孫德彬，藍(lán)秀

（麗水市中心醫(yī)院　呼吸內(nèi)科，浙江　麗水　323000）

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miR-187在肺癌組織中的表達(dá)及其效應(yīng)

孫德彬，藍(lán)秀

（麗水市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江麗水323000）

［摘 要］目的：探討微小RNA（microRNA，miR）-187在肺癌組織中的表達(dá)及其效應(yīng)。方法：以U6為內(nèi)參，采用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測(cè)32例肺癌及其癌旁正常組織標(biāo)本miR-187的表達(dá)量，并分析其表達(dá)與肺癌臨床病理特征間的關(guān)系。采用miR-187模擬物（mimics）上調(diào)A549肺癌細(xì)胞內(nèi)miR-187表達(dá)水平，通過(guò)噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活性，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果：與癌旁正常組織比較，miR-187在肺癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)（t=5.236，P＜0.001）。臨床病理特征相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腫瘤組織miR-187的表達(dá)與肺癌病理分級(jí)及臨床分期相關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、吸煙史、腫塊大小、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況未見(jiàn)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。采用miR-187 mimics上調(diào)A549肺癌細(xì)胞內(nèi)miR-187表達(dá)后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，G0/G1期細(xì)胞比例增高，G2/M期細(xì)胞比例明顯降低。結(jié)論：miR-187在肺癌組織中的下調(diào)表達(dá)可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

［關(guān)鍵詞］微小RNA；miR-187；肺腫瘤

肺癌的發(fā)病率與病死率在全世界范圍內(nèi)增速迅猛［1］，我國(guó)目前肺癌病死率為30.61/10萬(wàn)人，較30年前增加了465%，位居各種惡性腫瘤之首［2］。在后基因組時(shí)代，RNA組學(xué)研究逐漸成為熱點(diǎn)：基因組超過(guò)98%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為不編碼蛋白的非編碼RNA （non-coding RNA，ncRNA），其中微小RNA（microRNA，miR）可通過(guò)與靶mRNA的3’-UTR互補(bǔ)配對(duì)，指導(dǎo)mRNA切割、降解；也可通過(guò)與靶mRNA的不完全配對(duì)，沉默其表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、增殖和凋亡等［3-6］。近年來(lái)少數(shù)的研究已經(jīng)證實(shí)，miR-187異常表達(dá)與前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等相關(guān)，但其與肺癌的相關(guān)性迄今尚鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究進(jìn)一步通過(guò)莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）方法對(duì)32例肺癌組織及相對(duì)應(yīng)的正常組織進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè)，旨在分析miR-187表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，并通過(guò)細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-187的效應(yīng)。

1　材料和方法

1.1材料 Trizol試劑、胎牛血清、lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)液、0.05% Trypsin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；F12K培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DNase I、RNase-free試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；ReverTra Ace? qPCR RT Kit、SYBR? Green Realtime PCR Master Mix等購(gòu)自日本Toyobo公司；miR-187模擬物（mimics）及無(wú)關(guān)序列對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪公司；A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞購(gòu)自中科院上?？茖W(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1組織標(biāo)本采集及處理：標(biāo)本取自2008年6 月-2012年7月間在我院胸外科行手術(shù)治療的肺癌患者32例，術(shù)前均未行放、化療等治療，年齡32～78歲，平均（45.5±12.3）歲，組織病理類型的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO肺癌的病理學(xué)分類。每例標(biāo)本留取腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的正常肺組織（腫瘤遠(yuǎn)端5 cm處的肺組織，并經(jīng)組織病理切片檢測(cè)證實(shí)），離體后10 min內(nèi)置于液氮保存待做后續(xù)分析。

