范大為　劉凱　袁成剛　杜曉媛

124010 錦州，遼寧醫(yī)學院病理教研室(范大為，杜曉媛)；124010 錦州，遼河油田總醫(yī)院歡喜嶺醫(yī)院 (范大為，袁成剛)；124010 錦州，遼河油田總醫(yī)院 (劉凱)

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Beclin-1與EZH2在腎透明細胞癌中的表達及其意義

范大為劉凱袁成剛杜曉媛

124010 錦州，遼寧醫(yī)學院病理教研室(范大為，杜曉媛)；124010 錦州，遼河油田總醫(yī)院歡喜嶺醫(yī)院 (范大為，袁成剛)；124010 錦州，遼河油田總醫(yī)院 (劉凱)

【摘要】目的探討自噬相關(guān)基因Beclin-1和果蠅Zeste同源物增強子2(EZH2)基因在腎透明細胞癌(腎癌)中的表達水平及其相關(guān)性，分析其預(yù)測腎癌預(yù)后的作用。方法收集30對腎腫瘤及癌旁腎組織新鮮標本以及133例腎癌石蠟組織標本，采用免疫組織化學染色法(免疫組化)、實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測上述標本中Beclin-1及EZH2的表達情況，分析Beclin-1與EZH2表達的相關(guān)性，以及兩者對預(yù)測腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)及生存率的差異，并使用Cox回歸分析腎癌的病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、性別與兩者表達的相關(guān)性，探討其是否為腎癌預(yù)后的影響因素。結(jié)果30對腎癌及癌旁腎組織中，腎癌組織中Beclin-1蛋白及mRNA表達水平均低于癌旁腎組織，而EZH2蛋白及mRNA表達水平均高于癌旁腎組織(P均<0.01)。133例腎癌石蠟標本中，Beclin-1陰性表達60例，陽性73例；EZH2陰性67例，陽性66例，EZH2表達與Beclin-1表達呈負相關(guān)(rs=-0.574，P<0.01)。與單純EZH2陽性表達及Beclin-1陰性表達者相比，EZH2陽性且Beclin-1陰性者的腫瘤復(fù)發(fā)率高、生存率低(P<0.05)。腫瘤分級、分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、EZH2及Beclin-1表達水平是腎細胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)、死亡的影響因素。結(jié)論腎癌組織中Beclin-1與EZH2表達呈明顯負相關(guān)， EZH2可能參與沉默Beclin-1表達；Beclin-1低表達、EZH2高表達可能與腎癌預(yù)后不良有關(guān)，兩者可能成為腎癌個體化治療的潛在靶點。

【關(guān)鍵詞】腎透明細胞癌；自噬相關(guān)基因；果蠅Zeste同源物增強子2；預(yù)后

腎透明細胞癌(腎癌)占成人惡性腫瘤的3%。近年腎癌的發(fā)病率較以前有所升高[1-2]。腎癌對放射治療及化學治療反應(yīng)欠佳，手術(shù)切除是唯一可能治愈的方法，但術(shù)后有近30%的復(fù)發(fā)率[2]。對于20%初次就診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者，需要進行免疫或靶向治療[1]。目前，免疫或靶向治療的有效率約25%～35%，主要靶向分子為表皮生長因子受體[3]。要提高治療的成功率，尚要尋找更加敏感的治療靶點。自噬是選擇性、非胱抑素依賴的程序性細胞死亡，與細胞的生長、增殖及腫瘤的發(fā)生過程關(guān)系密切[4-5]。自噬相關(guān)基因Beclin-1在不同腫瘤中的表達情況不盡相同[6]。Beclin-1的表觀遺傳學改變是其表達下調(diào)的主要調(diào)控機制之一[7]。果蠅Zeste同源物增強子2(EZH2)為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；傅恼{(diào)控作用，參與靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制，促進細胞的增殖，且其參與的基因沉默機制與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶參與的基因沉默機制及組蛋白的乙?；揎棿嬖诮换プ饔?。本研究檢測了腎癌組織中Beclin-1與EZH2的表達水平，分析其相關(guān)性，擬初步探討兩者聯(lián)合指標預(yù)測對腎癌預(yù)后的預(yù)測作用。

