范大為　劉凱　袁成剛　杜曉媛

124010 錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院病理教研室(范大為，杜曉媛)；124010 錦州，遼河油田總醫(yī)院歡喜嶺醫(yī)院 (范大為，袁成剛)；124010 錦州，遼河油田總醫(yī)院 (劉凱)

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Beclin-1與EZH2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義

范大為劉凱袁成剛杜曉媛

124010 錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院病理教研室(范大為，杜曉媛)；124010 錦州，遼河油田總醫(yī)院歡喜嶺醫(yī)院 (范大為，袁成剛)；124010 錦州，遼河油田總醫(yī)院 (劉凱)

【摘要】目的探討自噬相關(guān)基因Beclin-1和果蠅Zeste同源物增強(qiáng)子2(EZH2)基因在腎透明細(xì)胞癌(腎癌)中的表達(dá)水平及其相關(guān)性，分析其預(yù)測(cè)腎癌預(yù)后的作用。方法收集30對(duì)腎腫瘤及癌旁腎組織新鮮標(biāo)本以及133例腎癌石蠟組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色法(免疫組化)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)上述標(biāo)本中Beclin-1及EZH2的表達(dá)情況，分析Beclin-1與EZH2表達(dá)的相關(guān)性，以及兩者對(duì)預(yù)測(cè)腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)及生存率的差異，并使用Cox回歸分析腎癌的病理分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、性別與兩者表達(dá)的相關(guān)性，探討其是否為腎癌預(yù)后的影響因素。結(jié)果30對(duì)腎癌及癌旁腎組織中，腎癌組織中Beclin-1蛋白及mRNA表達(dá)水平均低于癌旁腎組織，而EZH2蛋白及mRNA表達(dá)水平均高于癌旁腎組織(P均<0.01)。133例腎癌石蠟標(biāo)本中，Beclin-1陰性表達(dá)60例，陽(yáng)性73例；EZH2陰性67例，陽(yáng)性66例，EZH2表達(dá)與Beclin-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.574，P<0.01)。與單純EZH2陽(yáng)性表達(dá)及Beclin-1陰性表達(dá)者相比，EZH2陽(yáng)性且Beclin-1陰性者的腫瘤復(fù)發(fā)率高、生存率低(P<0.05)。腫瘤分級(jí)、分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、EZH2及Beclin-1表達(dá)水平是腎細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)、死亡的影響因素。結(jié)論腎癌組織中Beclin-1與EZH2表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)， EZH2可能參與沉默Beclin-1表達(dá)；Beclin-1低表達(dá)、EZH2高表達(dá)可能與腎癌預(yù)后不良有關(guān)，兩者可能成為腎癌個(gè)體化治療的潛在靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】腎透明細(xì)胞癌；自噬相關(guān)基因；果蠅Zeste同源物增強(qiáng)子2；預(yù)后

腎透明細(xì)胞癌(腎癌)占成人惡性腫瘤的3%。近年腎癌的發(fā)病率較以前有所升高[1-2]。腎癌對(duì)放射治療及化學(xué)治療反應(yīng)欠佳，手術(shù)切除是唯一可能治愈的方法，但術(shù)后有近30%的復(fù)發(fā)率[2]。對(duì)于20%初次就診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，需要進(jìn)行免疫或靶向治療[1]。目前，免疫或靶向治療的有效率約25%～35%，主要靶向分子為表皮生長(zhǎng)因子受體[3]。要提高治療的成功率，尚要尋找更加敏感的治療靶點(diǎn)。自噬是選擇性、非胱抑素依賴的程序性細(xì)胞死亡，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及腫瘤的發(fā)生過程關(guān)系密切[4-5]。自噬相關(guān)基因Beclin-1在不同腫瘤中的表達(dá)情況不盡相同[6]。Beclin-1的表觀遺傳學(xué)改變是其表達(dá)下調(diào)的主要調(diào)控機(jī)制之一[7]。果蠅Zeste同源物增強(qiáng)子2(EZH2)為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；傅恼{(diào)控作用，參與靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且其參與的基因沉默機(jī)制與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶參與的基因沉默機(jī)制及組蛋白的乙酰化修飾存在交互作用。本研究檢測(cè)了腎癌組織中Beclin-1與EZH2的表達(dá)水平，分析其相關(guān)性，擬初步探討兩者聯(lián)合指標(biāo)預(yù)測(cè)對(duì)腎癌預(yù)后的預(yù)測(cè)作用。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

