張　玥， 羅　俊， 黃能慧， 張小毅

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

?

靈芝三萜類化合物對(duì)AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響*

張玥， 羅俊**， 黃能慧， 張小毅

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 研究靈芝三萜類化合物(GLT)對(duì)阿爾茨海默病(AD)模型大鼠腦細(xì)胞凋亡的影響。方法: 將自然衰老模型大鼠60只隨機(jī)均分為 GLT低、中、高劑量組，模型組，溶媒對(duì)照組(食用油)及陽(yáng)性對(duì)照組(健腦膠囊),5月齡大鼠10只為正常對(duì)照組；連續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物60 d，取各組大鼠海馬組織HE染色觀察神經(jīng)元變化，TUNEL法檢測(cè)各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果: 與正常對(duì)照組比較，模型動(dòng)物腦海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞排列極度紊亂，大小形態(tài)不規(guī)則，數(shù)量明顯減少，海馬凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)有大量深染棕黃色顆粒狀；給予GLT后，神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕，GLT高劑量組無明顯神經(jīng)細(xì)胞壞死特征;與模型組比較，GLT中、高劑量組大鼠海馬凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，神經(jīng)細(xì)胞核淺染棕黃色顆粒。結(jié)論: GLT可減少AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，這可能是防治AD的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]海馬； 阿爾茨海默病； 衰老； 細(xì)胞凋亡； 靈芝三萜類化合物

阿爾茨海默病(alzheimer disease, AD)是一種老年人神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病潛隱，臨床主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的認(rèn)知和記憶功能減退，并伴有進(jìn)行性的記憶、智能、言語(yǔ)、視空間技能障礙及人格改變等[1]。AD的病因和發(fā)病機(jī)制不明確，臨床多采用細(xì)胞代謝激活劑等藥物改善腦細(xì)胞功能，無特異性治療藥物及方法。本課題組前期研究表明靈芝主要有效成分—靈芝三萜類化合物(Ganodermalucidumtriterpenoids，GLT)能提高AD自然衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能是通過改善AD大鼠腦內(nèi)能量代謝，提高總抗氧化能力，降低乙酰膽堿酯酶活力，升高乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力等起效，本文觀察GLT對(duì)AD模型大鼠腦細(xì)胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料

GLT(中科院地化所提取)，健腦膠囊 (JNJN，青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)公司)，TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢 BOSTER公司)及BIOMIAS-99圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所)。SD大鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2方法

1.2.1AD大鼠篩選取24月齡SD大鼠100只和5月齡大鼠10只進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，以5月齡大鼠的逃避潛伏期均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差為判別AD的標(biāo)準(zhǔn)，24月齡大鼠大于該值的為AD大鼠[2]。

1.2.2分組篩選出的60只AD大鼠隨機(jī)分為模型組(NS 10 mL/kg)、GLT低劑量組(0.25 g/kg)、GLT中劑量組(0.5 g/kg)、GLT高劑量組(1.0 g/kg)、溶媒對(duì)照組(食用油10 mL/kg)及陽(yáng)性對(duì)照組(健腦膠囊 0.38 g/kg)，每組10只，雌雄各半；以5月齡大鼠為正常對(duì)照組(NS 10 mL/kg)。每日1次灌胃給藥，連續(xù)60 d。

1.3觀察指標(biāo)

給藥結(jié)束后，各組大鼠迅速于冰臺(tái)上0℃下斷頭取出大腦，取視交叉后 5 mm厚的冠狀位腦片(包含海馬)，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，每例標(biāo)本切片分別作HE染色觀察海馬細(xì)胞；TUNEL法(按試劑盒操作)檢測(cè)海馬神經(jīng)凋亡細(xì)胞并計(jì)數(shù)：每張切片(每例動(dòng)物標(biāo)本)隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，以5個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均值作為一例標(biāo)本的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1大鼠海馬組織病理學(xué)

