王　霞，崔曉彤，李凡姝，許　青，楊　柳，肖志剛，3（.沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽　0034；.沈陽師范大學化學化工學院，遼寧沈陽　0034；3.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱　50030）

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擠壓超聲聯(lián)用提取的米糠多糖結構研究

王霞1，崔曉彤2，李凡姝1，許青1，楊柳1，*肖志剛1，3
（1.沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽110034；2.沈陽師范大學化學化工學院，遼寧沈陽110034；3.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

摘要：將米糠多糖粗液通過乙酸鋅－亞鐵氰化鉀法脫除蛋白質(zhì)得到的米糠多糖，用超濾技術分離純化得到抗氧化活性最為顯著的米糠多糖（RBS-Ⅱ）。采用高效液相凝膠滲透色譜法、光譜分析以及透射電鏡研究了RBS-Ⅱ的結構。結果表明，米糠多糖的分子量分布比較均勻；紅外光譜分析可知，多糖中存在α-糖苷鍵和β-糖苷鍵2種構型，含有酸性基團和蛋白質(zhì)基團；通過透射電鏡觀察可知，多糖在水溶液中多個糖鏈纏繞成股，每條多糖鏈自身發(fā)生扭曲纏繞，進而形成不同形狀的聚集體。

關鍵詞：米糠多糖；高效液相；光譜；透射電鏡；超濾

0　引言

我國是稻谷生產(chǎn)大國，稻谷碾白后的副產(chǎn)品——米糠，占稻谷總質(zhì)量的5%～7%，每年我國米糠的產(chǎn)量均超過1 000×104t［1-2］，所以有特別豐富的米糠資源。米糠中營養(yǎng)物質(zhì)比較豐富，但是絕大部分的米糠都被用作動物飼料，導致米糠資源未能得到合理的利用。雖然我國對米糠的加工利用率很低，但是世界上許多發(fā)達國家從上個世紀就開始了米糠的研究利用，并且研究技術已經(jīng)達到了一個很高的水平，利用米糠生產(chǎn)一些價值較高的產(chǎn)品，如米糠蛋白、米糠油、米糠多肽、植酸、谷維素和功能性膳食纖維等［3］。

米糠中的營養(yǎng)成分——米糠多糖的研究比較廣泛，它主要由葡萄糖通過α- 1，6糖苷鍵連接而成的一種雜聚糖。日本學者在研究米糠時發(fā)現(xiàn)了一些功能活性，這些功能活性的主要成分就是米糠多糖，之后便有學者開始對米糠多糖進行深入的研究［4］。米糠多糖有保健功能、顯著的生物活性和膳食纖維所具有的生理功能，而且米糠多糖在抗腫瘤、免疫增強、抗細菌感染、降血糖及降血脂等方面也具有較高的生物活性［5-8］，通過對米糠多糖進一步的研究，以開拓米糠多糖應用的新領域。

本文對超濾技術分離純化后的活性米糠多糖RBS-Ⅱ的結構、組分和形貌特征進行研究，為米糠多糖的深入研究及其應用提供重要理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

通過擠壓超聲聯(lián)用，提取米糠多糖的最佳工藝參數(shù)制得米糠多糖粗液［9］，米糠多糖得率7.18%。將得到的米糠多糖粗液經(jīng)乙酸鋅-亞鐵氰化鉀法脫除蛋白質(zhì)，并通過超濾技術分離純化得到較高活性的米糠多糖RBS-Ⅱ［10］。

考馬斯亮藍G- 250，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；三氯乙酸，成都科龍化學試劑廠產(chǎn)品；Agilent 1100型高效液相色譜儀，America公司產(chǎn)品；GC- 2010型氣相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；VERTEX型傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker公司產(chǎn)品；JEM- 1200EX型透射電子顯微鏡，日本日立公司產(chǎn)品；TU- 1800型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；DF110型電子分析天平，中國輕工機械總公司常熟衡器工業(yè)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1米糠多糖RBS-Ⅱ純度的鑒定

多糖屬于大分子化合物，通常由不同分子量多糖組成。因此，多糖的純度并不是指單純的某一種物質(zhì)，而是在一定范圍內(nèi)的均一組分，即便是純品其純度也是不均一的［11］。

