朱軍　吳本權(quán)　楊洋　朱家馨　張?zhí)焱?/p>

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)科ICU

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MRSA對巨噬細胞系RAW264.7自噬的影響

朱軍吳本權(quán)楊洋朱家馨張?zhí)焱?/p>

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)科ICU

【摘要】目的探討耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染對于巨噬細胞自噬的影響。方法以小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7為研究對象，以革蘭陽性菌MRSA感染3 h組作為實驗組，設(shè)立空白對照組(對照組)，另設(shè)MRSA感染0、30、60、120、150、180 min組。以MRSA感染細胞后，熒光定量PCR檢測自噬相關(guān)基因5(ATG5)、ATG7、ATG12的表達情況，蛋白免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1及微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的表達情況。結(jié)果感染MRSA 3 h后，實驗組RAW264.7細胞中ATG5、ATG7、ATG12的mRNA表達水平均高于對照組(P均<0.01)，LC3蛋白相對表達量也比對照組增加(P<0.01)，2組間Beclin1蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ATG7、ATG12 mRNA和LC3及Beclin1蛋白相對表達量均在感染MRSA 180 min組最高，ATG5 mRNA在感染MRSA 150 min組最高。結(jié)論MRSA可以誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生自噬，自噬基因激活存在先后順序，自噬可能為巨噬細胞吞噬胞外菌MRSA的另一種免疫滅活形式。

【關(guān)鍵詞】耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；巨噬細胞；自噬

自噬是與真核生物關(guān)系密切的基礎(chǔ)生理過程，通過細胞自我消化累積的蛋白質(zhì)細胞器等各類復(fù)雜的細胞質(zhì)成分，從而調(diào)節(jié)控制真核生物細胞內(nèi)成分的數(shù)量與質(zhì)量?，F(xiàn)今，已有自噬與各種疾病的關(guān)系研究[1]。隨著近年研究的逐步深入，巨噬細胞的自噬對于清除胞內(nèi)病原體有何重要作用逐漸受到關(guān)注[2-3]。自噬的作用機制在肺部疾病中，尤其在COPD、特發(fā)性肺纖維化、肺結(jié)核等疾病中已有較透徹的研究[4]。關(guān)于自噬與肺部感染性疾病，如胞外菌感染的研究仍較少。近年，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)已成為引起醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)相關(guān)性感染的重要致病菌之一，其治療形式較為嚴峻[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以清除某些胞內(nèi)菌，如李斯特菌、沙門菌和結(jié)核分枝桿菌[6]。對于胞外菌MRSA感染細胞，巨噬細胞除吞噬外能否產(chǎn)生自噬的相關(guān)研究仍較少。本研究以小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7為對象，觀察自噬在MRSA肺部感染中的作用，旨在探討MRSA感染巨噬細胞對其自噬功能的影響。

材料與方法

一、材料

1. 細胞系及菌株

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心；MRSA菌株為由我院呼吸科實驗室分離鑒定的臨床菌株。

2. 主要試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購于美國Life公司，Syber Green Mix實時定量PCR 檢測試劑盒購于美國Life公司。LC3多克隆兔抗體購于美國Sigma公司；Beclin1單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，內(nèi)參抗體β-actin兔一抗購于中國谷歌生物公司，辣根過氧化物酶(HRP) 標記的羊抗兔二抗購于廣州威佳科技有限公司，增強化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購于廣州聚研生物科技有限公司，細胞培養(yǎng)6孔板購于美國Corning公司。凱基全蛋白提取試劑盒及凱基BCA法蛋白濃度檢測試劑盒購于廣州杰特偉生物科技有限公司，蛋白質(zhì)印跡法配膠成分30%聚丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液、過硫酸銨(APS)購于廣州威佳科技有限公司，蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于25 ml的透氣蓋培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)細胞數(shù)目形態(tài)，當(dāng)細胞融合至60%～70%時將細胞傳代，平均約2～3 d傳代1次，保持實驗用細胞處于對數(shù)生長期，細胞狀態(tài)良好，在普通光學(xué)顯微鏡下折光度透亮，未見大量顆粒及細胞碎片。

