肖　燕， 吳　強(qiáng)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 內(nèi)科學(xué)教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 附屬人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽　550002)

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下調(diào)干擾素誘導(dǎo)蛋白16對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響*

肖燕1， 吳強(qiáng)2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 內(nèi)科學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 附屬人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽550002)

[摘要]目的： 探討下調(diào)干擾素誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞(HAAFs)凋亡的影響及機(jī)制。方法： 在HAAFs中轉(zhuǎn)染IFI16小干擾RNA(siRNA)和Control siRNA，分別作為IFI16基因沉默組(Ⅰ組)、陰性對(duì)照組(C組)，未經(jīng)任何干預(yù)的HAAFs作為空白組(N組)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，Western blot檢測(cè)IFI16、活化凋亡蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved PARP)蛋白表達(dá)。結(jié)果： 與C組和N組相比，Ⅰ組中IFI16蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)，伴隨著Cleaved PARP蛋白表達(dá)減少。結(jié)論： 下調(diào)IFI16表達(dá)可抑制HAAFs細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Cleaved PARP蛋白有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]干擾素誘導(dǎo)蛋白； 成纖維細(xì)胞； 細(xì)胞； 主動(dòng)脈； RNA，小干擾； 凋亡

血管外膜成纖維細(xì)胞(vascular adventital fibroblast，VAF)的增殖與遷移廣泛參與動(dòng)脈粥樣硬化等血管增殖性疾病的發(fā)生、發(fā)展[1]。人干擾素誘導(dǎo)蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)是干擾素誘導(dǎo)蛋白p200家族成員之一，具有抗增殖作用[2]。既往研究示在人腦血管成纖維細(xì)胞(human brain vascular adventitial fibroblasts,HBVAFs)中，干擾素α能誘導(dǎo)IFI16的表達(dá)并抑制HBVAFs的生長(zhǎng)，而通過IFI16 siRNA轉(zhuǎn)染沉默IFI16能促進(jìn)HBVAFs生長(zhǎng)[3]。在原代內(nèi)皮細(xì)胞中，IFI16能通過半胱氨酸蛋白酶-2(caspase-2)和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)途徑啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡[4]，而且caspase-3能通過剪切聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)蛋白[5]，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。但I(xiàn)FI16對(duì)HAAFs凋亡的影響尚未見報(bào)道。因此本研究進(jìn)一步通過IFI16 siRNA技術(shù)，抑制IFI16表達(dá)，觀察其對(duì)HAAFs凋亡的影響，探討其機(jī)制是否部分與下調(diào)Cleaved-PARP蛋白有關(guān)，對(duì)防治血管增殖性疾病具有重要的臨床意義。

1材料與方法

1.1材料

原代HAAFs(6120)、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(2301)、胎牛血清(0010)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(2352)、青霉素/鏈霉素溶液(0503)購(gòu)自Sciencell公司，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(04476093001)購(gòu)自Roche公司，IFI16 siRNA(sc-35633)、Control siRNA(sc-37007)Control siRNA(FITC-conjugated) (sc-36869)及IFI16抗體(sc-8023)購(gòu)自Santa Cruz公司，Cleaved PARP(#9541)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，GAPDH抗體(sc-25778)購(gòu)自北京中杉金橋，Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I(559763)購(gòu)自BD生物科學(xué)。

