張亞亞，覃瓊玉，林沖，孫書強(qiáng)，朱華，楊新軍，閆洪濤

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江　溫州　325035，1.環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

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亞慢性苯吸入暴露抑制小鼠單倍體精子核蛋白基因的表達(dá)

張亞亞1，覃瓊玉1，林沖1，孫書強(qiáng)1，朱華2，楊新軍1，閆洪濤1

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江溫州325035，1.環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

［摘 要］目的：探討苯對(duì)小鼠精子生成損傷的主要階段。方法：6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、1 ppm和100 ppm苯暴露組，模擬職業(yè)暴露情況，實(shí)施每天8 h，每周5 d，共13周的亞慢性動(dòng)式吸入染毒。HE染色觀察睪丸組織病理學(xué)改變。選取精子發(fā)生中階段特異性表達(dá)基因作為不同階段精子的marker，選定的marker基因有代表未分化型精原細(xì)胞的Plzf，分化型精原細(xì)胞的Stra8，初級(jí)精母細(xì)胞的Sycp3，圓形精子的過渡蛋白Tnp1、Tnp2，長(zhǎng)形精子的Akap4，以及魚精蛋白Prm1、Prm2，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)marker基因mRNA表達(dá)。結(jié)果：苯暴露組小鼠睪丸組織呈現(xiàn)嗜酸性染色增強(qiáng)，1 ppm組出現(xiàn)少量核溶解、細(xì)胞脫落等改變；100 ppm組小鼠睪丸生殖細(xì)胞變性、壞死明顯增多，管腔中心無（或少）細(xì)胞的曲細(xì)精管數(shù)量明顯增多，表明亞慢性苯暴露可引起小鼠睪丸的病理改變。苯暴露組Plzf、Stra8、Sycp3、Akap4 的mRNA表達(dá)均未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，而1 ppm組魚精蛋白Prm2的mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；100 ppm組過渡蛋白Tnp1、Tnp2，魚精蛋白Prm1、Prm2的mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：亞慢性苯吸入暴露可導(dǎo)致小鼠睪丸組織的病理改變，下調(diào)Tnps和Prms mRNA表達(dá)，主要影響單倍體精子細(xì)胞核內(nèi)組蛋白被魚精蛋白取代的過程。

［關(guān)鍵詞］苯；精子；精子生成；過渡蛋白；魚精蛋白；小鼠

苯被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和日常生活，從作為原料、溶劑、稀釋劑等工業(yè)應(yīng)用，到香煙煙霧、室內(nèi)裝修、汽車尾氣等生活環(huán)境污染，苯幾乎無處不在，暴露難以避免［1］。盡管苯主要損害造血系統(tǒng)，但苯的雄性生殖毒性也被一些研究所報(bào)道。有研究表明，苯接觸工人呈現(xiàn)精子數(shù)量下降，異常形態(tài)精子比例增加［2］，以及精子DNA損傷、非整倍體和染色體結(jié)構(gòu)畸變精子的比率升高［3-4］等現(xiàn)象。毒理學(xué)研究顯示，亞慢性苯暴露可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠的精子濃度降低、活力下降［5］，提示苯對(duì)精子生成具有明確的毒性作用。然而，苯對(duì)生精過程不同階段的影響特征還不清楚。本研究通過觀察亞慢性苯暴露小鼠睪丸組織病理學(xué)改變，以及檢測(cè)睪丸各類精細(xì)胞中階段特異性表達(dá)基因（即不同生精階段精子的marker基因）mRNA的表達(dá)，以探討苯對(duì)精子生成損傷的主要階段。

1　材料和方法

1.1材料 C57BL/6J雄性小鼠6～8周齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。HOPE-MED液氣類動(dòng)式染毒系統(tǒng)（天津合普，中國(guó)）；QC9800氣相色譜儀（上?？苿?chuàng)色譜儀器廠，中國(guó)）；Leica CM1950冰凍切片機(jī)（Leica，德國(guó)）；Olympus CX41顯微鏡（Olympus，日本）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀（Bio-Rad，美國(guó)）。蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（Beyotime，中國(guó)）；Trizol試劑（Sigma，美國(guó)）；ReverTra Ace qPCR RT Kit （TOYOBO，日本）；qPCR反應(yīng)試劑盒（TaKaRa，日本）。