1.2.2小RNA抽提：取液氮保存的肺癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，在液氮中碾碎至粉狀，按Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA，DEPC處理水溶解。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA溶液按DNase I說(shuō)明書步驟進(jìn)一步純化。采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）檢測(cè)RNA溶液OD260/OD280吸光值，計(jì)算RNA濃度和純度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于檢測(cè)。1.0%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.3miR-187表達(dá)檢測(cè)：以U6作為內(nèi)參，分析肺癌組織miR-187表達(dá)，相關(guān)分析的引物序列見(jiàn)表1。0.5 μg總RNA分別以U6 RT引物和miR-187莖環(huán)RT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系按照ReverTra Ace? qPCR RT Kit說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR。測(cè)反應(yīng)體系包括：1 μL RT產(chǎn)物，1×SYBR Green I Master mix，10 μmol/L特異前向引物、10 μmol/L特異反向引物。RT-qPCR條件為：95 ℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。所有樣品做3復(fù)孔。RT-qPCR使用ABI StepOne/StepOnePlus RT-qPCR儀器進(jìn)行檢測(cè)。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以U6作為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt表示miR-187在肺癌組織相對(duì)于癌旁組織的表達(dá)。ΔCt為同一樣本目的基因與內(nèi)參基因Ct值之差，即ΔCt=CtmiR-187-CtU6，△△Ct=（CtmiR-187-CtU6）腫瘤-（CtmiR-187-CtU6）正常。miR-187相對(duì)表達(dá)水平＜1，表示肺癌組織miR-187的表達(dá)水平低于配對(duì)癌旁組織miR-187的表達(dá)；miR-187相對(duì)表達(dá)水平＞1，表示肺癌組織miR-187的表達(dá)水平高于配對(duì)癌旁組織miR-187的表達(dá)。PCR產(chǎn)物經(jīng)3.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1　定量PCR檢測(cè)相關(guān)引物序列

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)及miR-187轉(zhuǎn)染：A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素的F12K培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，23 d傳代一次。設(shè)20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L 3個(gè)不同濃度的miR-187 mimics干預(yù)組、無(wú)關(guān)序列組（NC組）及未轉(zhuǎn)染組（Blank組）。轉(zhuǎn)染前將2×105個(gè)細(xì)胞分別接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁率大約為60%～70%，將培養(yǎng)基替換為無(wú)血清Opti-mem培養(yǎng)基，按li-pofetmaine2000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h、48 h及72 h后去培養(yǎng)基，Hanks洗滌3次，加Trizol試劑收集細(xì)胞RNA，于80℃冰箱保存。

1.2.5細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)：本次實(shí)驗(yàn)設(shè)A549細(xì)胞Blank組、NC組和miR-187 mimics組（miR-187 mimics轉(zhuǎn)染濃度分別為20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L）。另設(shè)背景組（未接種細(xì)胞，只加入培養(yǎng)基）作為調(diào)零孔。實(shí)驗(yàn)共分6個(gè)組，每組3個(gè)復(fù)孔。參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書，分別檢測(cè)上述各組細(xì)胞增殖情況。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度值（OD）。并計(jì)算細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)組-空白孔）A450/（對(duì)照組-空白孔）A450×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：以2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 mL，轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h，使得細(xì)胞周期同步在G0/G1期。取miR-187 mimics干預(yù)組及無(wú)NC組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)液吹打，800×g離心15 min去上清，PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹勻，用5 mL注射器將細(xì)胞吸起，打入5 mL 70%（預(yù)冷）乙醇中，4 ℃固定過(guò)夜，800×g離心15 min收集固定細(xì)胞，PBS 洗2次，用0.4 mL PBS重懸細(xì)胞并輕輕吹打，加適當(dāng)濃度的RNase-A，37 ℃水浴消化30 min，加入適當(dāng)濃度的PI，在冰浴中避光染色30 min，過(guò)濾，流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）分析檢測(cè)，每個(gè)樣本取3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)復(fù)孔檢測(cè)1次，獲得數(shù)據(jù)后進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。miR-187表達(dá)數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，肺癌組織與其配對(duì)癌旁組織miR-187平均表達(dá)水平比較采用配對(duì)的非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)；肺癌組織miR-187相對(duì)表達(dá)水平與胃癌臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系采Mann-Whitney u檢驗(yàn)（2組）和Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)（多組）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-187檢測(cè)特異性分析 qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線（見(jiàn)圖1A）顯示為單峰，肺癌組織和癌旁正常組織總RNA經(jīng)特異引物RT-qPCR擴(kuò)增后， miR-187 及U6內(nèi)參的PCR產(chǎn)物為單一條帶（見(jiàn)圖1B），說(shuō)明建立的RT-qPCR方法能特異檢測(cè)相應(yīng)的目的基因。

