，溫度繼續(xù)升高，馬齒莧中總黃酮提取率開始下降。其主要原因是：雖然溫度增加能使分子運動加快，能增加黃酮類化合物的浸出，但也增加了乙醇的揮發(fā)，導致總黃酮提取率下降。另外溫度過高時，一定量的總黃酮可能會被氧化破壞。綜合考慮這些因素，選取最佳提取溫度為40 ℃。

圖3　提取溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.3　Effects of temperature on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.4提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響。由圖4可見，馬齒莧中總黃酮提取率在20～50 min時隨著提取時間的延長而升高，在50 min時達最大，繼續(xù)延長提取時間總黃酮提取率反而下降。原因可能是：在提取初期，馬齒莧中的總黃酮不斷浸出，隨著提取時間的延長，總黃酮的浸出率逐漸達到最大。如果繼續(xù)延長，乙醇揮發(fā)量增加，會引起總黃酮提取率降低。考慮到提取率以及節(jié)約能耗等方面的因素，選取最佳提取時間為50 min。

圖4　提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of time on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.2正交試驗在單因素考察的基礎(chǔ)上，為了得到更好的條件，采用 L9(34)正交表來安排正交試驗。由表1可知，各因素對馬齒莧總黃酮提取率影響由大到小依次為提取溫度、料液比、乙醇含量、提取時間，其中提取溫度對馬齒莧中總黃酮提取率的影響最大。由分析結(jié)果初步認為，乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧總黃酮的最佳條件為：在馬齒莧為2.0 g的情況下，硫酸銨為16.00%，無水乙醇用量27.50%、料液比1∶20、溫度60 ℃、時間40 min。

表1　正交試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3平行試驗為進一步驗證正交試驗結(jié)果的可考性和重現(xiàn)性，按照所得最佳條件做了3次平行試驗。結(jié)果表明，使用該方法優(yōu)化出了乙醇-硫酸銨雙水相提取馬齒莧總黃酮最佳工藝條件，在該條件下提取率為7.23%，不但提取率高，且試驗的重現(xiàn)性好。

3討論

(1)乙醇-硫酸銨雙水相提取法是一種新型的液-液萃取技術(shù)，反應(yīng)條件溫和，萃取時間短，提取效率高，操作簡便，乙醇、硫酸銨價格便宜，幾乎不存在有機殘留問題，是一種很有發(fā)展前途的提取方法。

(2)通過單因素試驗、正交試驗法，優(yōu)選出馬齒莧總黃酮的雙水相最佳提取工藝：脫脂馬齒莧粉末2.0 g，無水乙醇含量27.50%、硫酸銨16.00%、料液比1∶20、溫度60 ℃、時間40 min，在此條件下，馬齒莧總黃酮提取率為7.23%。

參考文獻

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Extraction of Total Flavonoids from Purslane Using Ethanol-Ammonium Sulfate Aqueous Two Phase System

HAO Hong-ying, NIU Mei-lan, WANG Yan et al

(Medical School, Huanghe Science and Technology College, Zhengzhou, Henan 450063)

Abstract[Objective] The aim was to optimize the extraction technology of total flavonoids from purslane using ethanol / ammonium sulfate aqueous two phase system. [Method] The flavonoids from purslane was extracted by using ethanol / ammonium sulfate aqueous two phase system. With total flavonoids yield as indicator, adopting single factor and orthogonal test, effects of solvent concentration, sloid-liquid ratio, time, temperature on extraction process were investigated. [Result] The optimal extraction conditions were: 2.0 g non-fat purslane powder, ethanol 27.50%(W), ammonium sulfate 16.00%(W), solid-liquid ratio 1∶20, temperature 60 ℃, and time was 40 min. Under the above conditions, the extraction rate of total flavonoids was 7.23%. [Conclusion] The extraction efficiency of ethanol-ammonium sulfate aqueous two phase system is high, the operation is simple, and the extracting solvent is cheap, so it is a promising extraction method.

Key wordsEthanol-ammonium aqueous two phase system; Purslane; Total flavonoids; Extraction technology; Orthogonal design

基金項目鄭州市科技局科研項目(20140787)；黃河科技學院大學生實踐創(chuàng)新項目(2015XSCXCY008)。

作者簡介郝紅英(1979- )，女，河南商丘人，副教授，碩士，從事制藥工程與天然產(chǎn)物提取研究。

收稿日期2016-03-15

中圖分類號S 567.21+9；R 284.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-145-03