馮連榮

(遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州 115213)

蓋楊葉片高頻植株再生體系建立

馮連榮

(遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州 115213)

摘要[目的]利用生物技術(shù)手段提高蓋楊抗寒性并擴(kuò)大其栽培區(qū)域。[方法]以蓋楊葉片為外植體，研究不同激素組合對蓋楊葉片分化及生根的影響，建立蓋楊葉片高頻植株再生體系。[結(jié)果]蓋楊不定芽分化最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂6.0 g/L，pH 6.5，不定芽再生頻率為96.67%，平均分化芽數(shù)20.3個；最適生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.0 g/L，pH 6.0，生根率可達(dá)100%，平均生根數(shù)15.8條。[結(jié)論]該研究建立了蓋楊高效組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)，為該楊樹品種的快速無性繁殖和基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞蓋楊；葉片；再生體系

蓋楊(PopulusgaixianensisZ.Wang et H.D.Chen sp.nov.)是1982年遼寧省楊樹研究所陳鴻雕等以圣馬丁諾楊(I-72/58)[P.euramericana(Dode)Guiner cv.‘San Martino’]和山海關(guān)楊(P.deltoidescv.‘Shanhaiguan’)為親本，通過室內(nèi)切枝水培雜交、集團(tuán)選擇培育出的多基因型、抗病速生楊雜交種[1-2]。蓋楊樹干通直，生長速度快，抗病蟲能力強(qiáng)，出材率高，是遼寧省重點(diǎn)推廣的楊樹良種之一，也是速生豐產(chǎn)林和紙漿林主要栽培品種之一[3]。蓋楊屬喜溫型品種[2]，該特性限制了其在高緯度寒冷地區(qū)的推廣。

近年來利用基因工程手段改良楊樹抗寒性逐漸被人們重視，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最為常見的方法[4-5]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是以無菌組培苗作為受體材料，一般采用葉片直接分化系統(tǒng)進(jìn)行外源目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化，這就需要建立穩(wěn)定、高效的組培再生體系[6]。高頻再生體系的建立是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的先決條件，關(guān)系到基因轉(zhuǎn)化的成敗。受體系統(tǒng)的建立則依賴于植物的組織培養(yǎng)技術(shù)。楊樹作為模式樹種，其組織培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，并在白楊派(毛白楊、銀白楊、新疆楊、山楊等)[7-11]，青楊派(滇楊、香楊、甜楊等)[12-15]，黑楊派(箭桿楊、歐美107楊、美洲黑楊、遼寧楊等)[16-22]，胡楊派(胡楊)[23]及派間雜種(銀中楊、中黑防楊等)[24-25]中廣泛應(yīng)用，但對蓋楊的組培再生還沒有相關(guān)報(bào)道。筆者建立了蓋楊高效組織培養(yǎng)再生體系，為該楊樹品種的快速無性繁殖和基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料2012年春從遼寧省楊樹研究所基因庫采回蓋楊萌生條，置于溫室內(nèi)進(jìn)行水培，每2～3 d換1次水，待嫩葉抽出后，以萌發(fā)的葉片為外植體進(jìn)行接種。

1.2方法

1.2.1蓋楊無菌外植體接種及分化培養(yǎng)基篩選。選取葉片長度大于1 cm的嫩葉，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺內(nèi)用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3遍，再用0.1%HgCl2消毒3 min，無菌水沖洗3遍，用無菌濾紙吸干葉片表面的水分。剪去葉兩端，并在葉片中間剪過主脈造成傷口，葉片向上接種于添加有不同激素組合(表1)的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中瓊脂為6.0 g/L，蔗糖為20～30 g/L，pH為6.5。每個處理接種3～4個葉片，接種后將各處理置于組培室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光照時間12 h/12 h，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。接種后每21 d轉(zhuǎn)接1次，注意觀察葉片分化情況，記錄開始分化時間、分化葉片數(shù)，45 d左右統(tǒng)計(jì)不定芽再生頻率，不定芽再生頻率=不定芽分化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；平均分化芽(個)=分化的不定芽總數(shù)/不定芽分化的外植體數(shù)。