圖1　miR-187和內(nèi)參U6 qPCR特異性分析

圖2　肺癌組織及其配對(duì)癌旁正常肺組織miR-187平均表達(dá)水平

2.2肺癌組織miR-187表達(dá)水平 31例肺癌組織及其配對(duì)癌旁正常肺組織miR-187表達(dá)水平的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖2）表明，肺癌組織miR-187表達(dá)水平明顯低于配對(duì)癌旁正常肺組織（t=5.236，P＜0.001），肺癌組織miR-187相對(duì)表達(dá)水平為0.626 （0.283，0.827）。

2.3miR-187表達(dá)水平與肺癌臨床病理特征的關(guān)系 miR-187的表達(dá)在不同病理分級(jí)及臨床分期存在顯著差異（見(jiàn)表2）。不同病理分級(jí)的肺癌標(biāo)本中，分化程度越低的肺癌組織miR-187表達(dá)水平越低（P=0.017），miR-187表達(dá)水平在III/IV期臨床分期的肺癌組織標(biāo)本明顯低于I/II期的組織標(biāo)本（P= 0.026）。miR-187表達(dá)水平和年齡、性別、吸煙史、腫塊大小、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況未見(jiàn)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2　miR-187表達(dá)水平與腫癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4上調(diào)miR-187表達(dá)對(duì)A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響 結(jié)果（見(jiàn)圖3）顯示，與Blank組和NC組比較，20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L miR-187 mimics轉(zhuǎn)染各實(shí)驗(yàn)組的A549細(xì)胞增殖均明顯受到抑制，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。miR-187 mimics轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h等不同的時(shí)間點(diǎn)之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖4）顯示，與Blank組和NC組比較，miR-187 mimics各濃度組轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞周期分布在24 h、48 h和72 h均發(fā)生改變，G0/G1期細(xì)胞比例增高，G2/M期細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），但未見(jiàn)明顯的時(shí)間效應(yīng)和濃度效應(yīng)。