材料與方法

一、標本來源

收集2011年1月至2013年1月在遼河油田總醫(yī)院行腎癌根治術(shù)的30對腎癌和癌旁腎組織新鮮標本，來源者男21例、女9例，年齡≤65歲17例、>65歲13例，開放手術(shù)18例、腹腔鏡手術(shù)12例，腫瘤分期T1～T4分別為11、8、5、6例，腫瘤分級G1～G3級分別為9、12、9例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1例。另收集2005年5月至2009年5月在遼寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院及遼河油田總醫(yī)院進行腎癌根治術(shù)的133例患者腎癌石蠟組織標本。來源者男74例、女59例，年齡≤65歲41例、>65歲92例，開放手術(shù)42例、腹腔鏡手術(shù)91例，腫瘤分期T1～T4分別為50、33、30、17例，腫瘤分級G1～G3級分別為15、52、56例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。

二、Beclin-1、EZH2蛋白表達水平的檢測

采用蛋白免疫印跡法檢測，按照試劑盒說明書操作。Beclin-1抗體(美國Santa Cruz，1∶200稀釋)；EZH2(美國Abcam，1∶100)。以β-actin為內(nèi)參照，各組所得條帶灰度值與β-actin灰度值之比為蛋白相對表達水平。

三、Beclin-1、EZH2 mRNA表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR檢測，按照試劑說明書進行。即用型實時定量 PCR (qPCR) 試劑盒SYBR Green qPCR SuperMix購自日本Takara公司， PRISM?7500 快速熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。引物序列由本課題組成員自行設(shè)計并驗證，由日本Takara公司協(xié)助合成，具體為：Beclin-1上游5’-ACCGTCTCCATTCTGAAACT-3’、下游5’-ATC-TGCCTCACCCACTTTT-3’；EZH2上游5’-TGGGTGAGGCAGATGCAAAGA-3’、下游5’-CAGGTGGA-GTGAATGGTGC-3’、對照物GAPDH上游5’-AGC-GCACCATTCACTCCAC-3’、下游5’-GTGATCCGCG-GGATGTTCT-3’。

四、Beclin-1的免疫組織化學檢測

檢測方法遵循既往文獻報道[8]。Beclin-1主要表達于細胞漿，細胞核和包膜基本無表達。EZH2在胞核及胞漿均有表達。染色強度分為4級：無陽性染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張切片至少隨機選取10個高倍(200倍)鏡下視野分析陽性細胞比例，每個視野至少計數(shù)100個細胞，按陽性細胞所占百分比評分：0%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。綜合評分為染色強度積分與陽性細胞比例積分之積，本研究以綜合評分≥4分為陽性，﹤4分為陰性。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié)果

一、Beclin-1及EZH2在腎癌及癌旁腎組織中的蛋白表達水平

30對腎癌及癌旁腎組織中，腎癌組織中Beclin-1蛋白及mRNA表達水平均低于癌旁腎組織，而EZH2蛋白及mRNA表達水平均高于癌旁腎組織(P均<0.001)，見圖1。

圖1　腎癌及癌旁腎組織中Beclin-1及EZH2表達水平

A：蛋白免疫印跡結(jié)果；B：實時定量 PCR結(jié)果；**P<0.01

二、腎癌組織中Beclin-1與EZH2表達的相關(guān)性分析

133例腎癌石蠟標本中，Beclin-1陰性表達60例，陽性73例；EZH2陰性67例，陽性66例，見圖2。EZH2表達強度與Beclin-1表達強度呈負相關(guān)(rs=-0.574，P<0.001)。

圖2　Beclin-1及EZH2在腎癌石蠟組織標本中的表達情況(免疫組織化學染色，×200)

A、B、C：正常腎組織；D、E、F：無復(fù)發(fā)腎癌組織；G、H、I：復(fù)發(fā)腎癌組織；A、D、G：Beclin-1；B、E、H：EZH2；C、F、I：蘇木素-伊紅染色