圖1顯示，正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，胞體為類圓形；細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞膜、胞核輪廓清晰；神經(jīng)細(xì)胞無明顯腫脹及壞死。模型組及溶媒對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列極度紊亂，大小形態(tài)不規(guī)則，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)輪廓模糊，有明顯神經(jīng)細(xì)胞空泡樣變性改變(細(xì)胞漿染色變淺，其內(nèi)有大小不等圓形或類圓形空泡，有明顯的神經(jīng)細(xì)胞壞死表現(xiàn))；核結(jié)構(gòu)模糊、向一側(cè)固縮、碎裂或溶解消失。GLT低、中劑量組及陽(yáng)性藥對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列輕度紊亂；GLT高劑量組神經(jīng)細(xì)胞大小形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞膜、胞核輪廓清晰，細(xì)胞體積稍增大、無明顯腫脹，少量神經(jīng)細(xì)胞空泡變性，無明顯神經(jīng)細(xì)胞壞死特征。

2.2大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡

顯微鏡下可見細(xì)胞核呈棕黃色顆粒狀改變(凋亡小體)的為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭所示)。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)有大量深染棕黃色顆粒狀；與模型組相比，GLT中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組海馬凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低，神經(jīng)細(xì)胞核淺染棕黃色顆粒(圖2、表1)。

表1　各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況±s)

(1)與正常對(duì)照組比較，P<0.01;(2)與模型組比較，P<0.05

3討論

有關(guān)AD的發(fā)病機(jī)制研究很多，研究已證實(shí)基因突變、腦內(nèi)膽堿能傳遞功能紊亂、自由基損傷、Aβ沉積、神經(jīng)元凋亡等因素可能在AD的發(fā)病中起關(guān)鍵性作用。習(xí)慣所稱靈芝屬中赤芝的子實(shí)體部分。靈芝具有廣泛的藥理活性，主要有效成分之一是GLT[3-5]。本文旨在觀察GLT對(duì)AD大鼠組織細(xì)胞凋亡的影響，從而研究該藥對(duì)AD有無防治功能，并探討其可能的作用機(jī)制。建立理想的模型是研究的重要環(huán)節(jié)，本研究采用自然衰老認(rèn)知障礙模型，更符合衰老因素在AD發(fā)病過程中的重要作用[6]。AD的病理學(xué)改變有老年斑(senile plaque, SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)、大量神經(jīng)元丟失及顆?？张葑冃缘取Ｔ谀承┥窠?jīng)變性疾病中， 一個(gè)明顯的病理特征是神經(jīng)元的缺失，其中細(xì)胞凋亡起了主要作用，特別是在AD中[7]。本研究結(jié)果表明：自然衰老模型大鼠形態(tài)學(xué)方面，腦組織切片HE染色可見神經(jīng)細(xì)胞腫脹、壞死，胞漿空泡樣變性等改變；在神經(jīng)生化學(xué)方面，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)增多。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的AD模型組織病理學(xué)以及神經(jīng)生化學(xué)變化方面模擬出與AD相似的特征。自然衰老模型大鼠用GLT灌胃2個(gè)月后，腦神經(jīng)元壞死減少，細(xì)胞凋亡數(shù)減少，表明GLT能夠保護(hù)AD自然衰老模型大鼠腦組織，減輕大腦神經(jīng)損傷。

注：A為正常對(duì)照組，B為模型組，C為溶媒對(duì)照組，D、E及F為GLT低、中及高劑量組，G為陽(yáng)性對(duì)照組圖1　各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞(HE,×400)Fig.1　The pathology examination of hippocampus in rats

注：A為正常對(duì)照組，B為模型組，C為溶媒對(duì)照組，D、E及F為GLT低、中及高劑量組，G為陽(yáng)性對(duì)照組圖2　各組大鼠海馬細(xì)胞凋亡情況 (TUNEL,×400)Fig.2　Apoptosis of the hippocampus cells of aging rats

細(xì)胞凋亡是AD重要的神經(jīng)病理學(xué)特性。大量的研究表明，在AD發(fā)病過程中，細(xì)胞凋亡起主導(dǎo)作用,AD患者腦內(nèi)細(xì)胞丟失的機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)[8]。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮和碎片的形成，但這種現(xiàn)象出現(xiàn)晚且時(shí)間短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點(diǎn)數(shù)

