徐志慶，夏　惠，李柏青

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不同刺激劑對健康人和結(jié)核患者外周血T細胞產(chǎn)生γ干擾素和腫瘤壞死因子-α的影響

徐志慶，夏惠，李柏青

[摘要]目的：檢測健康人和結(jié)核患者外周血經(jīng)不同刺激劑刺激后T細胞亞群產(chǎn)生γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的變化。方法：12名健康人和12例結(jié)核患者的外周血單個核細胞用佛波醇脂(PMA)+鈣離子霉素(IM)、結(jié)核桿菌耐熱抗原(Mtb-HAg)、植物血凝素(PHA)刺激，莫能霉素阻斷，流式細胞儀檢測產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的T細胞亞群比例。結(jié)果：PMA+IM刺激健康人外周血αβ T細胞產(chǎn)生IFN-γ的比例明顯高于結(jié)核患者(P<0.01)；PMA+IM、Mtb-HAg和PHA刺激健康人外周血γδ T細胞產(chǎn)生IFN-γ的比例高于結(jié)核患者(P<0.05～P<0.01)。PMA+IM和PHA刺激健康人外周血αβ T細胞產(chǎn)生TNF-α的比例均高于結(jié)核患者(P<0.05)；PMA+IM和PHA刺激健康人外周血γδ T細胞產(chǎn)生TNF-α的比例均高于結(jié)核患者(P<0.05)。結(jié)論：經(jīng)不同刺激劑刺激后，健康人γδ T細胞產(chǎn)生IFN-γ的比例高于結(jié)核患者γδ T細胞產(chǎn)生IFN-γ的比例。經(jīng)PMA和PHA刺激后，健康人αβ T和γδ T細胞產(chǎn)生TNF-α的比例高于結(jié)核患者。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌；T細胞亞群；γ-干擾素；腫瘤壞死因子-α；流式細胞儀

結(jié)核病嚴重危害人類健康，全世界結(jié)核病每年發(fā)病830萬人，死亡180萬人。第四次全國結(jié)核病的調(diào)查結(jié)果顯示，我國超過5億人感染了結(jié)核分枝桿菌(Mtb)，占全國總?cè)丝诘?4.5%[1]。開發(fā)早期、快速、準確診斷結(jié)核病的實驗技術(shù)十分重要。近年來,結(jié)核感染的實驗室診斷不斷取得進展,尤以γ干擾素(IFN-γ)為基礎(chǔ)的免疫學診斷研究最為廣泛，其對結(jié)核病的診斷有較好的敏感性和特異性[2]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的多肽類細胞因子，在炎癥反應、免疫系統(tǒng)的發(fā)展、細胞程序性死亡和脂代謝中起重要作用，在結(jié)核病的免疫機制中也扮演著重要的角色。本文就健康人和結(jié)核患者外周血T細胞經(jīng)不同刺激后產(chǎn)生的IFN-γ和TNF-α進行測定，分析其變化和意義。

1材料與方法

1.1樣本資料12名健康人外周血標本來自蚌埠市中心血站健康志愿者,男6名，女6名，年齡18～65歲。12例結(jié)核患者外周血標本來自蚌埠市傳染病醫(yī)院，男6例，女6例，年齡36～85歲，經(jīng)臨床診斷為肺結(jié)核。每份標本的采集均征得本人書面同意。

1.2主要試劑及儀器培養(yǎng)基 RPMI1640購自GIBCO 公司產(chǎn)品。佛波醇酯(Phorbo 12-myristate 13-acetate，PMA)、鈣離子霉素(ionomycin，IM)、莫能霉素(monensin，Mo)均購自 Sigma-Aldrich 公司。植物血凝素(PHA)購自 Sigma 公司。結(jié)核桿菌耐熱抗原(Mtb-HAg)為本實驗室自制?？?CD3-APC購自MACs公司，抗-TCR-γδ-TC，抗-IFN-γ-FITC、抗-TNF-α-PE均購自Invitrogen 公司。流式細胞儀：FACS Calibur，美國BD公司。