1.2方法

1.2.1亞慢性苯吸入毒性實(shí)驗(yàn)：將30只小鼠隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組（0 ppm）、1 ppm組和100 ppm組，每組10只。實(shí)施每天8 h，每周5 d，共13周的亞慢性苯動(dòng)式吸入毒性實(shí)驗(yàn)。染毒期間，應(yīng)用氣相色譜檢測(cè)染毒柜內(nèi)苯濃度，確保柜內(nèi)濃度不超過設(shè)計(jì)濃度的10%。于最后染毒日，處死小鼠，取雙側(cè)睪丸［5］。

1.2.2冰凍切片：睪丸固定于多聚甲醛24 h，蔗糖脫水，OCT冷凍包埋，置冷凍切片機(jī)速凍至適宜硬度，以4 μm厚度連續(xù)切片，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片4張。

1.2.3HE染色：冰凍切片固定10～30 s，自來水洗1 min，蘇木素染色1 min，流水沖洗3 s，1%鹽酸乙醇分化3 s，自來水浸泡返藍(lán)15 min，伊紅染色1 min，75%、95%、100%乙醇梯度脫水各1 min，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄和qPCR：采用Trizol法提取小鼠睪丸細(xì)胞總RNA，取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按試劑盒說明書操作。選取精子發(fā)生中階段特異性表達(dá)基因作為不同階段精子的marker，選定的marker基因有代表未分化型精原細(xì)胞的Plzf，分化型精原細(xì)胞的Stra8，初級(jí)精母細(xì)胞的Sycp3，圓形精子的過渡蛋白Tnp1、Tnp2，長(zhǎng)形精子的Akap4，以及魚精蛋白Prm1、Prm2，選取GAPDH作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增鑒定，引物至少跨一個(gè)內(nèi)含子，以避免基因組DNA污染。qPCR引物序列和產(chǎn)物大小見表1。qPCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TapTM（2×）10 μL；引物（10 μmol/L）各0.6 μL；cDNA 1 μL；加去離子水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線與瓊脂糖凝膠電泳分析，以保證產(chǎn)物的特異性。每個(gè)樣品做3個(gè)平行管，使用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表1　qPCR引物序列和產(chǎn)物大小

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間差異比較分析采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1睪丸HE染色 苯暴露組小鼠睪丸組織呈現(xiàn)嗜酸性染色增強(qiáng)，1 ppm組偶見核溶解、細(xì)胞脫落等改變；100 ppm組小鼠睪丸生殖細(xì)胞變性、壞死的表現(xiàn)明顯，曲細(xì)精管管腔內(nèi)長(zhǎng)形精子的數(shù)量明顯減少，管腔中心無（或少）細(xì)胞的曲細(xì)精管數(shù)量顯著增多，見圖1。

圖1　睪丸組織病理學(xué)HE染色（×400）

2.2生精階段特異性表達(dá)基因mRNA表達(dá) 與對(duì)照組相比，苯暴露組marker基因Plzf、Stra8、Sycp3、Akap4 mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；1 ppm組魚精蛋白Prm2的mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；100 ppm組過渡蛋白Tnp1、Tnp2以及魚精蛋白Prm1、Prm2的mRNA表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