2. 細菌培養(yǎng)

將凍存于-80℃的MRSA菌種在室溫下解凍后，接種于血瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃溫箱培養(yǎng)24 h，然后測定其在600 nm處吸光度(OD600) ，當(dāng) OD600=0.6，即約1×109/ml時，置于16%甘油在-80℃凍存。

3. MRSA感染細胞

將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞按1×106/ml的密度接種于6孔板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液2 ml，培養(yǎng)過夜，待每孔細胞數(shù)增至2×106時開始感染，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，按細菌∶細胞=10∶1將MRSA加入培養(yǎng)板中感染細胞。第一部分的實驗分為2組：空白處理作為對照組，MRSA感染作為實驗組。第二部分的實驗為MRSA刺激時間點檢測：將細胞均勻種于6孔板中，共分7組，第1組為對照組、第2組加入MRSA作用30 min、第3組加入MRSA作用60 min，組間相隔30 min，以此類推，第7組MRSA作用時間為180 min。每組實驗重復(fù)3次，取均值作為結(jié)果。

4. ATG mRNA表達水平的檢測

采用熒光定量PCR(qPCR)法：根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫的ATG基因序列，分別設(shè)計ATG5、ATG7、ATG12特異性引物，由美國Life公司合成，引物序列見表1。收集上述各組細胞，在6孔板每孔加入1 ml Trizol提取細胞總RNA并進行模板DNA第一鏈合成，然后加入10 μl Syber Green混合物，反應(yīng)體系總體積20 μl，采用ABI 7500系統(tǒng)進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：50℃ 2 min，95℃ 2 min預(yù)變性，95℃15 s變性，60℃1 min退火，共40個循環(huán)，95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s延伸。反應(yīng)后得到溶解曲線，記錄目的基因與內(nèi)參基因達到某一閾值的Ct值，將目的基因與內(nèi)參基因Ct值進行比較后再與對照組比較，計算ATG mRNA相對表達量：ATGmRNA=2-ΔΔCt。

5. 自噬相關(guān)蛋白Beclin1及微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)表達水平的檢測

MRSA感染細胞后，收集細胞加入現(xiàn)配的蛋白裂解液(每孔50 μl)，用細胞刮刮取蛋白，收集混合液于4℃以12 000 r/min離心15 min，收集上清液，于562 nm波長下用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，加入5倍體積蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，-80℃保存。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳法，下層12%分離膠，上層5%濃縮膠，蛋白上樣量20 μg，85 V恒壓電泳，待蛋白標記物分出條帶后，將電壓調(diào)為110 V，當(dāng)電泳至條帶接近底端時，停止電泳，260 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，根據(jù)預(yù)染蛋白標記物，剪下不同的目的蛋白于濕盒內(nèi)孵育，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次洗10 min，一抗稀釋比例LC3為1∶1 000、Beclin1為1∶2 000、β-actin為1∶2 000，4℃過夜后，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h(稀釋比例為1∶2 000) ，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 mim，ECL發(fā)光液A液、B液等體積混合后敷于蛋白膜上，于Chemi Scope化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，運用Image J軟件分析LC3(取LC-Ⅰ條帶)及Beclin1的蛋白灰度值，作為其蛋白相對表達量。

表1　引物序列

三、 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、感染MRSA 對RAW264.7細胞中ATG表達的影響

感染MRSA 3 h后，實驗組RAW264.7細胞的ATG5、ATG7、ATG12的mRNA表達水平均高于對照組(P均<0.01)，見表1。

表1　感染MRSA 3 h后RAW264.7細胞中

二、感染MRSA不同時間點RAW264.7細胞中的ATG表達情況

感染MRSA不同時間點組的RAW264.7細胞中，ATG5、ATG7、ATG12 mRNA表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F分別為36.551、41.073、19.662，P均<0.001)。其中ATG7、ATG12 mRNA相對表達量在感染MRSA 180 min組最高，ATG5 mRNA相對表達量在感染MRSA 150 min組最高。180 min組的ATG7 mRNA表達水平為4.07±0.54，高于90 min組的2.08±0.01(t=9.025，P<0.001)；180 min組的ATG12 mRNA表達水平為3.54±0.46，高于90 min組的1.66±0.19(t=9.253，P<0.001)；150 min組的ATG5 mRNA表達水平為2.49±0.14，高于90 min組的1.83±0.25(t=2.650，P=0.024)，見圖1。