配置米糠多糖待測液，用0.45 μm微孔過濾膜過濾，取過濾液2 mL過Sephadex G- 100型柱，用水溶液洗脫，10 mL /管，用苯酚-硫酸法進行跟蹤檢測，于波長490 nm下測得的吸光度對洗脫管數(shù)作圖，得到洗脫曲線。

1.2.2高效液相凝膠滲透色譜法測定米糠多糖分子量

米糠多糖溶解于流動相中，經(jīng)微孔過濾膜過濾后供進樣。在測定過程中，選用TSK型和UltrahydrogelTMLinear型（300 mm×7.8 mm ID×2）色譜柱雙柱串聯(lián)，利用Waters- 2410型示差折光檢測器進行檢測，測得流動相為0.1 mol/L的硝酸鈉，流速為0.9 mL/min，柱溫為45℃，進樣量為20 μL，并且記錄樣品的色譜曲線。在相同條件下按照HPLC將7種相對分子量為1 800，4 600，21 400，41 100，133 800，2 000 000的標準Dextran相繼進樣，并且記錄每種樣品的保留時間tR，然后以tR為橫坐標、LgM為縱坐標，畫出標準曲線。在相同的試驗條件下得到樣品RBPS2a的色譜曲線，最后選用Millennium 2010（Waters）軟件分析該樣品的保留時間，最終得到了樣品的相對分子量［12］。

1.2.3多糖樣品中單糖組成分析

（1）多糖水解。稱取多糖樣品5 mg，加入3 mL 的2 mol/L三氯乙酸。120℃下水解4 h，取出，加入少量的甲醇，充氮氣至揮發(fā)蒸干，以除盡三氯乙酸，得到多糖水解物。

（2）單糖的乙?；７謩e在單糖標準品和多糖水解產(chǎn)物中，加入0.5 mL無水吡啶，2 mg的肌醇六乙酰酯，10 mg的鹽酸羥胺，90℃下水解30 min，取出后冷卻。在冷卻后的溶液中加入0.5 mL無水乙酸酐，90℃下進行30 min乙?；?，得到多糖的糖腈乙酸酯衍生物經(jīng)微孔過濾膜過濾，濾液直接進樣，進行氣相色譜分析。

（3）色譜柱條件。色譜柱為石英毛細管柱（30 m×0.25 mm），載氣N2，流速1.2 mL/min，H230 mL/min，空氣300 mL/min；進樣溫度280℃，F(xiàn)ID檢測器溫度260℃，柱溫150℃；升溫程序0 min→7℃/min→190℃，0 min→15℃/min→250℃，2 min，進樣量0.5 μL［13-15］。

1.2.4光譜分析

（1）紫外可見光光譜分析。將制得的多糖樣品配成2 mg/mL的溶液，以蒸餾水作空白對照，于400～190 nm進行全波長紫外掃描。取0.2 mL上述溶液，加入0.4 mL 5%苯酚和2 mL濃硫酸，以0.2 mL蒸餾水加0.4 mL 5%苯酚及2 mL濃硫酸為空白對照，于700～190 nm進行全波段掃描［16］。

（2）紅外光譜分析。米糠多糖的黏度較大并且吸濕性特別強，無法在紅外光燈下與KBr進行混合研磨。所以，首先要將多糖樣品配成2 mg/mL的溶液后進行紅外光譜的掃描。方法見參考文獻［17］。

1.2.5形貌特征分析——透射電鏡（TEM）觀察

配置質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL的樣品溶液，將其蘸在涂有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置15 min，再用醋酸鈾染色15 min，避光放置25 min，在H- 7650型透射電子顯微鏡觀察拍照。

2　結果與分析

2.1米糠多糖RBS-Ⅱ純度的鑒定

米糠多糖RBS-Ⅱ經(jīng)Sephadex G- 100型凝膠柱層析，最終得到的洗脫曲線中并不是由單一對稱峰組成，從而證明RBS-Ⅱ不是單一組分。在洗脫曲線中也有一個相對主峰，說明米糠多糖的純度相對較高。