目相同的3’-OH末端，通過TUNEL法可以檢測(cè)凋亡細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，AD模型動(dòng)物組腦組織HE染色顯示神經(jīng)元變性、壞死及丟失較正常對(duì)照組顯著增多，予GLT治療后，GLT治療組動(dòng)物腦組織神經(jīng)元變性、壞死及丟失明顯減少，與模型組有顯著性差異；與正常對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物腦組織TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加，GLT治療后，TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少；提示GLT能減少AD神經(jīng)元細(xì)胞損傷、壞死、丟失，抑制細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明GLT對(duì)AD有防治作用，其可能的作用機(jī)制與減少腦神經(jīng)元壞死、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

[1] 吳文寶,孔慶宏,闞祥緒，等.凋亡通路及caspases 在阿爾茨海默病中作為治療靶點(diǎn)的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2015(11):1496-1501.

[2] 盛樹力.老年性癡呆：從分子生物學(xué)到臨床診治[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社， 1998:351-352.

[3] 陳慧，楊海龍，劉高強(qiáng). 靈芝三萜的生物合成和發(fā)酵調(diào)控[J].菌物學(xué)報(bào)， 2015(1): 1-9.

[4] 林志彬.中西醫(yī)結(jié)合研究詮釋靈芝的扶正固本功效[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010 (6):1-6.

[5] 李欽艷，陳逸湘，鐘瑩瑩. 靈芝主要活性成分及其功能的研究進(jìn)展(綜述)[J].食藥用菌， 2015(2):86-91.

[6] 趙保勝，徐暾海．老年性癡呆疾病模型的建立[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011(6):274．

[7] 李建，王芳，周軍，等.丹參酮IIA對(duì)AD大鼠腦組織p53，pp53 表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2015(11):1210-1216.

[8] 侯雪芹,張磊,林雅萍,等.4種阿爾茨海默病動(dòng)物模型行為學(xué)改變及凋亡機(jī)制的比較[J]．中國(guó)老年學(xué)雜志, 2015(12):3185-3187.

(2016-01-12收稿，2016-04-28修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙毅

Effects of Ganoderma Lucidum Triterpenoids on Apoptosis of Brain Tissue of Alzheimer Disease Model Rat

ZHANG Yue， LUO Jun， HUANG Nenghui， ZHANG Xiaoyi

(DepartmentofPharmachology，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effects and mechanism of Ganoderma lucidum Triterpenoids (GLT) in Alzheimer Disease model rats. Methods: 60 natural aging rats were randomly divided into 6 groups, GLT low dose group, GLT middle dose group, GLT high dose group, model group, solvent group (edible oil) and positive group (JNJN). 10 rats of 5 months of age were used as control group. Then the intragastric administration was used. After being treated with GLT for 60 days, brain tissues were stained with Hematoxylin-eosin to observed, and the numbers of apoptotic neuron in hippocampus were tested by TUNEL. Results: Neurons were damaged in the brain, cell display were extremely messed with irregular size and shapes and the number of cells decreased in model rats. Hippocampus apoptotic positive cells increased significantly, large amount of dark brown particles were found in neuro cell nucleus; GLT high dose group showed no significant neuro cell apoptosis features; comparing with model group, middle and high dose group showed decreased hippocampus apoptotic positive cells(P<0.05), light brown particles were found in neuro cell nucleus. Conclusion: GLT can decrease necrosis of neuron and inhibit apoptosis，it maybe the mechanisms of protecting AD model animals.

[Key words]hippocampus; Alzheimer disease; natural aging; apoptosis; Ganoderma lucidum Triterpenoids

*[基金項(xiàng)目]教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(V200801); 貴州省科技攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合2004NGY031); 貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金(2005293)

[中圖分類號(hào)]R285.5； R749.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0532-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.009

**通信作者 E-mail:luojun@ gmc.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2141.052.html