3　討論

本研究顯示，在100 ppm苯暴露組小鼠睪丸呈現(xiàn)明顯的生殖細(xì)胞變性、壞死，曲細(xì)精管管腔內(nèi)長(zhǎng)形精子的數(shù)量減少，管腔中心無（或少）細(xì)胞的曲細(xì)精管數(shù)量增多等病理學(xué)改變，該結(jié)果與先前的報(bào)道［6-7］結(jié)果相似。早在1985年，Ward等［6］進(jìn)行的亞慢性苯動(dòng)式吸入毒性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)300 ppm苯暴露組小鼠雙側(cè)睪丸萎縮、附睪中精子數(shù)量顯著減少、非正常精子比例增加等變化。在江俊康等［7］應(yīng)用更高濃度（400、2 000、10 000 mg/m3）苯的靜式染毒實(shí)驗(yàn)中，觀察到小鼠精子畸形率增加、睪丸各級(jí)生精細(xì)胞減少等病理變化。綜合這些研究，表明高濃度（100 ppm及以上）苯吸入暴露可導(dǎo)致小鼠睪丸生精細(xì)胞出現(xiàn)病理學(xué)改變，這為我們先前在100 ppm苯亞慢性吸入毒性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的小鼠精子濃度降低提供了病理學(xué)支持［5］。然而，本項(xiàng)研究在1 ppm苯暴露組并未發(fā)現(xiàn)有明確意義的組織學(xué)改變，該結(jié)果也與Ward等［6］在低濃度（1、10、30 ppm）苯吸入觀察的結(jié)果一致。

精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜的細(xì)胞分化過程，經(jīng)歷了有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成3個(gè)階段：①有絲分裂期：A型精原細(xì)胞通過增殖產(chǎn)生A、B兩型精原細(xì)胞，A型精原細(xì)胞不進(jìn)入分化途徑，保持有絲分裂能力；B型精原細(xì)胞進(jìn)入分化途徑，產(chǎn)生初級(jí)精母細(xì)胞；②減數(shù)分裂期：初級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)入第1次減數(shù)分裂，形成2個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，次級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)入第2次減數(shù)分裂，形成單倍體的圓形精子細(xì)胞；③精子形成期：圓形精子細(xì)胞進(jìn)行一系列復(fù)雜的形態(tài)學(xué)變化，包括核的濃縮成型，頂體及鞭毛、軸絲的發(fā)生以及核蛋白轉(zhuǎn)型和修飾，發(fā)育為成熟的精子。

在精子發(fā)生過程中，伴隨許多睪丸基因的階段特異性表達(dá)，其表達(dá)受嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)節(jié)，在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。本研究所檢測(cè)的8個(gè)基因都具有明顯的睪丸組織表達(dá)特征，同時(shí)也是精子發(fā)生中特異表達(dá)的基因，具有顯著的階段表達(dá)特異性。這些基因被用做不同生精階段精子的marker的合理性已在其他一些研究中得到證實(shí)［8-11］，marker基因的表達(dá)變化可以反映相應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化。

本研究結(jié)果顯示，苯暴露組未分化型精原細(xì)胞marker基因Plzf、分化型精原細(xì)胞marker基因Stra8、初級(jí)精母細(xì)胞marker基因Sycp3、長(zhǎng)形精子marker基因Akap4的mRNA表達(dá)均未有明顯差異，提示苯暴露并未對(duì)精子生成過程中未分化型精原細(xì)胞、分化型精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、長(zhǎng)形精子產(chǎn)生明顯損傷作用。

初級(jí)精母細(xì)胞分裂產(chǎn)生單倍體的圓形精子細(xì)胞，標(biāo)志著精子變態(tài)過程的開始。過渡蛋白特異表達(dá)于圓形精子，是圓形精子marker基因［12］，魚精蛋白階段特異表達(dá)于精子變態(tài)過程中。過渡蛋白和魚精蛋白在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生中精細(xì)胞組蛋白的置換和染色質(zhì)的凝結(jié)中發(fā)揮著重要作用。在精子細(xì)胞變態(tài)早期，伴隨著核濃縮現(xiàn)象出現(xiàn)了核組蛋白-Prms的轉(zhuǎn)換，體細(xì)胞組蛋白逐漸被睪丸特異性組蛋白（H1T）代替，隨后Tnps又代替了H1T，Prms又代替Tnps，完成精子細(xì)胞核蛋白的轉(zhuǎn)換。隨著精子的成熟，Prms與精子核DNA的結(jié)合越來越緊密，最后形成高度濃縮的精子特異性染色質(zhì)，從而保護(hù)精子DNA免受氧化應(yīng)激和其他內(nèi)外因素的影響［13］。