三、Beclin-1聯(lián)合EZH2對腎癌復(fù)發(fā)及生存的預(yù)測價值

在133例腎癌石蠟標本中，Beclin-1陽性且EZH2陰性32例， Beclin-1陰性且EZH2陰性者30例，Beclin-1陽性且EZH2陽性者34例，EZH2陽性且Beclin-1陰性37例。與單純EZH2陽性表達及Beclin-1陰性表達者相比，EZH2陽性且Beclin-1陰性者的腫瘤復(fù)發(fā)率高、生存率低(P均<0.05)，見圖3。

圖3　Beclin-1陽性和(或)EZH2陽性對腎癌患者生存率的影響

A：4組患者的腎癌復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)；B：4組患者的病死率比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012)

四、單因素及多因素模型的構(gòu)建

對于腫瘤復(fù)發(fā)這一觀察終點，單因素分析顯示腫瘤分級、原發(fā)腫瘤病理分期、淋巴結(jié)狀態(tài)及Beclin-1及EZH2表達水平與腎細胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。進一步多因素Cox回歸分析顯示腫瘤分級、腫瘤分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、EZH2及Beclin-1表達水平是腎細胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素，見表1。對于腫瘤死亡這一觀察終點，單因素分析顯示腫瘤分級、原發(fā)腫瘤病理分期、淋巴結(jié)狀態(tài)及Beclin-1及EZH2表達水平與腎細胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。進一步多因素Cox回歸分析顯示腫瘤分級、腫瘤分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、EZH2及Beclin-1表達水平是腎細胞癌術(shù)后死亡的獨立危險因素，見表2。

表1　腎癌術(shù)后首次復(fù)發(fā)獨立危險因素單因素及多因素分析

討論

隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的不斷進展，多個與腎癌相關(guān)的分子如VHL、缺氧誘導(dǎo)因子、血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、碳酸苷酶、紅細胞生成素、Ki-67相繼被研究和證實，初步揭示了其在腎癌的早期診斷、預(yù)測腎癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風險及生存期的重要作用[9-16]。但上述分子指標對腎癌的早期診斷及預(yù)后預(yù)測的準確性有限，但仍然無法準確判斷腎癌患者的復(fù)發(fā)、進展及轉(zhuǎn)移的風險；也無法解決腎癌細胞對化學治療藥物產(chǎn)生耐藥性的缺點。一些兼具更高敏感性和特異性的分子標記有待進一步的探討。

表2　腎癌術(shù)后死亡的獨立危險因素單因素分析及多因素模型

Beclin-1基因是酵母ATG6的同系物,是介導(dǎo)哺乳動物自噬的特異基因[6]。已經(jīng)證實通過上調(diào)Beclin-1在哺乳動物細胞中的表達可以激活自噬發(fā)生，進而改變其表型。Beclin-1是自噬體形成過程中的一個關(guān)鍵分子，它介導(dǎo)其它自噬蛋白定位于吞噬泡中，從而調(diào)控哺乳動物自噬體的形成與成熟。在自噬過程中Beclin-1的表達水平上調(diào)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1在腎癌組織中的蛋白及mRNA表達水平均低于癌旁腎組織，Beclin-1低表達的腎癌患者復(fù)發(fā)率、進展率較高，生存率較低。多因素分析顯示，Beclin-1基因是腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存的獨立危險因素。提示Beclin-1可能是腎癌的重要預(yù)后因子，為腎癌靶向治療提供了新的治療靶點。Beclin-1在惡性腫瘤表達下調(diào)可能與其自身表觀遺傳學改變密切相關(guān)[7]。表觀遺傳改變主要包括DNA甲基化、非編碼 RNA調(diào)控及組蛋白修飾。Beclin-1在各種腫瘤中表達下調(diào)的原因及機制仍未闡明。

