張小建，李曉潔，廖梅旭，彭禮繁，余 鯤，曹雪華，賈彥全，鄧 芳，呂 群

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科輔助生殖醫(yī)學中心，四川 成都 610072)

凍融胚胎移植周期中不同發(fā)育階段胚胎妊娠結(jié)局比較

張小建，李曉潔，廖梅旭，彭禮繁，余 鯤，曹雪華，賈彥全，鄧 芳，呂 群

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科輔助生殖醫(yī)學中心，四川 成都 610072)

目的 探討凍融胚胎移植周期中不同發(fā)育天數(shù)胚胎的發(fā)育潛能，為進一步提高FET妊娠率提供依據(jù)。方法 627例患者830個復蘇周期胚胎，根據(jù)冷凍時間不同，分為 D3 冷凍組(n=385)，D5 冷凍組(n=300)和 D6 冷凍組(n=145)，待患者內(nèi)膜達到8～12 mm 時，復蘇18～20 h(D3胚胎)或2～3 h(D5/D6)后移植。結(jié)果 移植胚胎數(shù)，D3組顯著高于D5和D6組(P< 0.05)，D5冷凍組的臨床妊娠率和著床率均顯著高于 D6 冷凍組(61.67% vs 51.03%，46.37% vs 37.94%，P< 0.01)和D3冷凍組(61.67% vs 40.26%，46.37% vs 24.57%，P< 0.01)，多胎妊娠率，D5>D6>D3組(P< 0.01)。結(jié)論 在患者有較多胚胎的情況下，進行囊胚培養(yǎng)冷凍，選擇囊胚進行冷凍周期移植能夠取得更好的臨床結(jié)局。

凍融胚胎移植；玻璃化冷凍；臨床妊娠率；著床率

凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)作為體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)的重要補充，在提高累積妊娠率、降低多胎率和預防卵巢過度刺激綜合征等方面起著重要作用。同時對某些特殊病例，比如取卵當日無法獲得精子等，采用玻璃化冷凍技術(shù)冷凍卵子，是避免取消周期的最佳方法[1]。影響FET成功率的因素很多，一般認為胚胎因素更重要。囊胚階段的胚胎由于其本身經(jīng)過體外培養(yǎng)的優(yōu)選，具有更高的臨床妊娠結(jié)局。但是分裂期胚胎由于具有較多胚胎數(shù)量，能夠有更多的移植機會，同樣也能夠通過增加移植次數(shù)來為患者帶來理想的妊娠結(jié)局。本研究回顧性分析我中心2014月1月至2015年6月830個FET周期的臨床資料，探討冷凍時機和胚胎因素對FET結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年1月至2015年6月在我中心接受FET治療的627例患者(830個周期)，均因輸卵管盆腔因素及男方因素接受輔助生殖治療。根據(jù)胚胎發(fā)育階段分為D3組(n=385)、D5組(n=300)和D6組(n=145)?；颊咴谌÷押蟮谌鞗Q定是否行新鮮周期移植，將剩余的胚胎根據(jù)患者知情選擇情況進行D3天冷凍或行囊胚培養(yǎng)至D5或D6，將養(yǎng)成的可利用囊胚再次冷凍。三組中原發(fā)不孕、平均不孕年限比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

1.2 方法 ①所有患者采用黃體期長方案或月經(jīng)第二天短方案進行治療，促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)抑制劑(Orgalutran，NV Organon)聯(lián)合重組促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)，超排卵，當兩個以上卵泡> 18 mm 時，給予250～500 μg 人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)，36～38 h 取卵，取卵日為D0。②授精:胚胎培養(yǎng)和胚胎選擇卵母細胞收集后放置于G-IVF溶液中進一步成熟培養(yǎng)大約4 h，常規(guī)體外授精或ICSI。ICSI 操作最晚在hCG注射后42 h 前進行。授精16～18 h 后觀察受精情況。將受精卵培養(yǎng)在分裂期培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)直至移植。當胚胎培養(yǎng)到Day3會根據(jù)患者內(nèi)膜等因素決定是否施行新鮮周期移植，不管移植與否都會對患者進行知情告知，對胚胎進行冷凍或者繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段(Day5/Day6)后再冷凍。③胚胎冷凍:所有階段的胚胎均采用相同的冷凍方法，具體步驟為:胚胎在G-MOPS緩沖液中清洗后放入分別含7.5%(v/v)二甲基亞砜和乙二醇的平衡液中放置2 min，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到分別含15%二甲基亞砜和乙二醇的玻璃化液中清洗3～5 次，然后放置到載體，迅速放入液氮，胚胎在玻璃化液中的處理時間不超過45s。每個冷凍載體胚胎放置數(shù)量不超過3枚。④胚胎解凍:D3 的分裂期胚胎于移植前一天下午進行，解凍溶液采用G-MOPS緩液為基礎(chǔ)液，胚胎從液氮中取出放入0.8mol/L 蔗糖溶液1 min，0.6 mol/L 1 min，0.33 mol/L 2 min，0.2 mol/L 3 min，然后胚胎轉(zhuǎn)入基礎(chǔ)液中5 min，移入囊胚培養(yǎng)液培養(yǎng)直至移植。D5/D6的囊胚解凍于移植日當天進行，方法為，首先在0.33 mol/L的蔗糖溶液中2 min，0.2 mol/L蔗糖溶液3 min，然后胚胎轉(zhuǎn)入基礎(chǔ)液中5 min，移入囊胚培養(yǎng)2～3小時后移植。解凍操作溫度均為37 ℃。胚胎解凍后，半數(shù)及以上的卵裂球存活，定義為胚胎存活；沒有卵裂球損傷，定義為全胚胎存活。移植日觀察胚胎發(fā)育情況，若卵裂球較解凍日增加，則定義該胚胎繼續(xù)發(fā)育。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，方差分析及q檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。P< 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