圖1　感染MRSA不同時間點后

三、 感染MRSA對RAW264.7細胞中LC3及Beclin1蛋白表達的影響

感染MRSA 3 h后，RAW264.7細胞中LC3蛋白相對表達量在實驗組為48 523±12 692、對照組為7 450±1 550，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.692，P<0.001)； Beclin1蛋白相對表達量在實驗組為13 765±2 267、對照組為12 522±3 347，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.533，P=0.619)，見圖2。

四、感染MRSA不同時間點RAW264.7細胞中LC3及Belin1蛋白的表達情況

感染MRSA不同時間點組的RAW264.7細胞中，LC3及Belin1蛋白相對表達量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F分別為5.235、3.938，P均<0.05)。LC3、Beclin1蛋白相對表達量均在感染MRSA 180 min組最高。其中LC3蛋白相對表達量在180 min組為57 010±3 978，在60 min組為45 383±6 273，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.210，P=0.009)。Beclin1蛋白相對表達量在180 min組為86 440±5 024、60 min組為70 685±2 776，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.273，P<0.001)，見圖3。

圖2　感染MRSA后RAW264.7細胞中LC3及Beclin1的表達情況

A：蛋白免疫印跡法結(jié)果；B：定量分析結(jié)果

圖3　感染MRSA不同時間點RAW264.7細胞中LC3及Belin1蛋白的表達情況

A：蛋白免疫印跡法結(jié)果；B：定量分析結(jié)果

討論

巨噬細胞是固有免疫系統(tǒng)重要組成部分，在外來病原體入侵機體時，可以通過吞噬等非特異性免疫作用來殺傷病原體，并且可以通過抗原提呈誘導(dǎo)特異性免疫進一步殺死病原體。肺部感染性疾病中，巨噬細胞對于肺部的宿主防御功能必不可少，其能夠監(jiān)視暴露的氣道，調(diào)節(jié)固有和適應(yīng)性免疫[7]。

自噬是真核生物細胞內(nèi)回收利用細胞質(zhì)成分的一種降解機制。自噬過程包括將長壽命蛋白及胞內(nèi)較大體積的細胞器成分隔離進入雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，然后再運送至溶酶體進行降解，降解后的成分重新用來供應(yīng)細胞能量及合成大分子的需要。因此，自噬被視為胞內(nèi)回收機制[8]。最早對于自噬分子機制的研究從酵母菌開始，隨后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)自噬基因出現(xiàn)于高等真核生物，表明自噬是一種進化高度保守的過程。在酵母菌中，自噬主要涉及適應(yīng)饑餓，在多細胞生物體內(nèi)，該途徑涉及多條通路，例如程序性細胞死亡、胞內(nèi)破損細胞器及沉積蛋白質(zhì)的清除等[9]。從整體上而言，自噬與多種病理生理過程相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)退行性病變、感染等[10]。隨著研究的逐步深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)自噬與疾病的治療相關(guān)，已有研究證明自噬與腫瘤治療相關(guān)，可以提高腫瘤細胞對化學(xué)治療藥物的敏感性[11]。與哺乳動物自噬相關(guān)的基因統(tǒng)一命名為ATG。在哺乳動物細胞自噬泡形成過程中，由ATG3、ATG5、ATG7、ATG10、ATG12和LC3參與組成的2條泛素樣蛋白加工修飾通路，在自噬過程起著至關(guān)重要的作用。LC3是酵母ATG8的類似物，當(dāng)LC3前體形成后，首先加工成胞漿可溶性形式LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸殘基，然后LC3-I被ATG7活化,轉(zhuǎn)移并被修飾成膜結(jié)合形式LC3-Ⅱ[12-13]。本實驗中LC3-Ⅰ較LC3-Ⅱ表達明顯增多，考慮是否由于自噬屬于動態(tài)過程，LC3-Ⅱ已逐漸被溶酶體降解，故取LC3-Ⅰ條帶作定量分析。