圖2　小鼠睪丸精子生成階段特異性表達(dá)基因mRNA表達(dá)

本研究結(jié)果顯示，1 ppm組Prm2的mRNA表達(dá)顯著降低；100 ppm組Prm1、Prm2、Tnp1、Tnp2的mRNA表達(dá)均明顯降低，提示苯對(duì)生精的影響主要發(fā)生在單倍體精子階段，可能主要影響精子細(xì)胞核內(nèi)組蛋白被Prms的取代過程，造成核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常。有研究表明，核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常，使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得松散，精子DNA鏈上的電荷無法中和，從而對(duì)精子DNA產(chǎn)生損傷［14-15］。精子核蛋白成熟度和精子DNA完整性存在顯著正相關(guān)［16］，Prms缺乏比例高時(shí)，精子DNA碎片化程度顯著升高，精子頭部異常比例顯著升高［17］。該結(jié)果對(duì)于已有的一些有關(guān)苯精子毒性的研究報(bào)道給予了一個(gè)合理的解釋，如苯接觸工人呈現(xiàn)精子數(shù)量下降，異常形態(tài)精子比例增加［2］，以及精子DNA損傷、非整倍體和染色體結(jié)構(gòu)畸變精子的比率升高［3-4］，實(shí)驗(yàn)小鼠的精子濃度降低、活力下降等［5］。

綜上所述，苯暴露可引起小鼠睪丸病理學(xué)改變，主要影響單倍體精子細(xì)胞核內(nèi)組蛋白被Prms取代的過程。該研究豐富了苯對(duì)精子毒性機(jī)制的認(rèn)識(shí)，對(duì)已經(jīng)報(bào)道的苯對(duì)精子的損傷效應(yīng)提供了合理的解釋。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 林沖， 劉政， 于秀遠(yuǎn)， 等. 亞慢性苯吸入小鼠凋亡相關(guān)基因Survivin、Bcl2L13的表達(dá)與甲基化狀態(tài)分析［J］. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 44（7）︰ 480-484.

［2］ KATUKAM V， KULAKARNI M， SYED R， et al. Effect of benzene exposure on fertility of male workers employed in bulk drug industries［J］. Genet Test Mol Biomarkers，2012， 16（6）︰ 592-597.

［3］ XING C， MARCHETTI F， LI G， et al. Benzene exposure near the U.S. permissible limit is associated with sperm aneuploidy［J］. Environ Health Perspect， 2010， 118（6）︰ 833-839.

［4］ MACHETTI F， ESKENAZI B， WELDON R H， et al. Occupational exposure to benzene and chromosomal structural aberrations in the sperm of Chinese men［J］. Environ Health Perspect， 2012， 120（2）︰ 229-234.

［5］ 劉政， 劉子巍， 林沖， 等. 亞慢性低濃度苯暴露對(duì)小鼠精子活力的影響［J］. 毒理學(xué)雜志， 2013， 27（3）︰ 207-209.

［6］ WARD C O， KUNA R A， SNYDER N K， et al. Subchronic inhalation toxicity of benzene in rats and mice［J］. Am J Ind Med， 1985， 7（5-6）︰ 457-473.

［7］ 江俊康， 翁詩君. 苯對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的影響［J］. 中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志， 2004， 17（2）︰ 94-96.

［8］ COSTOYA J A， HOBBS R M， BARNA M， et al. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells［J］. Nat Genet， 2004， 36（6）︰ 653-659.

［9］ SADATE-NGATCHOU P I， PAYNE C J， DEARTH A T， et al. Cre recombinase activity specific to postnatal， premeiotic male germ cells in transgenic mice［J］. Genesis， 2008， 46 （12）︰ 738-742.

［10］ SCHALK J A， DIETRICH A J， VINK A C， et al. Localization of SCP2 and SCP3 protein molecules within synaptonemal complexes of the rat［J］. Chromosoma， 1998， 107（8）︰540-548.