1.2.2蓋楊生根培養(yǎng)基篩選。蓋楊生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)分別以MS和1/2MS作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA(0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L)，培養(yǎng)基中瓊脂6.0 g/L、蔗糖20 g/L、pH 6.0。剪取2～3 cm的蓋楊不定芽分別接種至對應(yīng)的培養(yǎng)基中，每個三角瓶中接種3～4個，每個配方重復(fù)4次，接種后將各處理置于組培室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照時間12 h/12 h，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。28 d后觀察各配方生根情況，統(tǒng)計(jì)生根率，生根率=生根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不定芽分化最適培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)了21個分化培養(yǎng)基配方，剪取幼嫩蓋楊葉片分別接種至各分化培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時間的增加，葉片兩端逐漸開始膨大，形成暗紅色愈傷組織，進(jìn)而分化形成單芽或叢生芽(圖1a、b)。45 d后統(tǒng)計(jì)分化葉片數(shù)、平均分化芽數(shù)、不定芽再生頻率，從不定芽再生頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，各配方芽再生頻率差異很大，范圍為9.52%～96.67%，其中配方14、15、16、17、18的培養(yǎng)基中不定芽再生頻率在90.00%以上，配方1的培養(yǎng)基中不定芽再生頻率最低(9.52%)。葉片開始分化時間集中在12～20 d，平均分化芽數(shù)為1.0～20.3個。結(jié)合葉片分化及芽生長情況、不定芽再生頻率、開始分化時間和平均分化芽數(shù)，確定配方14：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂6.0 g/L為蓋楊不定芽分化最適培養(yǎng)基。

表1　不同培養(yǎng)基中蓋楊葉片的分化情況

圖1　蓋楊葉片分化(a)及不定芽生長情況(b)Fig.1　Leaf differentiation(a) and adventitious bud growth (b)of Populus gaixianensis

2.2最適生根培養(yǎng)基篩選剪取2～3 cm蓋楊不定芽接種至各生根培養(yǎng)基配方中，7 d左右莖基部開始膨大并慢慢露出根原基，隨著培養(yǎng)時間延長根逐漸伸長，生出的根呈輻射狀，28 d統(tǒng)計(jì)生根率、平均根數(shù)。由表2可知，以1/2MS作為基本培養(yǎng)基時，不定芽生根率均可達(dá)100%，生出的莖段數(shù)量多(平均13個/株)且粗壯；以MS作為基本培養(yǎng)基時，生根率在71.4%～100%，生根數(shù)量也較多(平均8.3個/株)，但比較纖細(xì)。蓋楊不定芽生根時宜選擇1/2MS作為基本培養(yǎng)基。以1/2MS作為基本培養(yǎng)基時，IBA濃度為0.3 mg/L時生根數(shù)量最多(圖2a、b)，確定配方8：1/2MS+IBA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.0 g/L為蓋楊的最適生根培養(yǎng)基。

圖2　蓋楊生根苗(a)及生根情況(b)Fig.2　Rooting seedlings(a) and rooting(b) of Populus gaixianensis