RBS-Ⅱ在Sephadex G- 100型層析柱上的色譜見圖1。

2.2多糖分子量的測定

圖1　RBS-Ⅱ在Sephadex G- 100型層析柱上的色譜

米糠多糖RBS-Ⅱ的相對分子量見表1。

表1　米糠多糖RBS-Ⅱ的相對分子量

在結構分析之前需要對分離純化后活性組分RBS-Ⅱ的相對分子量做出鑒定，本研究采用高效液相凝膠滲透色譜法測定了RBS-Ⅱ的相對分子量，測得RBS-Ⅱ的數(shù)均分子量Mn為72 912 Da，重均分子量Mw為73 492 Da，多分散系數(shù)Mw/Mn為1.007。Mw/Mn值接近1.0，RBS-Ⅱ的Mw/Mn值為1.007，說明RBS-Ⅱ的相對分子量分布較均勻。

2.3多糖樣品中單糖組成分析

單糖標樣的糖腈乙?；瘹庀嗌V見圖2，RBS-Ⅱ樣品單糖的糖腈乙酰化氣相色譜見圖3。

圖2　單糖標樣的糖腈乙?；瘹庀嗌V

圖3　RBS-Ⅱ樣品單糖的糖腈乙?；瘹庀嗌V

本試驗結果與相關文獻報道米糠多糖的單糖組成木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比約為2∶4∶1∶4，有較大差別，這可能是由于米糠提取工藝不同。本試驗采取擠壓聯(lián)合超聲提取米糠多糖，而文獻中采用熱水浸提法，擠壓和超聲等物理破碎作用使得單糖組成差別較大；本試驗的原料采用東北地區(qū)的稻米副產(chǎn)物，而文獻中的原料采用華南地區(qū)的稻米副產(chǎn)物，水稻品種的差異也可能造成米糠中多糖的單糖組成有一定的差別。

2.4光譜分析

2.4.1紫外光譜分析

米糠多糖RBS-Ⅱ的紫外光譜見圖4，米糠多糖RBS-Ⅱ經(jīng)苯酚-硫酸顯色后的紫外光譜見圖5。

圖4　米糠多糖RBS-Ⅱ的紫外光譜

圖5　米糠多糖RBS-Ⅱ經(jīng)苯酚-硫酸顯色后的紫外光譜

由圖4所示，米糠多糖RBS-Ⅱ水溶液在190～400 nm波長范圍掃描，掃描光譜結果表明，在波長285 nm附近有弱吸收，說明RBS-Ⅱ中含有蛋白質(zhì)成分，在前面試驗中米糠多糖中沒有游離蛋白質(zhì)的存在，所以可以判定，米糠多糖中含有一定量的多糖-蛋白質(zhì)結合物。而大量的研究證明，很多的糖蛋白在細胞表面有一定的識別作用，也存在抗原抗體的結合。如圖5所示，RBS-Ⅱ的水溶液在經(jīng)苯酚-硫酸溶液顯色后，在490 nm附近產(chǎn)生了強特征吸收峰，從而說明了該提取物是一種多糖。

2.4.2紅外光譜分析

米糠多糖RBS-Ⅱ的紅外光譜見圖6。

紅外光譜法（IR）是研究有機化合物分子結構的一種極其重要方法，通常是根據(jù)多糖的特征吸收峰來鑒多糖的某些基團。米糠多糖的紅外光譜研究發(fā)現(xiàn)，在3 400 cm-1出現(xiàn)的寬峰是多糖分子內(nèi)或分子間氫鍵O- H伸縮振動的表現(xiàn)；2 932 cm-1和1 839 cm-1出現(xiàn)的吸收峰分別是C- H伸縮振動和邊角振動引起的，以上吸收峰構成了多糖的特征吸收峰。在1734cm-1附近為羧基的特征吸收峰，表明多糖中可能存在酸性基團，含有一定量的糖醛酸，這與前面測定結果一致；在N- H變角振動區(qū)1 650～1 550 cm-1有明顯的蛋白質(zhì)吸收峰，表明該樣品是多糖-蛋白質(zhì)復合物，與前面試驗結果相符；在1 200～1 000 cm-1范圍內(nèi)2個吸收峰1 020 cm-1和1 161 cm-1是C- O伸縮振動引起的；在840 cm-1和890 cm-1附近有2個明顯的吸收峰，表明多糖中存在α-糖苷鍵和β-糖苷鍵2種構型。