EZH2屬于PcG家族蛋白，是PRC2轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體的核心組成部分，發(fā)揮基因沉默的作用[17]。EZH2自身還有組蛋白甲基化酶功能，使目的基因特定區(qū)域組蛋白甲基化，協(xié)同DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的CpG島甲基化，使目的基因啟動子區(qū)核小體緊縮，轉(zhuǎn)錄失活[18-19]。有報道EZH2在腎癌中過度表達[20]。結(jié)合文獻資料和課題組研究結(jié)果，我們設(shè)想Beclin-1在腎癌中下調(diào)可能是因為EZH2過度表達所致。本研究顯示，腎癌組織中EZH2蛋白及mRNA表達水平均高于癌旁腎組織Beclin-1，在腎癌中的表達與EZH2呈負相關(guān)，EZH2陽性且Beclin-1陰性者的腫瘤復(fù)發(fā)率及病死率高于單純EZH2陽性表達及Beclin-1陰性表達者，提示Beclin-1低表達、EZH2高表達可能與腎癌預(yù)后有關(guān)，兩者間具體關(guān)系不明，有待更深入的研究。

綜上所述， Beclin-1及EZH2表達水平是腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)及生存的獨立危險因素，為腎癌靶向治療提供新的潛在治療靶點。腎癌組織中Beclin-1與EZH2表達呈負相關(guān)，轉(zhuǎn)錄抑制因子EZH2可能與腎癌中Beclin-1基因沉默有關(guān)，這為后續(xù)研究Beclin-1在腎癌中低表達的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：林燕薇)

Expression and significance of Beclin-1 and EZH2 in renal cell carcinoma

FanDawei,LiuKai,YuanChenggang,DuXiaoyuan.

LiaoningMedicalColleage,Jinzhou124010,ChinaCorrespondingauthor,DuXiaoyuan,E-mail：351844459@qq.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression levels and clinical significance of Beclin-1 and enhancer of zeste homolog 2 (EHZ2) in renal clear cell carcinoma (kidney cancer), aiming to evaluate the roles of Beclin-1 and EHZ2 in the prognosis of kidney cancer. MethodsWestern blot, real-time PCR and immunohistochemical staining were employed to detect the expression levels of Beclin-1 and EZH2 in renal tumors and paired adjacent normal tissues from 30 patients with renal clear cell carcinoma and paraffin-embedded specimens from 133 cases of kidney cancer, respectively. The correlation between EZH2 and Beclin-1 was analyzed. The roles of Beclin-1 and EZH2 in the prognosis of postoperative recurrence and survival were evaluated. The relationship between pathological grading, TNM staging, lymph node metastasis, age, gender and the expression of Beclin-1 and EZH2 was analyzed using Cox regression model, aiming to confirm the roles of Beclin-1 and EZH2 in the prognosis of kidney cancer. ResultsIn 30 cases of renal clear cell carcinoma and paired normal adjacent tissues, the expression of Beclin-1 at both mRNA and protein levels was significantly lower whereas the expression of EZH2 at both mRNA and protein levels was considerably higher compared with those in the adjacent normal renal tissues (all P<0.05). In 133 paraffin-embedded specimens, 60 were negative for Beclin-1 and 73 were positive for Beclin-1 expression, 67 were negative for EZH2 and 66 were positive for EZH2. The expression level of Beclin-1 was negatively correlated with EZH2 expression (rs=-0.574，P<0.01). Compared with patients who were positive for EZH2 or negative for Beclin-1, those with positive EZH2 and negative Beclin-1 had higher recurrence rate and shorter survival(P<0.05). Tumor grading and staging, lymph node status, EZH2 and Beclin-1 expression were influential factors of postoperative recurrence and survival in patients with renal clear cell carcinoma. ConclusionThe expression level of Beclin-1 is negatively correlated with EZH2 expression in renal cell carcinoma tissues. EZH2 probably participates in the silencing of Beclin-1 expression. Low expression of Beclin-1 and high expression of EZH2 might be associated with the prognosis of kidney cancer. EZH2 and Beclin-1 probably serve as potential targets of individualized therapy of renal cancer.

【Key words】Renal clear cell carcinoma; Autophagy-associated gene; EZH2；Prognosis

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.011

(收稿日期：2016-03-31)

·基礎(chǔ)研究論著·

通訊作者，杜曉媛，E-mail：351844459@qq.com