朱小暉，張申華

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宮頸癌組織中microRNA-506表達(dá)及臨床病理意義

朱小暉，張申華

[摘要]目的：探討宮頸癌組織中微小RNA(microRNA，miR)-506表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法：采用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)46例宮頸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中miR-506表達(dá)，根據(jù)其表達(dá)情況對(duì)臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析。Transwell well方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-506寡核苷酸對(duì)Hela細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲影響,Western blot方法檢測(cè)E-cadherin和vimentin表達(dá)。結(jié)果：46例宮頸癌組織中miR-506相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P<0.01)。在Ⅲ/Ⅳ期宮頸癌組織中miR-506相對(duì)表達(dá)量明顯低于Ⅰ/Ⅱ期宮頸癌組織(P<0.01)；在低分化癌組織中相對(duì)表達(dá)量明顯低于中高分化癌組織(P<0.01)。且miR-506在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相對(duì)表達(dá)量明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)；但在患者年齡、絕經(jīng)與否和腫瘤直徑間miR-506相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-506轉(zhuǎn)染組Hela細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲均明顯低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，miR-506轉(zhuǎn)染組抑制Hela細(xì)胞vimentin表達(dá),而促進(jìn)E-cadherin表達(dá)。結(jié)論：宮頸癌組織中存在miR-506低表達(dá)，miR-506表達(dá)缺失可能與宮頸癌的腫瘤生長(zhǎng)和侵襲發(fā)展相關(guān)，在宮頸癌預(yù)后判斷中可能有一定價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]子宮腫瘤；微小RNA-506；病理學(xué)特征；侵襲；轉(zhuǎn)移

宮頸癌是女性中排名第三的惡性腫瘤，人乳頭狀瘤病毒與基因突變被認(rèn)為與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)[1]。近年來(lái)宮頸癌發(fā)病率逐步增高，盡管放化療聯(lián)合應(yīng)用提高了患者短期生存率，但5年生存率僅提高3%，因此，明確宮頸癌的發(fā)生分子機(jī)制，對(duì)提高靶向治療有重要的臨床意義。微小RNA(microRNA，miR)在調(diào)控腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用,最近研究[2-3]表明，miR-506具有抑制肝癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。也有研究[4-5]發(fā)現(xiàn),miR-506在乳腺癌中可抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換,在結(jié)腸癌中低表達(dá)可導(dǎo)致化療耐藥。目前miR-506在宮頸癌組織中意義不明，本研究采用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)46例宮頸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中miR-506表達(dá)，分析miR-506和臨床病理參數(shù)的關(guān)系,探討miR-506在宮頸癌發(fā)生中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料標(biāo)本采自2012年2月至2014年5月經(jīng)我科行手術(shù)治療的宮頸癌患者46例，術(shù)后均經(jīng)病理確診?；颊吣挲g28～73歲。按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟腫瘤分期Ⅰ期9例,Ⅱ期12例,Ⅲ期14例，Ⅳ期11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例?；颊咝g(shù)前均未接受放、化療或激素等治療。癌組織取肉眼所見(jiàn)的腫瘤組織,而癌旁組織取距離腫瘤邊緣2 cm的良性組織,所取標(biāo)本離體后置于液氮罐內(nèi)迅速冷凍后置-80 ℃保存。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,RNA提取試劑盒購(gòu)自百泰克生物有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR熒光染料Sybergreen購(gòu)自Takara生物有限公司,miR-506特異性引物購(gòu)自廣州銳博生物有限公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司,8 μm的Transwell購(gòu)自Milipore公司,E-cadherin和vimentin抗體購(gòu)自Cell Signal生物公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內(nèi)參抗體購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1RNA的提取取液氮保存的宮頸癌組織及癌旁組織標(biāo)本約100 mg,采用液氮研磨法將組織磨成粉末,然后加入約1 mL的Trizol裂解組織試劑，接Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA。紫外分光光度儀檢測(cè)RNA溶液D260/D280比值，計(jì)算RNA濃度及純度，D260/D280比值在1.8～2.1者認(rèn)為具有較高的純度,用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.3.2RT-PCR檢測(cè)miR-506取1 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，70 ℃10 min。miR-506莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物購(gòu)自廣州銳博生物,上游引物5′-GCG CTG GAA TGT AAA GAA GT-3′，下游引物為5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′,U6內(nèi)參的上游引物5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′,下游引物R：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′；PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃變性5 min，95 ℃10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，記錄每個(gè)反應(yīng)管中標(biāo)本的Ct值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用RT-PCR中的相對(duì)定量法進(jìn)行分析，以2-ΔΔCt表示宮頸癌組織miR-506表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)量的變化倍數(shù)，其中ΔΔCT=(CtmiR-506-CtU6) 宮頸癌-(CtmiR-212-CtU6) 宮頸癌旁組織。