近幾年，關(guān)于自噬與感染性疾病的研究逐漸增多[14]。金黃色葡萄球菌是可以引起人體從表皮感染至嚴重血源性感染等侵襲性感染的胞外菌，其感染率和患者病死率極高[15]。其中MRSA感染更為當(dāng)前臨床治療的難題。雖然經(jīng)典的研究證實，金黃色葡萄球菌是胞外菌，但其可逃避吞噬細胞的殺傷作用而存活于多種吞噬細胞中。更為嚴重的是，有研究顯示其可存活于單核細胞、巨噬細胞、甚至中性粒細胞中[16]。β-內(nèi)酰胺類和糖肽類抗菌藥均難以進入上述免疫細胞，故治療失敗率高。因此，研究自噬對于胞內(nèi)生存的MRSA有何作用及其與吞噬的關(guān)系，對闡明胞外病原體滅活及其免疫逃避機制均有重要意義。

已有研究表明，在肺泡上皮細胞A549受到結(jié)核分枝桿菌、A型鏈球菌和銅綠假單胞菌感染時，自噬可以清除病原體，對機體起到清除病原體的保護作用[17]。另外，自噬對于結(jié)核分枝桿菌亦具有殺傷作用[18]。目前，對金黃色葡萄球菌入侵單核細胞系MEF及Hela 細胞系產(chǎn)生自噬已有相關(guān)研究[19]。本研究主要觀察MRSA感染巨噬細胞對自噬的影響，結(jié)果顯示巨噬細胞在感染MRSA后，ATG5、ATG7、ATG12 mRNA及LC3蛋白相對表達升高，從基因水平及蛋白質(zhì)水平證明感染MRSA可以激活巨噬細胞自噬，參與自噬過程的相關(guān)基因表達水平達峰時間不完全一致，表明自噬是一動態(tài)過程，基因激活存在先后順序。但對于該類自噬的具體信號通路機制仍然未明，其是否與革蘭陰性菌內(nèi)毒素成分脂多糖誘導(dǎo)自噬過程類似，還是通過MRSA表面細胞壁某種成分誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬，對此仍需要進一步研究[20]。另外， MRSA是否能夠逃避自噬，自噬能否起到免疫作用，對肺炎預(yù)后有何影響，還需進一步實驗研究[21]。

參考文獻

[1]Deretic V, Levine B.Autophagy, immunity, and microbial adaptations.Cell Host Microbe,2009,5(6):527-549.

[2]Chow A, Brown BD, Merad M.Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.Nat Rev Immunol,2011,11(11):788-798.

[3]Araya J, Hara H, Kuwano K.Autophagy in the pathogenesis of pulmonary disease.Intern Med,2013,52(20):2295-2303.

[4]Weiss G, Schaible UE.Macrophage defense mechanisms against intracellular bacteria.Immunol Rev,2015,264(1):182-203.

[5]Otto M. MRSA virulence and spread.Cell Microbiol,2012,14(10):1513-1521.

[6]Huang J, Brumell JH. Autophagy in immunity against intracellular bacteria.Curr Top Microbiol Immunol,2009,335:189-215.

[7]Vlahos R, Bozinovski S.Role of alveolar macrophages in chronic obstructive pulmonary disease.Front Immunol,2014,5:435.

[8]Glick D, Barth S, Macleod KF.Autophagy: cellular and molecular mechanisms.J Pathol,2010,221(1):3-12.

[9]He C, Klionsky DJ.Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.Annu Rev Genet,2009,43:67-93.

[10]Bialik S, Kimchi A.Autophagy and tumor suppression: recent advances in understanding the link between autophagic cell deathpathways and tumor development.Adv Exp Med Biol,2008,615:177-200.

[11]劉穗玲，李小毛. 自噬與紫杉醇敏感性. 新醫(yī)學(xué)，2014，45(4):218-222.

[12]Tal MC, Iwasaki A.Autophagy and innate recognition systems.Curr Top Microbiol Immunol,2009,335:107-121.