3結(jié)論與討論

葉片直接分化系統(tǒng)不經(jīng)過組織脫分化直接誘導(dǎo)出不定芽，其優(yōu)點(diǎn)是體細(xì)胞無性系變異小、轉(zhuǎn)化的外源基因能穩(wěn)定地遺傳[6,26]。直接分化系統(tǒng)的建立受外植體的選擇、基本培養(yǎng)基、植物激素的種類和濃度等因素的影響。外植體的選擇是離體培養(yǎng)的首要步驟，楊樹的幼嫩莖段[19]、芽[18]、葉[21,25]、葉柄[12]等均可以作為外植體。木本植物不定芽誘導(dǎo)多數(shù)以MS作為基本培養(yǎng)基[26]，楊樹亦是如此，也有以1/2MS[10,12-13]、1/2MH[21]等進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)的報(bào)道。該試驗(yàn)以蓋楊葉片為外植體、MS為基本培養(yǎng)基確定了葉片不定芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基，獲得了較高的不定芽再生頻率。植物激素是組織器官分化的關(guān)鍵因素，不同激素組合和配比影響不定芽再生頻率的高低。楊樹組織培養(yǎng)中主要應(yīng)用的是細(xì)胞分裂素(6-BA、KT、TDZ等)，生長素(NAA、IBA、2,4-D、IAA等)和赤霉素(GA3)[27-31]。該試驗(yàn)用6-BA和NAA來誘導(dǎo)蓋楊不定芽獲得了較好的效果，不定芽再生頻率較高。6-BA/NAA也是影響其葉片分化的重要因素，試驗(yàn)中6-BA/NAA在5∶2～5∶1范圍內(nèi)，不定芽再生頻率較高，6-BA/NAA的升高和降低均不利于不定芽的形成，使不定芽再生頻率降低。

表2　不同培養(yǎng)基中蓋楊的生根情況

高頻再生體系最好是外植體直接分化出芽且不定芽再生頻率在90%以上，易于離體培養(yǎng)，且具有高度的重復(fù)性[6]。該試驗(yàn)以蓋楊葉片為外植體建立起葉片直接分化系統(tǒng)，篩選出葉片不定芽分化適宜培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂6.0 g/L，pH 6.5，葉片直接分化出芽，不定芽再生頻率為96.67%，平均分化芽數(shù)為20.3個，重復(fù)培養(yǎng)后不定芽再生頻率為100%；不定芽生根適宜培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.0 g/L，pH 6.0，不定芽生根率為100%，平均生根數(shù)為15.8條。蓋楊葉片高頻再生體系的建立為下一步開展基因工程抗性育種提供了基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)

[1] 李詠梅,馬學(xué)峰,蒲振興.遼河楊遼寧楊蓋楊在寧夏地區(qū)的引種試驗(yàn)[J].林業(yè)科技,2002,27(3):8-12.

[2] 王勝東,楊志巖.遼寧楊樹[M].北京:中國林業(yè)出版社,2006.

[3] 胡崇富,劉毅,王勝東,等.蓋楊的選育及其優(yōu)良特性[J].遼寧林業(yè)科技,1999(5)：13-15,21.

[4] HORSH R B.A simple and general method for transferring genes into plants[J].Science, 1985,227:1229-1231.

[5] 葉興國,王新敏,王坷,等.提高植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率輔助策略研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012, 45(15):3007-3019.

[6] 王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[7] 樊軍鋒,李玲,韓一凡,等.84K楊葉片外植體再生系統(tǒng)的建立[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2002,17(2):33-36.

[8] 李艷,王青,李紅艷,等.正交設(shè)計(jì)在毛白楊組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,27(3):334-335.

[9] 李慧,陳曉陽,李云,等.銀白楊葉片不定芽再生影響因素的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(3):46-50.

[10] 劉長莉,沈海龍,張羽,等.新疆楊組織培養(yǎng)技術(shù)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,32(1):5-7.

[11] 劉文萍,韓玉琴,南相日,等.山新楊組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005,21(2):101-102,121.

[12] 張春霞,樊軍鋒,黃建,等.滇楊的組織培養(yǎng)和植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(6):1131.

[13] 李開隆,靳春蓮,李明德,等.香楊的組織培養(yǎng)和植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,2009,45(3):281.

[14] 趙鑫聞.甜楊葉片高頻率植株再生體系的建立[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2015,31(34):6-9.

[15] 林元震,林善之,張志毅,等.甜楊的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40(4):463.

