王樹蕓 韓秀蘭 霍學慧 畢建杰 王啟柏 李圣福 郭風法

【摘要】石蠟切片技術(shù)是一門非常實用的實驗技術(shù)，但由于其制作步驟繁瑣、耗時長，很難應用到本科教學中。經(jīng)本實驗改良的石蠟切片釕紅染色法具有簡單、易操作、染色效果好，學生容易掌握的特點，所需課時量僅13課時。將石蠟切片技術(shù)與高校實驗課程相結(jié)合，利于該技術(shù)在本科教學中廣泛推廣。

【關(guān)鍵詞】石蠟切片 釕紅染色法 本科教學

【基金項目】1.山東農(nóng)業(yè)大學教研項目“數(shù)字化植物教學標本園建設(shè)”；2.山東農(nóng)業(yè)大學教研項目“農(nóng)科類數(shù)字化實驗教學中心建設(shè)”。

【中圖分類號】G64 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2016）05-0172-02

石蠟切片是進行組織學、生物學研究的常用實驗方法。石蠟切片包括標本采集固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、展片、烤片、烘片、脫蠟、染色、封片等一系列步驟制成透明的薄片，通過光學顯微鏡觀察，可以觀察植物組織的細胞結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。但因其制作步驟繁瑣，耗時長，一般不列為本科教學的實驗內(nèi)容。而石蠟切片技術(shù)應用范圍廣、實用性強，所以本實驗通過改良、簡化其步驟，使這門技術(shù)可以更好的應用到本科實驗教學中。

目前，各大高等院校對大學生動手實踐能力的培養(yǎng)，已成為教育改革的重要內(nèi)容。實驗教學是培養(yǎng)學生實踐能力的重要手段，是理論課替代不了的。所以，將石蠟切片技術(shù)應用到本科實驗教學中，對教育改革可以起到推動作用。

一、材料與方法

1.實驗材料

山東農(nóng)業(yè)大學南校區(qū)校園中的櫻花樹葉或者楊樹葉。

2.實驗試劑和器材

無水乙醇、二甲苯、冰醋酸均為天津凱通生產(chǎn)

石蠟為SIGMA中國有限公司生產(chǎn)的蠟片，熔點52℃-56℃

中性樹膠為上海生工生產(chǎn)

卡諾固定液：無水乙醇：冰醋酸=3：1，于青霉素小瓶貯存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

明膠（粘片劑）：1g明膠溶于100ml蒸餾水放在36℃烘箱，全部溶解后，再加15ml甘油，2g石炭酸，完全溶解后，分成小瓶，儲存在細口瓶中備用。

釕紅染色液：0.04g釕紅固體染料溶解于200ml蒸餾水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

15ml注射器，用于快速抽氣。

以上所述溶劑都由實驗老師提前配制準備好。

3.實驗儀器

半自動石蠟切片機為浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號是YZB。

電熱恒溫鼓風干燥箱為上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號是DHG-91435-11。

4.實驗步驟

步驟1.取材固定

將新鮮材料剪成0.5cm見方的小塊，立即放入固定液中殺死固定，存于4℃冰箱固定12-24小時。此步驟于上一次實驗課快要結(jié)束時進行，耗時10min左右。

技術(shù)要點：

固定的目的是利用化學藥品將活細胞迅速殺死，使植物材料以保持固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。所以，取材一定要新鮮、完整、快速，防止葉片失水過多，造成組織萎蔫變形，不利于觀察。

卡諾固定液中的冰醋酸滲透力強而快，能溶解脂肪，可保存蛋白質(zhì)不變質(zhì)，是染色體很好的保存劑，組織發(fā)脹，可阻止酒精、甲醛等引起的收縮，采用注射器抽氣可排除材料內(nèi)氣泡的干擾，加速固定液的滲透，更好的保存材料細胞的原有狀態(tài)。

注意事項：

（1）應力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。

（2）組織塊不易過大過厚，必須小于2cm×1cm×0.5cm，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。

（3）固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。

（4）注射器抽氣時應注意，不可抽取過度，保持抽取狀態(tài)30s，反復3次即可。

步驟2.清洗脫水

上午課時，上課教師指導學生將前一天實驗課固定的材料70%酒精漂洗至無醋酸氣味，再移到70%酒精，靜置20min（期間經(jīng)?；蝿樱Ｈ缓笠来螕Q80%酒精20min→95%酒精（加署紅）20min→無水乙醇60min→無水乙醇60min→無水乙醇60min。此步驟需要耗時4課時，上課教師在實驗間歇把本次試驗的內(nèi)容、步驟、注意事項和意義向?qū)W生講解清楚。

技術(shù)要點：

脫水這一步至關(guān)重要，為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行。而徹底脫水也是透明和浸蠟順利進行的保證。