1.3.3miR-506寡核苷酸脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和miR-506轉(zhuǎn)染組,對(duì)照組不做轉(zhuǎn)染，而miR-506轉(zhuǎn)染組采用100 nmol/L的miR-506寡核苷酸，在細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合度時(shí)，吸出培養(yǎng)液，換成含脂質(zhì)體2000的100 nmol/L的miR-506寡核苷酸繼續(xù)孵育6 h，然后換10%完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，細(xì)胞消化后做遷移、侵襲和蛋白提取實(shí)驗(yàn)。

1.3.4細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)采用BD公司8 μm的Transwell趨化小室,上室置入1×105的Hela細(xì)胞,下室放置1 mL完全培養(yǎng)液,讓細(xì)胞遷移,侵襲24 h。然后用棉簽刮去未發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞,顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5Western blot檢測(cè)E-cadherin和vimentin采用鋪滿(mǎn)Hela細(xì)胞的6孔板作轉(zhuǎn)染，于100 nmol/L的miR-506寡核苷酸或無(wú)效干預(yù)寡核苷酸轉(zhuǎn)染后48 h提取蛋白，未做任何處理組作對(duì)照組，取50 μg蛋白做10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜采用聚二氟乙烯膜,采用5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗膜3次,每次15 min，然后加入兔抗人E-cadherin(1∶100)和vimentin(1∶150)及內(nèi)參抗體GAPDH(1∶1 000)4 ℃搖床過(guò)夜。TBST洗膜后加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,然后采用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光顯影。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t(t′)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2．2臨床病理參數(shù)與宮頸癌組織中miR-506表達(dá)的關(guān)系患者不同臨床分期及組織學(xué)分級(jí)中，miR-506表達(dá)量不同，其中Ⅲ期、Ⅳ期中miR-506的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期(P<0.01)；在低分化癌組織中相對(duì)表達(dá)量明顯低于中高分化癌組織(P<0.01)。而且miR-506表達(dá)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組miR-506的相對(duì)表達(dá)量明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)。miR-506表達(dá)在宮頸癌患者年齡、絕經(jīng)與否及腫瘤直徑間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

2.3miR506抑制Hela細(xì)胞增殖、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白表達(dá)通過(guò)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染濃次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)為(37.0±2.6)，明顯高于miR-506轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移數(shù)的(13.3±1.5)(t=13.68,P<0.01)(見(jiàn)圖1)，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組為(22±3.0)，顯著高于miR-506轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的(13±1.0)(t=4.93,P<0.01)(見(jiàn)圖2)。表明miR-506抑制Hela細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲。而Western blot結(jié)果提示miR-506抑制Hela細(xì)胞vimentin表達(dá),但促進(jìn)E-cadherin表達(dá)(見(jiàn)圖3)。

表1　宮頸癌患者臨床病理參數(shù)與miR-506表達(dá)關(guān)系±s)

*示t′值

3討論

研究腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制對(duì)腫瘤治療有重要意義，目前研究[6]發(fā)現(xiàn)，多種miR在調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用，異常表達(dá)與惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)，而惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴隨著眾多表達(dá)的異常變化[7]。宮頸癌是女性中常見(jiàn)的惡性腫瘤，高度惡性，容易復(fù)發(fā)，可切除率低。宮頸癌組織中存在miR表達(dá)異常，且miR-506在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[8]，但miR-506在宮頸癌中的作用機(jī)制并不完全清楚。本研究結(jié)果表明，在宮頸度為100 nmol/L的miR-506寡核苷酸,每組重復(fù)3癌組織中miR-506存在低表達(dá)，在Ⅲ/Ⅳ期宮頸癌組織中miR-506相對(duì)表達(dá)量明顯低于Ⅰ/Ⅱ期宮頸癌組織；在低分化癌組織中相對(duì)表達(dá)量明顯低于中高分化癌組織。miR-506在宮頸癌組織中與患者年齡及腫瘤大小無(wú)關(guān)，提示miR-506與宮頸癌病理學(xué)參數(shù)密切相關(guān)。