移植胚胎數(shù)，D3組顯著高于D5和D6組(P< 0.05)，D5冷凍組的臨床妊娠率和著床率均顯著高于 D6 冷凍組(均P< 0.01)，多胎妊娠率，D5和D6組極顯著高于D3組(P< 0.01)，同時D5組顯著高于D6組(P< 0.05)，見表1。

表1 三組妊娠結(jié)局比較

3 討論

近年來FET逐漸成為輔助生殖技術(shù)的重要組成部分，也有越來越多的學者致力于研究影響FET成功率的因素，但結(jié)論不盡一致。目前全胚冷凍后擇期FET是卵巢過度刺激綜合征(OHSS)高危傾向、HCG日血孕酮值升高、子宮內(nèi)膜薄等一些不適合新鮮周期移植的患者，減少OHSS等并發(fā)癥發(fā)生，提高種植率，改善妊娠結(jié)局的重要措施。對于部分全胚冷凍患者，特別是OHSS高?；颊撸@卵數(shù)多，可利用胚胎相對多，冷凍需時間長、費用高。如能在確保患者妊娠率的前提下，行囊胚培養(yǎng)后冷凍，則能減少可利用囊胚的冷凍數(shù)目，降低冷凍費用，同時也為單囊胚移植、避免多胎妊娠提供了可能。本研究著重分析冷凍時機及胚胎因素對FET結(jié)局的影響。

受精后冷凍胚胎時機對妊娠結(jié)局的影響，目前尚無統(tǒng)一標準。學者對此做了研究，結(jié)論尚不統(tǒng)一，有研究發(fā)現(xiàn)合子期，受精后D2和D3胚胎的復蘇率差異有顯著性，認為冷凍時胚胎的發(fā)育階段對復蘇率有明顯影響，但對臨床妊娠率幾乎無影響[2]。但是，本文中比較的D3，D5和D6胚胎，在復蘇存活率方面差異無統(tǒng)計學意義，但是臨床妊娠率差異有統(tǒng)計學意義。盡管本文中比較的胚胎發(fā)育階段與SALUMETS的不同，但是有一點可以肯定的是，胚胎從合子期到囊胚期，由于培養(yǎng)時間的延長，更有利于選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，對提高妊娠率也是有明顯益處的。但是胚胎存活率由于選擇的冷凍方法目前有了較大的改進，特別是玻璃化冷凍法應用以來，對于各個發(fā)育階段的胚胎都能夠獲得一個較高的復蘇存活率。

盡管目前FET周期胚胎和囊胚移植的臨床效果尚存在爭議，但越來越多研究認為FET周期囊胚移植能獲得良好的妊娠結(jié)局，在輔助生殖技術(shù)(ART)助孕中具有良好的應用前景[3]。任新玲等[4]認為，囊胚發(fā)育速度對妊娠結(jié)局無影響，即使囊胚發(fā)育速度較慢，D6 天才形成3期以上囊胚，復蘇后移植對妊娠率也無不良影響。然而，李城等[5]研究認為在冷凍復蘇的單囊胚移植周期中，D5囊胚移植的生化妊娠率和臨床妊娠率和種植率均顯著高于D6囊胚。從本研究結(jié)果也可看出，D5天囊胚的臨床妊娠率和著床率都顯著高于D6天囊胚。就其原因，Desai 等[6]認為即便是質(zhì)量較好、完全擴張的 D6囊胚，相對于D5囊胚，由于囊胚細胞數(shù)的增加，導致更多的新陳代謝活動和更大的囊胚腔，這些因素都可能對玻璃化冷凍復蘇的過程和結(jié)果造成影響。

本研究結(jié)果顯示，D5、D6的囊胚臨床妊娠率和著床率均顯著高于D3的分裂期胚胎，但這僅是對有囊胚移植患者進行的統(tǒng)計分析，部分患者因為沒有囊胚形成而沒有再次移植的機會，一定程度上對患者進行了篩選。因此，在臨床治療過程中，在具備穩(wěn)定的囊胚培養(yǎng)條件前提下。通過對患者的有效溝通，告知進行囊胚培養(yǎng)的有利于減少移植次數(shù)，增加每次移植的妊娠幾率，但是會減少胚胎利用率。在患者充分知情的前提下提倡進行囊胚培養(yǎng)。

[1] 耿潔，胡玉琴，劉蘭蘭.卵子玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植取精失敗周期中的應用[J].實用醫(yī)院臨床雜志，2014，11(1):156-157.

[2] 柳朝華，高士友，鄧朝暉，等.胚胎因素對冷凍胚胎移植周期結(jié)局的影響[J].海南醫(yī)學院學報.2010，(16)5:604-607.

[3] Healy MW，Patounakis G，Connell MT，et al.Does a frozen embryo transfer ameliorate the effect of elevated progesterone seen in fresh transfer cycles[J].Fertil Steril，2015[Epub ahead of print].

[4] 任新玲，章漢旺，劉群，等.復蘇周期單囊胚移植的影響因素分析[J].華中科技大學學報，2011，40(6):743-745.

[5] 李城，李梅，馬水英，等.不同發(fā)育天數(shù)凍融單囊胚移植的臨床結(jié)局比較[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2014，23(2):121-123.

[6] Desai NN，Goldberg JM，Austin C，et al.The new Rapid-i carrier is an effective system for human embryo vitrification at both the blastocyst and cleavage stage[J].Reproductive Biology & Endocrinology，2013，11(3):1-9.

Q813.7

A

1672-6170(2016)02-0123-03

2015-10-16；

2015-11-16)