步驟3.透明浸蠟

下午課時，上課教師指導學生將材料依次更換：無水乙醇：二甲苯=3：1溶液 30min→無水乙醇：二甲苯=1：1溶液 30min→無水乙醇：二甲苯=3：1溶液 30min→100%二甲苯 20min→100%二甲苯 20min。然后加入與二甲苯等體積的的蠟片，置于42℃烘箱。本次實驗耗時3課時，上課教師下課前要求學生晚9：00換蠟一次，換蠟后置于60℃烘箱，此后兩天內(nèi)上午和晚上各換蠟一次。

步驟4.包埋切片

上課時，上課教師先指導學生疊包埋用的紙船，然后進行包埋。包埋好的蠟塊放事先預冷的冰水中，置于冰箱1h，然后進行授課，將本節(jié)課的實驗內(nèi)容跟大家講解清楚，1h后取出進行修塊、切片、貼片、展片、烤片后置于木質(zhì)切片架于烘箱中烘片，本次實驗共計耗時約3課時。

技術(shù)要點：

本實驗采用石蠟取代透明劑二甲苯，使石蠟浸入組織并起支持作用。以石蠟為媒介，使植物組織達到一定的硬度，可以通過切片機切成8um厚的蠟帶，將植物組織的結(jié)構(gòu)清晰的呈現(xiàn)出來。

注意事項：

（1）包埋時順時針輕輕搖晃盛有組織材料和石蠟的小瓶，將材料晃起，倒入紙船中，并將材料一字擺開，中間間隔適當?shù)木嚯x，然后將紙船底部慢慢浸入事先準備好的冷水中，不要完全浸沒，雙手捏緊紙船兩端，直至表層石蠟凝固。動作要迅速，防止石蠟受冷凝固。

（2）包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的梯形，以利于下一步切片時形成蠟帶。

（3）粘片劑明膠不能過量，過量反而不粘

（4）展片時蠟片的光面向下，不要滴加太多水，蠟帶能夠完全展開即可。

步驟4.染色封片

將烘好的片子通過染色盒進行二甲苯脫蠟，無水乙醇2min→無水乙醇 2s→70%酒精1min→30%酒精1min→蒸餾水1min逐級復水，釕紅染色1min，再脫水透明，中性樹膠封片。

上課教師指導學生在普通光學顯微鏡下觀察制得的石蠟切片，觀察植物葉片的植物葉片的組織結(jié)構(gòu)，以及柵欄組織和海綿組織的區(qū)別，并繪制成圖，作為本次試驗的實驗報告。本次課共計耗時3課時。

技術(shù)要點：

烘片后的切片需脫蠟及復水才能在水溶性染液中進行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中，則將切片移至與酒精近似濃度時，即可染色。如果不經(jīng)過復水，材料脫蠟后直接進入染色劑中，材料將會嚴重變形，甚至難以染色。

染色的目的是使細胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色和足夠強的差異以便于觀察。經(jīng)染色可顯示細胞內(nèi)不同的細胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細胞組織。本實驗采用的釕紅主要染細胞間層，配置簡單，染色穩(wěn)定，且染色時間短，顏色鮮明，不容易染色過度，染出來的切片植物組織結(jié)構(gòu)清晰，便于普通顯微鏡觀察。

注意事項：

（1）脫蠟及以后過程中，必須保證載玻片載有材料的一面，在玻片架上朝向一致。

（2）將載玻片從二甲苯中取出，務必使有材料的一面朝上。

（3）二甲苯極易揮發(fā)，載玻片從二甲苯中取出后要迅速滴膠，以免材料暴露于空氣中，吸收的水分而導致實驗失敗。

（4）注意中性樹膠的濃度，太稠時，用適量二甲苯稀釋。

（5）膠的數(shù)量以剛好不溢出蓋玻片為宜（200ul移液器滴加1滴）。

二、結(jié)論與分析

本實驗共計耗時13課時，比較系統(tǒng)、連貫，而且步驟已簡化，簡單易操作，學生在短時間內(nèi)就能夠熟練掌握和操作。此方法將以前只能從書本上看到的植物顯微結(jié)構(gòu)，通過自己的雙手親自做出來，會使學生印象更加深刻。所以將石蠟切片技術(shù)應用在學校的本科教學中，具有深遠意義。

實驗教學在大學教學過程中占據(jù)重要位置，是理論教學外培養(yǎng)學生實踐能力、創(chuàng)造能力的重要手段，也是輔助理論教學重要的一部分，實驗教學使得課堂上講的內(nèi)容及方法能付于實踐，加深和鞏固課堂教學的內(nèi)容。

目前，各大學校本科實驗教學課程，普遍選用一些耗時短，簡單的常規(guī)實驗，但一般實用性不強。而石蠟切片技術(shù)在學生繼續(xù)深造及今后的科研工作中大有裨益，所以在本科實驗教學中廣泛推廣石蠟切片這門應用范圍廣、實用性強的常規(guī)技術(shù)在學校的本科教學中推廣勢在必行。

參考文獻：

[1]侯春春，徐水.淺析影響石蠟切片質(zhì)量的關(guān)鍵因素[J].中國農(nóng)學通報，2009，25（23）：94-98.

[2]楊捷頻.常規(guī)石蠟切片方法的改良[J].生物學雜志，2006，23（1）：45-46.