侵襲、轉(zhuǎn)移是宮頸癌不斷發(fā)展并危及患者生命的重要因素，容易導(dǎo)致患者死亡。而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要病理步驟之一[9]。本研究結(jié)果表明，miR-506在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相對(duì)表達(dá)量明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Gli3轉(zhuǎn)錄因子在惡性腫瘤生長(zhǎng)及浸潤(rùn),轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,Gli3調(diào)控眾多信號(hào)通路[10],包括Wnt/β-catenin，AKT和ERK。miR一般通過(guò)靶向調(diào)控mRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá),目前研究[11]表明，miR-506可在宮頸癌中調(diào)節(jié)Gli3表達(dá),也有報(bào)道[4]miR-506可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Snail2的表達(dá)，抑制EMT和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。我們研究發(fā)現(xiàn)miR-506可以抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移，上調(diào)E-cadherin,而下調(diào)vimentin,提示miR-506可以逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，本研究結(jié)果表明，宮頸癌組織中存在miR-506低表達(dá)，且miR-506低表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織學(xué)分級(jí)差有關(guān)。miR-506過(guò)表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移，提示miR-506在宮頸癌組織中發(fā)揮抑癌作用。Gli3轉(zhuǎn)錄因子是miR-506調(diào)控靶蛋白，但miR-506是否通過(guò)其他蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的惡性行為，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，有待于進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯馬啟)

The expression of microRNA-506 in cervical cancer and its clinical significance

ZHU Xiao-hui,ZHANG Shen-hua

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstPeople′sHospitalofTianmen,TianmenHubei431700,China)

[Abstract]Objective:To explore the expression of microRNA(miR)-506 in cervical cancer and its clinically pathological significance.Methods:The expressions of miR-506 in cervical cancer tissues and corresponding paracarcinoma tissues in 46 patients were detected using stem ring real-time reverse transcription polymerase chain reaction,the clinically pathological data were analyzed according to the miR-506 expression situation.The migration and invasion of Hela cells transfected with miR-506 were detected using Transwell,and the E-cadherin and vimentin protein expressions were detected using Western Blot.Results:The expression of MiR-506 in cervical cancer tissue was significantly lower than that in paracarcinoma tissues(P<0.01).The expression of MiR-506 in type Ⅲ/Ⅳ cervical cancer tissue was significantly lower than that in type Ⅰ/Ⅱ cervical cancer tissue(P<0.01).The expression of MiR-506 in low differentiation cervical cancer tissue was significantly lower than that in high differentiation cervical cancer tissue(P<0.01).The expression of MiR-506 in patients with lymph node metastasis was significantly lower than that in patients without lymph node metastasis(P<0.01).The differences of the MiR-506 expressions in different ages,menostasis and tumor diameters were not statistically significant(P>0.05).The migration and invasion of Hela cells transfected with miR-506 was significantly lower than those in Hela cells non-transfected with miR-506(P<0.01).The expressions of vimentin and E-cadherin in Hela cells transfected with miR-506 were inhibited and promoted,respectively(P<0.01).Conclusions:The expression of miR-506 in cervical cancer is low,which may be associated with tumor growth and development of cervical cancer,the miR-506 has certain value in judging the prognosis of cervical cancer.

[Key words]cervical neoplasms；microRNA-506；pathological characteristis;invasion;migration

[文章編號(hào)]1000-2200(2016)03-0325-04·臨床醫(yī)學(xué)·

[收稿日期]2015-01-24

[作者簡(jiǎn)介]朱小暉(1981-)，男，主治醫(yī)師.[通信作者] 張申華，副主任醫(yī)師.E-mail:3686013@qq.com

[中圖法分類(lèi)號(hào)]R 737.77

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.015

[作者單位] 湖北省天門(mén)市第一人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，431700