[13]Ryter SW, Cloonan SM, Choi AM.Autophagy: a critical regulator of cellular metabolism and homeostasis.Mol Cells,2013,36(1):7-16.

[14]Smeekens SP, Malireddi RK, Plantinga TS, Buffen K, Oosting M, Joosten LA, Kullberg BJ, Perfect JR, Scott WK, van de Veerdonk FL, Xavier RJ, van de Vosse E, Kanneganti TD, Johnson MD, Netea MG.Autophagy is redundant for the host defense against systemic Candida albicans infections.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2014,33(5):711-722.

[15]O’Keeffe KM, Wilk MM, Leech JM, Murphy AG, Laabei M, Monk IR, Massey RC, Lindsay JA, Foster TJ, Geoghegan JA, McLoughlin RM.Manipulation of autophagy in phagocytes facilitates Staphylococcus aureus bloodstream infection.Infect Immun,2015,83(9):3445-3457.

[16]Garzoni C, Kelley WL.Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.Trends Microbiol,2009,17(2):59-65.

[17]Li P, Shi J, He Q, Hu Q, Wang YY, Zhang LJ, Chan WT, Chen WX.Streptococcus pneumoniae induces autophagy through the inhibition of the PI3K-I/Akt/mTOR pathway and ROS hypergeneration in A549 cells.PLoS One,2015,10(3):e0122753.

[18]Ní Cheallaigh C, Keane J, Lavelle EC, Hope JC, Harris J.Autophagy in the immune response to tuberculosis: clinical perspectives.Clin Exp Immunol,2011,164(3):291-300.

[19]Schnaith A, Kashkar H, Leggio SA, Addicks K, Kr?nke M, Krut O.Staphylococcus aureus subvert autophagy for induction of caspase-independent host cell death.J Biol Chem,2007,282(4):2695-2706.

[20]Xu Y, Jagannath C, Liu XD, Sharafkhaneh A, Kolodziejska KE, Eissa NT.Toll-like receptor 4 is a sensor for autophagy associated with innate immunity.Immunity,2007,27(1):135-144.

[21]Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ.Autophagy fights disease through cellular self-digestion.Nature,2008,451(7182):1069-1075.

Effect of MRSA on the autophagy of RAW264.7 macrophage cell line

ZhuJun,WuBenquan,YangYang,ZhuJiaqxin,ZhangTiantuo.

DepartmentofRespiratory，ICU，theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,ChinaCorrespondingauthor,WuBenquan,E-mail:zswbq@163.com

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) infection upon the autophagy of macrophages. MethodsMouse monocyte-macrophage cell line RAW264.7 was used. In the experimental groups, RAW264.7 cells were infected with Gram-positive MRSA for different time points including 0, 30, 60, 90, 120, 150 and 180 min. In the control group, the cells were left untreated. After MRSA infection, the expression of ATG5, ATG7 and ATG12 was measured by fluorescence quantitative PCR, and the expression levels of autophagy-related protein (Beclin1) and microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) were measured by Western blot. ResultsAt 3 h after MRSA infection, the expression levels of ATG5, ATG7 and ATG12 mRNA in the experimental group were significantly higher compared with those in the control group (all P<0.01). The relative expression of LC3 in the experimental group was considerably higher than that in the control group (P<0.01), where the relative expression of Beclin1 did not significantly differ between two groups (P>0.05). The relative expression levels of ATG7, ATG12 mRNA, LC3 and Beclin1 proteins peaked at 180 min following MRSA infection, and the level of ATG5 mRNA achieved the peak at 150 min after MRSA infection. ConclusionsMRSA could induce autophagy in macrophages. The autophagy genes were activated in a certain sequence. Autophagy probably acted as an alternative immune process of phagocytosis of MRSA by macrophages.

【Key words】Methicillin-resistant staphylococcus aureus; Macrophage; Autophagy

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.008

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(81170004)

(收稿日期：2015-11-22)(本文編輯：林燕薇)

·基礎(chǔ)研究論著·

通訊作者，吳本權(quán)，E-mail:zswbq@163.com