1.3細胞處理從血站取回健康志愿者的抗凝外周血滅菌PBS混勻。Ficoll淋巴細胞分離液常規(guī)分離單個核細胞。20%DMSO及純血清重懸。加入標記好的凍存管中，每管1 mL，封口膜密封，放入-80 ℃冰箱過夜，第2天移至液氮罐中，使用時復蘇。結(jié)核患者抗凝外周血取自傳染病醫(yī)院，取回后立即按0.5 mL與等體積不完全RPMI1640混勻后加入不同的刺激劑，PMA刺激6 h，Mtb-HAg和PHA刺激20 h后收集細胞進行檢測(即健康志愿者刺激時用復蘇的淋巴細胞，結(jié)核患者刺激時用全血，因結(jié)核患者血量較少)。每組細胞均設置同型對照組。

1.4統(tǒng)計學方法采用t檢驗。

2結(jié)果

2.1不同刺激劑刺激健康人和結(jié)核患者外周血T細胞不同亞群產(chǎn)生IFN-γ比較健康人及結(jié)核患者外周血T細胞經(jīng)不同刺激后，αβ和γδ T細胞2個亞群均能產(chǎn)生IFN-γ。PMA+IM刺激健康人外周血αβ T細胞產(chǎn)生IFN-γ的比例高于結(jié)核患者組(P<0.05)；PMA+IM、Mtb-HAg和PHA刺激健康人外周血γδ T產(chǎn)生IFN-γ的比例均高于結(jié)核患者組(P<0.05～P<0.01)(見表1、2及圖1、2)。

2.2不同刺激劑刺激健康人和結(jié)核患者外周血T細胞不同亞群產(chǎn)生TNF-α的比較健康人及結(jié)核患者外周血T細胞經(jīng)不同刺激后，αβ和γδ T細胞2個亞群均能產(chǎn)生TNF-α。 PMA+IM和PHA刺激健康人外周血αβ T細胞產(chǎn)生TNF-α的比例高于結(jié)核患者組(P<0.05)；PMA+IM和PHA刺激健康人外周血γδ T細胞產(chǎn)生TNF-α的比例均高于結(jié)核患者組(P<0.05)(見表3、4及圖3、4)。

3討論

TNF是一類由激活的巨噬細胞、淋巴細胞等細胞所分泌的細胞因子，具有廣泛的生物活性。結(jié)核病是一種與免疫病相關(guān)的感染性疾病，多種細胞因子參與結(jié)核病的免疫應答及病理過程，其中TNF-α是一種重要炎癥因子。TNF-α在結(jié)核桿菌感染中起到保護性免疫和致炎的雙重作用[3-4]；在結(jié)核患者在血清水平、病灶組織中和基因水平的TNF-α表達量均與正常人有差異；TNF-α能顯著誘導巨噬細胞抑制結(jié)核桿菌生長,并引起機體產(chǎn)生有效的肉芽腫應答[5-8]。

以往研究[9-10]表明，Mtb感染宿主后誘導CD4+和 CD8+αβ T 細胞的特異性免疫應答，并激活巨噬細胞發(fā)揮免疫效應作用。但這些細胞承擔保護性免疫和參與結(jié)核病發(fā)病的詳細機制，并未得到滿意的解釋。近年來，對天然免疫細胞參與抗Mtb感染的免疫保護作用或結(jié)核病發(fā)病機制的探討，逐漸受到關(guān)注。其中具有天然免疫樣作用的 γδ T 細胞在結(jié)核感染中的免疫作用，已得到眾多研究者的實驗研究和臨床觀察的證實[9-10]。

本研究結(jié)果顯示，Mtb-HAg和非特異性刺激劑(PMA+IM、PHA)均可以刺激外周血中T細胞亞群產(chǎn)生IFN-γ,其中健康人產(chǎn)生IFN-γ的γδ T細胞比例比結(jié)核患者高。說明Mtb感染會導致體內(nèi)IFN-γ水平的下降。因為Mtb主要寄生于巨噬細胞內(nèi)，IFN-γ 對于單核巨噬細胞是一種較強的激活劑，能使巨噬細胞產(chǎn)生抗菌分子來發(fā)揮殺滅結(jié)核桿菌的作用。機體內(nèi)IFN-γ隨著抗結(jié)核的治療進行而發(fā)生變化。在治療開始時，IFN-γ產(chǎn)生較少，但抗結(jié)核治療2個月后回復正常，并一直保持到療程結(jié)束[11]。結(jié)核患者免疫功能低下，免疫功能低下又會加重結(jié)核病情，兩者互為因果，造成惡性循環(huán)。不管是在健康人還是結(jié)核患者，產(chǎn)生IFN-γ的γδ T細胞比αβ T細胞要高，進一步說明γδ T細胞在抗Mtb感染過程中起到重要作用。