收集2011年1月至2013年1月在遼河油田總醫(yī)院行腎癌根治術(shù)的30對(duì)腎癌和癌旁腎組織新鮮標(biāo)本，來源者男21例、女9例，年齡≤65歲17例、>65歲13例，開放手術(shù)18例、腹腔鏡手術(shù)12例，腫瘤分期T1～T4分別為11、8、5、6例，腫瘤分級(jí)G1～G3級(jí)分別為9、12、9例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1例。另收集2005年5月至2009年5月在遼寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及遼河油田總醫(yī)院進(jìn)行腎癌根治術(shù)的133例患者腎癌石蠟組織標(biāo)本。來源者男74例、女59例，年齡≤65歲41例、>65歲92例，開放手術(shù)42例、腹腔鏡手術(shù)91例，腫瘤分期T1～T4分別為50、33、30、17例，腫瘤分級(jí)G1～G3級(jí)分別為15、52、56例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。

二、Beclin-1、EZH2蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)，按照試劑盒說明書操作。Beclin-1抗體(美國(guó)Santa Cruz，1∶200稀釋)；EZH2(美國(guó)Abcam，1∶100)。以β-actin為內(nèi)參照，各組所得條帶灰度值與β-actin灰度值之比為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

三、Beclin-1、EZH2 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，按照試劑說明書進(jìn)行。即用型實(shí)時(shí)定量 PCR (qPCR) 試劑盒SYBR Green qPCR SuperMix購(gòu)自日本Takara公司， PRISM?7500 快速熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。引物序列由本課題組成員自行設(shè)計(jì)并驗(yàn)證，由日本Takara公司協(xié)助合成，具體為：Beclin-1上游5’-ACCGTCTCCATTCTGAAACT-3’、下游5’-ATC-TGCCTCACCCACTTTT-3’；EZH2上游5’-TGGGTGAGGCAGATGCAAAGA-3’、下游5’-CAGGTGGA-GTGAATGGTGC-3’、對(duì)照物GAPDH上游5’-AGC-GCACCATTCACTCCAC-3’、下游5’-GTGATCCGCG-GGATGTTCT-3’。

四、Beclin-1的免疫組織化學(xué)檢測(cè)

檢測(cè)方法遵循既往文獻(xiàn)報(bào)道[8]。Beclin-1主要表達(dá)于細(xì)胞漿，細(xì)胞核和包膜基本無表達(dá)。EZH2在胞核及胞漿均有表達(dá)。染色強(qiáng)度分為4級(jí)：無陽(yáng)性染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張切片至少隨機(jī)選取10個(gè)高倍(200倍)鏡下視野分析陽(yáng)性細(xì)胞比例，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：0%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。綜合評(píng)分為染色強(qiáng)度積分與陽(yáng)性細(xì)胞比例積分之積，本研究以綜合評(píng)分≥4分為陽(yáng)性，﹤4分為陰性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、Beclin-1及EZH2在腎癌及癌旁腎組織中的蛋白表達(dá)水平

30對(duì)腎癌及癌旁腎組織中，腎癌組織中Beclin-1蛋白及mRNA表達(dá)水平均低于癌旁腎組織，而EZH2蛋白及mRNA表達(dá)水平均高于癌旁腎組織(P均<0.001)，見圖1。

圖1　腎癌及癌旁腎組織中Beclin-1及EZH2表達(dá)水平

A：蛋白免疫印跡結(jié)果；B：實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果；**P<0.01

二、腎癌組織中Beclin-1與EZH2表達(dá)的相關(guān)性分析

133例腎癌石蠟標(biāo)本中，Beclin-1陰性表達(dá)60例，陽(yáng)性73例；EZH2陰性67例，陽(yáng)性66例，見圖2。EZH2表達(dá)強(qiáng)度與Beclin-1表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.574，P<0.001)。

圖2　Beclin-1及EZH2在腎癌石蠟組織標(biāo)本中的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×200)

A、B、C：正常腎組織；D、E、F：無復(fù)發(fā)腎癌組織；G、H、I：復(fù)發(fā)腎癌組織；A、D、G：Beclin-1；B、E、H：EZH2；C、F、I：蘇木素-伊紅染色