[16] 陶延珍,李楓,李毅.箭桿楊組織培養(yǎng)再生體系的建立[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,36(3):203-207.

[17] 孫宇飛,高秀華,趙彥修,等.歐美107楊組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立[J].山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,19(2):85-87.

[18] 李紅,王關(guān)林,李紅艷,等.美洲黑楊的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40(6):708.

[19] 康冰,王關(guān)平,張小紅,等.歐美黑楊離體再生途徑及影響因子的研究[J].西北植物學(xué)報(bào),2004,24(12):2355-2358.

[20] 張建華,莊天明,何林,等.歐美速生楊的離體繁殖體系[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版),2004,22(4):378-380.

[21] 楊傳平,鄭瓊,馬旭俊,等.歐美楊“山地1號”組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立[J].分子植物育種,2006,4(4):579-582.

[22] 趙鑫聞,彭儒勝,趙繼梅.遼寧楊葉片高頻植株再生體系的建立[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2015,31(10):13-16.

[23] 丁霞,陳曉陽,李云,等.胡楊葉片不定芽再生體系的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(2):28-31.

[24] 胡延?xùn)|,閆向東.銀中楊的組織培養(yǎng)試驗(yàn)[J].吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報(bào),2007,16(2):3-5.

[25] 程貴蘭,姜靜,蔡智軍.中黑防楊(美洲黑楊×青楊)的組織培養(yǎng)與植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40(5):585.

[26] 曹昆,李霞.木本植物組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)研究進(jìn)展[J].江蘇林業(yè)科技,2008,35(5):43-48.

[27] 司少鵬,周萍,陳家美.84K楊樹的離體快速繁殖試驗(yàn)[J].江蘇林業(yè)科技,2002,29(3):29.

[28] 于志水,金紅,苘勝軍,等.黑楊派楊樹組培再生系統(tǒng)的研究[J].遼寧林業(yè)科技,2002(6):11-13.

[29] 海燕,何寧,康明輝,等.抗蟲楊的組織培養(yǎng)[J].河南林業(yè)科技,2004,24(4):13-14.

[30] 惠楠.單倍體小黑楊抗生素敏感試驗(yàn)[J].林業(yè)科技,2004,29(4):7-9.

[31] 馬宗新,高玉祥,趙紅,等.三倍體速生楊樹的組織培養(yǎng)及應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,32(4):715-716.

Establishment of a High Efficient Plant Regeneration System ofPopulusgaixianensis

FENG Lian-rong

(Liaoning Provincial Institute of Poplar, Gaizhou, Liaoning 115213)

Abstract[Objective] The aim was to improve the cold resistance and expand its cultivation area of Populus gaixianensis by means of biotechnology.[Method] Leaves of P. gaixianensis were used as explants to study the effect of different hormone combinations on leaf differentiation and rooting, and establish a high efficient plant regeneration system.[Result] The results showed that the optimum medium for adventitious bud regeneration was MS +6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.20 mg/L+ sucrose 25 g/L+ agar 6.0 g/L, pH 6.5, with the frequency of adventitious bud regeneration of 96.67% and the number of shoots of 20.3; the optimum medium for rooting was 1/2MS+IBA 0.3 mg/L+sucrose 20 g/L+ agar 6.0 g/L, pH 6.0, the rooting rate could reach 100%, and the average number of rooting was 15.8.[Conclusion] The study establishes high efficient tissue culture regeneration system for P. gaixianensis, lays a foundation for rapid vegetative propagation and genetic transformation of genes.

Key wordsPopulus gaixianensis Z.Wang et H.D.Chen sp.nov.; Leaves; Regeneration system

基金項(xiàng)目遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項(xiàng)目(2014002016)。

作者簡介馮連榮(1983- )，女，黑龍江齊齊哈爾人，工程師，博士，從事楊樹轉(zhuǎn)基因育種及病蟲害防治研究。

收稿日期2016-03-07

中圖分類號S 723.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-209-03