本實驗結(jié)果還提示，健康人產(chǎn)生TNF-α的T細胞比例比結(jié)核患者高。TNF-α是控制Mtb感染的重要細胞因子，它的過量產(chǎn)生會導致免疫病理性疾病，表達下降則會造成Mtb大量繁殖。巨噬細胞感染Mtb后產(chǎn)生TNF-α,TNF-α對結(jié)核感染的保護性免疫起著十分重要的作用，其對防止持續(xù)性結(jié)核病再燃也有重要作用。從流式結(jié)果初步顯示，當人體感染結(jié)核病時，體內(nèi)產(chǎn)生TNF-α的量會下降，有可能經(jīng)過治療后會上升，最終達到正常水平量。因此，檢測結(jié)核患者外周T細胞不同亞群產(chǎn)生TNF-α的比例，可以在一定程度上提示結(jié)核患者的免疫狀態(tài)，例如，當結(jié)核患者外周血T細胞亞群產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α的比例與剛?cè)朐簳r有升高，可能提示患者免疫狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。

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(本文編輯姚仁斌)

Comparision of the different stimulants on the peripheral blood T cells of healthy people and tuberculosis patients producing interferon-γ and tumor necrosis factor-α

XU Zhi-qing,XIA hui,LI Bai-qing

(DepartmentofImmunology,BengbuMedicalCollege,AnhuiKeyLaboratoryofInfectionandImmunity，BengbuAnhui233030,China)

[Abstract]Objective:To detect the changes of the different stimulants on the peripheral blood T cell subsets of healthy people and tuberculosis(TB) patients producing interferon-γ(IFN-γ) and tumor necrosis factor-α(TNF-α).Methods:The proportion of T cell subsets producing INF-γ and TNF-α in 12 healthy people peripheral blood mononuclear cells and 12 TB patients peripheral blood stimulated with PMA combined with ionomycin,Mtb-Hag,PHA and blocked with monensin were detected using the flow cytometry.Results:The proportion of INF-γ produced by αβ T cells of peripheral blood stimulated with PMA in healthy people was significantly higher than that in TB patients(P<0.05).The proportions of INF-γ produced by γδ T cells of peripheral blood stimulated with PMA,Mtb-Hag and PHA in healthy people were higher than that in TB patients(P<0.05 to P<0.01).The proportions of TNF-α produced by αβ T cells of peripheral blood stimulated with PMA PHA in healthy people were higher than those in TB patients(P<0.05).The proportions of INF-α produced by γδ T cells of peripheral blood stimulated with PMA and PHA in healthy people were higher than that in TB patients(P<0.05 ).Conclusions:After stimulated with different stimulants,the proportion of INF-γ produced by γδ T cells in healthy people is higher than that in TB patients.After simulated with PMA and PHA,the proportion of TNF-α produced by αβ T cells and γδ T cells in healthy people is higher than that in TB patients.

[Key words]Mycobacterium tuberculosis;T cell subset;interferon-γ;tumor necrosis factor-α;flow cytometry

[文章編號]1000-2200(2016)03-0288-04·基礎(chǔ)醫(yī)學·

[收稿日期]2014-02-24

[基金項目]國家自然科學基金項目(81072426)

[作者簡介]徐志慶(1988-),女，碩士研究生.[通信作者] 李柏青，博士碩士研究生導師，教授.E-mail:baiqingli@bbmc.edu.cn

[中圖法分類號]R 378.911

[文獻標志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.003

[作者單位] 蚌埠醫(yī)學院 免疫學教研室，安徽省感染與免疫重點實驗室，安徽 蚌埠 233030