三、Beclin-1聯(lián)合EZH2對(duì)腎癌復(fù)發(fā)及生存的預(yù)測(cè)價(jià)值

在133例腎癌石蠟標(biāo)本中，Beclin-1陽(yáng)性且EZH2陰性32例， Beclin-1陰性且EZH2陰性者30例，Beclin-1陽(yáng)性且EZH2陽(yáng)性者34例，EZH2陽(yáng)性且Beclin-1陰性37例。與單純EZH2陽(yáng)性表達(dá)及Beclin-1陰性表達(dá)者相比，EZH2陽(yáng)性且Beclin-1陰性者的腫瘤復(fù)發(fā)率高、生存率低(P均<0.05)，見圖3。

圖3　Beclin-1陽(yáng)性和(或)EZH2陽(yáng)性對(duì)腎癌患者生存率的影響

A：4組患者的腎癌復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；B：4組患者的病死率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)

四、單因素及多因素模型的構(gòu)建

對(duì)于腫瘤復(fù)發(fā)這一觀察終點(diǎn)，單因素分析顯示腫瘤分級(jí)、原發(fā)腫瘤病理分期、淋巴結(jié)狀態(tài)及Beclin-1及EZH2表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。進(jìn)一步多因素Cox回歸分析顯示腫瘤分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、EZH2及Beclin-1表達(dá)水平是腎細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表1。對(duì)于腫瘤死亡這一觀察終點(diǎn)，單因素分析顯示腫瘤分級(jí)、原發(fā)腫瘤病理分期、淋巴結(jié)狀態(tài)及Beclin-1及EZH2表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。進(jìn)一步多因素Cox回歸分析顯示腫瘤分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、EZH2及Beclin-1表達(dá)水平是腎細(xì)胞癌術(shù)后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表2。

表1　腎癌術(shù)后首次復(fù)發(fā)獨(dú)立危險(xiǎn)因素單因素及多因素分析

討論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)展，多個(gè)與腎癌相關(guān)的分子如VHL、缺氧誘導(dǎo)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、碳酸苷酶、紅細(xì)胞生成素、Ki-67相繼被研究和證實(shí)，初步揭示了其在腎癌的早期診斷、預(yù)測(cè)腎癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及生存期的重要作用[9-16]。但上述分子指標(biāo)對(duì)腎癌的早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性有限，但仍然無法準(zhǔn)確判斷腎癌患者的復(fù)發(fā)、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)；也無法解決腎癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)。一些兼具更高敏感性和特異性的分子標(biāo)記有待進(jìn)一步的探討。

表2　腎癌術(shù)后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素單因素分析及多因素模型

Beclin-1基因是酵母ATG6的同系物,是介導(dǎo)哺乳動(dòng)物自噬的特異基因[6]。已經(jīng)證實(shí)通過上調(diào)Beclin-1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)可以激活自噬發(fā)生，進(jìn)而改變其表型。Beclin-1是自噬體形成過程中的一個(gè)關(guān)鍵分子，它介導(dǎo)其它自噬蛋白定位于吞噬泡中，從而調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體的形成與成熟。在自噬過程中Beclin-1的表達(dá)水平上調(diào)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1在腎癌組織中的蛋白及mRNA表達(dá)水平均低于癌旁腎組織，Beclin-1低表達(dá)的腎癌患者復(fù)發(fā)率、進(jìn)展率較高，生存率較低。多因素分析顯示，Beclin-1基因是腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示Beclin-1可能是腎癌的重要預(yù)后因子，為腎癌靶向治療提供了新的治療靶點(diǎn)。Beclin-1在惡性腫瘤表達(dá)下調(diào)可能與其自身表觀遺傳學(xué)改變密切相關(guān)[7]。表觀遺傳改變主要包括DNA甲基化、非編碼 RNA調(diào)控及組蛋白修飾。Beclin-1在各種腫瘤中表達(dá)下調(diào)的原因及機(jī)制仍未闡明。