［11］ BROWN P R， MIKI K， HARPER D B， et al. A-kinase anchoring protein 4 binding proteins in the fi brous sheath of fl agellum［J］. Biol Reprod， 2003， 68（6）︰ 2241-2248.

［12］ ULLAS K S， RAO M R. Phosphorylation of rat spermatidal protein TP2 by sperm-specific protein kinase A and modulation of its transport into the haploid nucleus［J］. J Biol Chem， 2003， 278（52）︰ 52673-52680.

［13］ BRAUN R E. Packaging paternal chromosomes with protamine［J］. Nat Genet， 2001， 28（1）︰ 10-12.

［14］ EVENSON D P， LARSON K L， JOST L K. Sperm chromatin structure assay︰ Its clinical use for detecting sperm DNA fragmentation in male infertility and comparisons with other techniques［J］. J Androl， 2002， 23（1）︰ 25-43.

［15］ 黃學(xué)鋒， 金建遠(yuǎn)， 費(fèi)前進(jìn)， 等. 精子DNA損傷︰ 獨(dú)立的精子質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010， 40（3）︰ 239-242.

［16］ 陳康， 周宇林， 余波瀾， 等. 精子核蛋白組型異常及DNA損傷與精子活動(dòng)力的相關(guān)性研究［J］. 中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）， 2013， 7（2）︰ 575-578.

［17］ UTSUNO H， MIYAMOTO T， OKA K， et al. Morphological alterations in protamine-defi cient spermatozoa［J］. Hum Reprod， 2014， 29（11）︰ 2374-2381.

（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

·讀者·作者·編者·

Expressions inhibition of haploid sperm nucleoprotein genes in mice sub-chronically exposed to benzene via inhalation

ZHANG Yaya1， QIN Qiongyu1， LIN Chong1， SUN Shuqiang1， ZHU Hua2， YANG Xinjun1， YAN Hongtao1. 1.Department of Preventive Medicine， Environmental Science and Public Health College， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035； 2.Basic Medicine College， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035

Abstract：Objective： To explore the major damage stage of spermatogenesis in mice submitted to subchronic inhalation of benzene. Methods： C57BL/6J mice were randomly divided into control， 1 ppm and 100 ppm benzene exposure group. Simulated occupational exposure condition， a subchronic inhalation exposure test was carried out using the dynamic control equipment. The pathological change of testicular tissue was observed with HE staining. The mRNA expression of marker genes of spermatogenesis was quantitatively tested with real-time polymerase chain reaction， the selected marker genes included Plzf of undifferentiated spermatogonia， Stra8 of differentiated spermatogonia， Sycp3 of primary spermatocyte， Tnp1 and Tnp2 of round spermatid， Akap4 of elongating spermatid， as well as Prm1 and Prm2. Results： Enhanced eosinophilic staining were observed in mice testicular tissue section of benzene exposure groups， a few karyolysis and exfoliative cells were found in 1 ppm exposure group，the phenomenon of mice testis germ cell degeneration and necrosis were more obvious in 100 ppm exposure group，the number of seminiferous tubules with no or few germ cells were increased obviously. It suggested that subchronic benzene exposure could induce pathological change in mice testis. The mRNA expression of Plzf， Stra8， Sycp3，Akap4 did not show statistical difference in all groups， Prm2 expression was signifi cantly reduced in 1 ppm group than that of control group （P＜0.01）. The mRNA expression of transition protein Tnp1 and Tnp2， protamine Prm1 and Prm2 were signifi cantly reduced in 100 ppm exposure group than that of the control and 1 ppm group. Conclusion：Subchronic benzene exposure can induce the pathological change in mice testis， down-regulate the mRNA expression of Tnps and Prms， mainly infl uence the process of histone replaced by protamine in round spermatid nuclei.

Key words：benzene； sperm； spermatogenesis； transition protein； protamine； mice

［中圖分類號(hào)］R114

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.004

收稿日期：2015-09-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30972510）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY13H260003）。

作者簡(jiǎn)介：張亞亞（1990-），女，河北石家莊人，碩士生。

通信作者：閆洪濤，教授，Email：htyan@wmu.edu.cn。