圖3　miR-187 mimics干預(yù)對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

3　討論

miRNA是近年來(lái)在多種真核細(xì)胞和病毒中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼蛋白的短序列（21～23個(gè)核苷酸）RNA片斷。它通常與靶基因的3’UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，指導(dǎo)miRNA復(fù)合體對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行切割或者翻譯抑制，抑制基因表達(dá)［7-9］。自從Calin等［8］首次報(bào)道m(xù)iRNA異常表達(dá)與腫瘤有關(guān)，近十幾年來(lái)，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，miR-187可作為抑癌基因或致癌基因，與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)。鼻咽癌［9］、腎癌［10］、胰腺癌［11］、甲狀腺癌［12］、食管癌［13］以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤［14］等多種腫瘤，已證實(shí)存在miR-187異常表達(dá)。我們前期肺癌組織miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-187在肺癌組織表達(dá)明顯下調(diào)表達(dá)。為驗(yàn)證miR-187表達(dá)水平與肺癌的相關(guān)性，本研究以U6為內(nèi)參照，采用RT-qPCR檢測(cè)了32例肺癌組織miR-187的表達(dá)。結(jié)果顯示，與癌旁正常肺組織比較，肺癌組織miR-187的表達(dá)明顯下調(diào)。臨床病理特征相關(guān)性分析顯示，miR-187的表達(dá)水平與肺癌病理分級(jí)及臨床分期相關(guān)。進(jìn)一步細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用miR-187 mimics轉(zhuǎn)染上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-187表達(dá)后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，G0/G1期細(xì)胞比例增高，G2/M期細(xì)胞比例明顯降低。這些結(jié)果提示腫瘤組織低表達(dá)的miR-187可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。最近有研究［15］顯示，miR-187通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因DAB2，參與了卵巢癌的進(jìn)展，也與患者的總體生存率及術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)。Mulrane等［16］發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織miR-187表達(dá)水平的高、低與乳腺癌的侵襲能力相關(guān)，可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。但是不同研究者報(bào)道亦不盡相同，Cheng等［17］報(bào)道，反義抑制miR-187的表達(dá)，HeLa細(xì)胞的增殖能力下降。而Park等［18］的研究認(rèn)為miR-187的過(guò)量表達(dá)，HeLa細(xì)胞的增殖能力減退，細(xì)胞凋亡增加。這些結(jié)果提示，miR-187在不同腫瘤組織可能以不同方式參與腫瘤致癌過(guò)程。

圖4　miR-187 mimics干預(yù)48 h對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

miRNA主要通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)發(fā)揮效應(yīng)。Dab2［15］、MMP13［16］已被證實(shí)是miR-187的靶基因。Sirotkin等［19］研究發(fā)現(xiàn)miR-187的過(guò)度表達(dá)可以減少人類卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)BAX和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。最近Helwak等［20］基于miRNA-mRNA直接相互作用的CLASH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TUBG1、MAD2L2及STOML2是miR-187的靶基因。已經(jīng)證實(shí)，MAD2L2是一個(gè)參與有絲分裂檢查點(diǎn)過(guò)程控制的成員的基因，與癌旁正常組織比較，結(jié)腸癌組織表達(dá)明顯上調(diào)，而且MAD2L2上調(diào)表達(dá)的結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后［21］。STOML2是Stomatin超家族成員之一，也已經(jīng)證實(shí)在多種腫瘤組織上調(diào)表達(dá)［22-25］。由于miR-187在不同類型腫瘤中的作用不同，肺癌腫瘤組下調(diào)表達(dá)的miR-187是否通過(guò)上述的靶基因發(fā)揮效應(yīng)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（本文編輯：胡苗苗）

Expression of miR-187 in the tissues of lung cancer and its effect

SUN Debin， LAN Xiu. Department of Respiratory Medicine， Lishui Central Hospital， Lishui， 323000

Abstract：Objective： To explore the expression of miR-187 in the tissues of lung cancer and its effect. Methods： By normalized to U6， the expressions of miR-187 in 32 lung cancer and matched non-tumor adjacent tissue specimens were examined by stem-loop real-time RT-qPCR method. The relationship between miR-187 expression and clinicopathological characteristics was further analyzed. After transfected with miR-187 mimics， the biological functions of miR-187 were determined by cell proliferation and cell cycle assay. Results：Expression of miR-187 in the tissue of lung cancer was obviously higher than that in non-tumor adjacent tissue specimens （t=5.236， P＜0.0001）. Clinical features correlation analysis showed that the down-expression of miR-187 was correlated with the pathological grading and the clinical staging （P＜0.05）. Functional studies indicated that the overexpression of miR-187 dramatically inhibited the proliferation of A549 cells in vitro and changed the situation of the cell cycle， arrested at G0/G1 phase. Conclusion： Down-expression of miR-187 in the patients of lung cancer may play a key role in the development and progression of lung cancer.

Key words：microRNA； miR-187； lung neoplasms

［中圖分類號(hào)］R734.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.010

收稿日期：2015-08-19

作者簡(jiǎn)介：孫德彬（1975-），男，浙江青田人，副主任醫(yī)師。