EZH2屬于PcG家族蛋白，是PRC2轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體的核心組成部分，發(fā)揮基因沉默的作用[17]。EZH2自身還有組蛋白甲基化酶功能，使目的基因特定區(qū)域組蛋白甲基化，協(xié)同DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的CpG島甲基化，使目的基因啟動(dòng)子區(qū)核小體緊縮，轉(zhuǎn)錄失活[18-19]。有報(bào)道EZH2在腎癌中過度表達(dá)[20]。結(jié)合文獻(xiàn)資料和課題組研究結(jié)果，我們?cè)O(shè)想Beclin-1在腎癌中下調(diào)可能是因?yàn)镋ZH2過度表達(dá)所致。本研究顯示，腎癌組織中EZH2蛋白及mRNA表達(dá)水平均高于癌旁腎組織Beclin-1，在腎癌中的表達(dá)與EZH2呈負(fù)相關(guān)，EZH2陽(yáng)性且Beclin-1陰性者的腫瘤復(fù)發(fā)率及病死率高于單純EZH2陽(yáng)性表達(dá)及Beclin-1陰性表達(dá)者，提示Beclin-1低表達(dá)、EZH2高表達(dá)可能與腎癌預(yù)后有關(guān)，兩者間具體關(guān)系不明，有待更深入的研究。

綜上所述， Beclin-1及EZH2表達(dá)水平是腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)及生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為腎癌靶向治療提供新的潛在治療靶點(diǎn)。腎癌組織中Beclin-1與EZH2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，轉(zhuǎn)錄抑制因子EZH2可能與腎癌中Beclin-1基因沉默有關(guān)，這為后續(xù)研究Beclin-1在腎癌中低表達(dá)的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Bianchi M, Gandaglia G, Trinh QD, Hansen J, Becker A, Abdollah F, Tian Z, Lughezzani G, Roghmann F, Briganti A, Montorsi F, Karakiewicz PI,Sun M.A population-based competing-risks analysis of survival after nephrectomy for renal cell carcinoma.Urol Oncol,2014,32(1):46.e1-e7.

[3]Bagcchi S.Sunitinib still first-line therapy for metastatic renal cancer.Lancet Oncol,2014,15(10):e420.

[4]Orzechowski A, Bettuzzi S, Pawlikowska P, Paj?k B.Control of autophagy in cancer.Biomed Res Int, 2015,2015:698740.

[5]Peter ME. Programmed cell death: apoptosis meets necrosis. Nature,2011,471(7338):310-312.

[6]Wrighton KH.Autophagy: kinase crosstalk through beclin 1.Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(7):402-403.

[7]Li Z, Chen B, Wu Y, Jin F, Xia Y, Liu X.Genetic and epigenetic silencing of the beclin 1 gene in sporadic breast tumors.BMC Cancer,2010,10:98.

[8]Jiang Y, Zhang W, Kondo K, Klco JM, St Martin TB, Dufault MR, Madden SL, Kaelin WG Jr, Nacht M.Gene expression profiling in a renal cell carcinoma cell line: dissecting VHL and hypoxia-dependent pathways.Mol Cancer Res,2003,1(6):453-462.

[9]Phuoc NB, Ehara H, Gotoh T, Nakano M, Yokoi S, Deguchi T, Hirose Y. Immunohistochemical analysis with multiple antibodies in search of prognostic markers for clear cell renal cellcarcinoma. Urology, 2007,69(5):843-848.

[10]Tsutsumi H, Miyamoto C, Furuichi Y, Yoshiike M, Nozawa S, Iwamoto T. VHL tumor suppressor gene: its mutation and protein level in renal cell carcinoma.Oncol Rep,2003,10(5):1357-1361.

[11]趙磊，于德新. 腎癌預(yù)后分子標(biāo)記物研究新進(jìn)展.臨床泌尿外科雜志,2010,25(1): 64-71.

[12]Garcia-Roig M, Ortiz N, Lokeshwar V.Molecular marker for predicting treatment response in advanced renal cell carcinoma: does the promise fulfillclinical need? Curr Urol Rep,2014,15(1):375.

[13]Lidgren A, Hedberg Y, Grankvist K, Rasmuson T, Vasko J, Ljungberg B.The expression of hypoxia-inducible factor 1alpha is a favorable independent prognostic factor in renal cell carcinoma.Clin Cancer Res,2005,11(3):1129-1135.

[14]Ljungberg BJ, Jacobsen J, Rudolfsson SH, Lindh G, Grankvist K, Rasmuson T.Different vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF-receptor 1 and -2 mRNA expression profiles betweenclear cell and papillary renal cell carcinoma.BJU Int,2006,98(3):661-667.