圖6　米糠多糖RBS-Ⅱ的紅外光譜

2.5形貌特征分析——透射電鏡（TEM）觀察

米糠多糖RBS-Ⅱ透射電鏡見圖7。

圖7　米糠多糖RBS-Ⅱ透射電鏡

圖7（a）顯示了米糠多糖分子螺旋盤繞的形貌。米糠多糖是大分子化合物，結構比較復雜，多糖分子鏈并非單個糖鏈，由于多糖中還含有糖醛酸，1個糖鏈上羧基負離子的強電負性氧原子或糖醛酸羧基會與另一個鏈上羥基易發(fā)生糖鏈間氫鍵的締合，從而會形成多個糖鏈纏繞成股的多糖鏈。同時，由于每個多糖分子內(nèi)部也可形成分子內(nèi)氫鍵，自身發(fā)生扭曲纏繞，進而形成不同形狀的聚集體，每個聚集體單獨游離于溶液中。

圖7（b）顯示了在稀溶液中米糠多糖分子呈柏樹枝狀聚集態(tài)，因為多分子或分子集團聚集成不同式樣的束會形成這種聚集的狀態(tài)，通常這種聚集狀態(tài)會有1個或幾個相對的向外輻射，這種結構在多糖中具有普遍性，它是多糖在稀溶液中的四級結構。

3　結論

分離純化后的米糠多糖純度不高，在進行純度鑒定時，有2個較大的波峰，在紫外掃描也有蛋白質(zhì)的波峰，但考馬斯亮藍反應為陰性，所以判定存在多糖-蛋白質(zhì)的絡合物。在紅外光譜掃描分析中，米糠多糖中存在α-糖苷鍵和β-糖苷鍵2種構型，含有酸性基團和蛋白質(zhì)基團。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，多糖在水溶液中多個糖鏈會纏繞成股形成多糖鏈，同時每條多糖鏈還會自身發(fā)生扭曲纏繞，進而形成不同形狀的聚集體。

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Research on Structure of Rice Bran Polysaccharide by Extrusion in Conjunction with Ultrasound

WANG Xia1，CUI Xiaotong2，LI Fanshu1，XU Qing1，YANG Liu1，*XIAO Zhigang1，3
（1. College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China；2. College of Chemistry and Chemical Engineering，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China；3. College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030，China）

Abstract：In this paper，the crude rice bran polysaccharide as the material is studied that the removal of the rice bran polysaccharide protein in it by the method of zinc acetate- potassium ferrocyanide. And use high performance liquid gel permeation chromatography，spectroscopy and transmission electron microscopy to study the antioxidant activity of the most significant structural RBS-Ⅱ. The results show that the molecular weight of rice bran polysaccharide is more evenly distributed. Polysaccharides contain two conformations of α- glycoside bonds and β- glycoside bonds，respectively containing an acidic group and a protein group by infrared analysis. The experiment shows a plurality of sugar chains wound into strands in the aqueous solution，each polysaccharide chain wrapped and distorted，thereby formed aggregates of different shapes through a transmission electron microscope（TEM）.

Key words：rice bran polysaccharide；high performance liquid gel chromatography；spectrum；TEM；ultrafiltration technology

中圖分類號：TS210.9

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.034

文章編號：1671- 9646（2016）04b- 0016- 04

收稿日期：2016- 03- 21

基金項目：國家星火計劃重點項目（2015GA650007）；遼寧省“百千萬人才工程”資助項目（2013921038）；沈陽市科技創(chuàng)新專項資金項目（F14- 104- 3- 00）。

作者簡介：王霞（1991—），女，在讀碩士，研究方向為生物化工。

*通訊作者：肖志剛（1972—），男，博士，教授，研究方向為糧食油脂及植物蛋白工程。