[15]Bui MH, Visapaa H, Seligson D, Kim H, Han KR, Huang Y, Horvath S, Stanbridge EJ, Palotie A, Figlin RA, Belldegrun AS.Prognostic value of carbonic anhydrase IX and KI67 as predictors of survival for renal clear cell carcinoma.J Urol,2004,171(6 Pt 1):2461-2466.

[16]Rioux-Leclercq N, Turlin B, Bansard J, Patard J, Manunta A, Moulinoux JP, Guillé F, Ramée MP, Lobel B.Value of immunohistochemical Ki-67 and p53 determinations as predictive factors of outcome in renal cellcarcinoma.Urology,2000,55(4):501-505.

[17]Chase A, Cross NC.Aberrations of EZH2 in cancer.Clin Cancer Res,2011,17(9):2613-2618.

[18]Yoo KH, Hennighausen L.EZH2 methyltransferase and H3K27 methylation in breast cancer.Int J Biol Sci, 2012,8(1):59-65.

[19]Chang CJ, Hung MC.The role of EZH2 in tumour progression.Br J Cancer,2012,106(2):243-247.

[20]Liu L, Xu Z, Zhong L, Wang H, Jiang S, Long Q, Xu J, Guo J. Prognostic value of EZH2 expression and activity in renal cell carcinoma: a prospective study.PLoS One,2013,8(11):e81484.

(本文編輯：林燕薇)

Expression and significance of Beclin-1 and EZH2 in renal cell carcinoma

FanDawei,LiuKai,YuanChenggang,DuXiaoyuan.

LiaoningMedicalColleage,Jinzhou124010,ChinaCorrespondingauthor,DuXiaoyuan,E-mail：351844459@qq.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression levels and clinical significance of Beclin-1 and enhancer of zeste homolog 2 (EHZ2) in renal clear cell carcinoma (kidney cancer), aiming to evaluate the roles of Beclin-1 and EHZ2 in the prognosis of kidney cancer. MethodsWestern blot, real-time PCR and immunohistochemical staining were employed to detect the expression levels of Beclin-1 and EZH2 in renal tumors and paired adjacent normal tissues from 30 patients with renal clear cell carcinoma and paraffin-embedded specimens from 133 cases of kidney cancer, respectively. The correlation between EZH2 and Beclin-1 was analyzed. The roles of Beclin-1 and EZH2 in the prognosis of postoperative recurrence and survival were evaluated. The relationship between pathological grading, TNM staging, lymph node metastasis, age, gender and the expression of Beclin-1 and EZH2 was analyzed using Cox regression model, aiming to confirm the roles of Beclin-1 and EZH2 in the prognosis of kidney cancer. ResultsIn 30 cases of renal clear cell carcinoma and paired normal adjacent tissues, the expression of Beclin-1 at both mRNA and protein levels was significantly lower whereas the expression of EZH2 at both mRNA and protein levels was considerably higher compared with those in the adjacent normal renal tissues (all P<0.05). In 133 paraffin-embedded specimens, 60 were negative for Beclin-1 and 73 were positive for Beclin-1 expression, 67 were negative for EZH2 and 66 were positive for EZH2. The expression level of Beclin-1 was negatively correlated with EZH2 expression (rs=-0.574，P<0.01). Compared with patients who were positive for EZH2 or negative for Beclin-1, those with positive EZH2 and negative Beclin-1 had higher recurrence rate and shorter survival(P<0.05). Tumor grading and staging, lymph node status, EZH2 and Beclin-1 expression were influential factors of postoperative recurrence and survival in patients with renal clear cell carcinoma. ConclusionThe expression level of Beclin-1 is negatively correlated with EZH2 expression in renal cell carcinoma tissues. EZH2 probably participates in the silencing of Beclin-1 expression. Low expression of Beclin-1 and high expression of EZH2 might be associated with the prognosis of kidney cancer. EZH2 and Beclin-1 probably serve as potential targets of individualized therapy of renal cancer.

【Key words】Renal clear cell carcinoma; Autophagy-associated gene; EZH2；Prognosis

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.011

(收稿日期：2016-03-31)

·基礎(chǔ)研究論著·

通訊作者，杜曉媛，E-mail：351844459@qq.com