1.2方法

1.2.1分組取3～5 代HAAFs細(xì)胞分為3 組，在HAAFs中轉(zhuǎn)染IFI16小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和Control siRNA，分別作為IFI16基因沉默組(I組)、陰性對(duì)照組(C組)，未經(jīng)任何干預(yù)的HAAFs作為空白組(N組)。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent說明書操作，在六孔板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪板，為1.5×105個(gè)/孔鋪板，用不含雙抗的成纖維完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時(shí)，分別進(jìn)行IFI16 siRNA、Control siRNA的轉(zhuǎn)染。添加siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物干預(yù)6 h后，換不含雙抗的成纖維完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，使用Control siRNA(FITC-conjugated)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，大約在80%～90%，每組3 復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3IFI16、活化凋亡蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved PARP)蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)IFI16、Cleaved PARP蛋白表達(dá)。按細(xì)胞裂解液(RIPA)說明書提取細(xì)胞蛋白，應(yīng)用Protein A280檢測(cè)蛋白濃度。加人SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min變性。每孔上樣80 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗工作液(IFIl6抗體、Cleaved PARP抗體、GAPDH抗體稀釋度分別為1∶200、1∶1 000、1∶500；置4 ℃冷庫(kù)搖床過夜；室溫下孵育稀釋的二抗1 h；ECL化學(xué)發(fā)光。ImageJ軟件分析IFI16、Cleaved PARP與內(nèi)參條帶的吸光度值之比。

1.2.4HAAFs凋亡率按Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I說明書操作，用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞，離心，800 r/min，5 min，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，離心，800 r/min，5 min(第二次用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞時(shí)，放入1.5 mL的EP管中離心)；用1×Binding Buffer 100 μL沿管壁加入于1.5 mL EP管中，輕彈管壁，重懸細(xì)胞(配置1 mL的1×Binding Buffer：900 μL的PBS加入100 μL的10×Annexin V Binding Buffer)；每管細(xì)胞中加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-ADD；常溫下，避光孵育15 min；每管細(xì)胞中加入400 μL的1×Binding Buffer，在1 h內(nèi)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)；采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。在細(xì)胞凋亡分布圖中，Q2象限代表晚期凋亡及壞死細(xì)胞，Q3象限代表早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率(%)=Q2+Q3；Q1象限是壞死細(xì)胞，Q4象限是正常細(xì)胞。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1HAAFs的凋亡率

N組、C組和Ⅰ組HAAFs凋亡率為(6.49±1.10)%、(7.42±1.51)%和(3.33±0.41)%，與C組、N組比較，Ⅰ組HAAFs凋亡率較低(P<0.05)。見圖1。

2.2IFI16、Cleaved PARP蛋白表達(dá)

與C組和N組比較，Ⅰ組IFI16蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，同時(shí)Cleaved PARP蛋白表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

注：Q2象限代表晚期凋亡及壞死細(xì)胞，Q3象限代表早期凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞比例(%)=Q2+Q3；Q1象限是壞死細(xì)胞，Q4象限是正常細(xì)胞圖1　HAAFs的凋亡情況Fig.1　Apoptosis of HAAFs of 3 groups

注：(1)與C組比較，P<0.05；(2)與N組比較，P<0.05圖2　IFI16、Cleaved PARP蛋白表達(dá)Fig.2　Protein expression of IFI16 and Cleaved PARP

3討論

血管壁主要由內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell,VEC)、平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)以及VAF和細(xì)胞外基質(zhì)組成。既往研究證實(shí)，平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移在血管重構(gòu)中扮演者重要角色，而VAF僅起支持和營(yíng)養(yǎng)作用，但近幾年研究顯示VAF在血管重構(gòu)過程中也發(fā)揮著重要作用[6-8]。因此以VAF作為有效干預(yù)的靶點(diǎn)，對(duì)防治血管增殖性疾病有重要意義。

人IFI16是p200家族人源蛋白成員之一，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、分化及凋亡[2-3]。Xin等發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)正常人前列腺上皮細(xì)胞時(shí)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入衰老過程時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性IFI16表達(dá)量是之前的4倍，但是在3種前列腺癌細(xì)胞株中，IFI16呈表達(dá)缺失或者異位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)狀態(tài)。然而在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3中，過表達(dá)IFI16能抑制其集落的形成，并產(chǎn)生了細(xì)胞衰老相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化或者病理生理的改變，如可見衰老樣形態(tài)的細(xì)胞增多，可見衰老有關(guān)的β-半乳糖苷酶的增多及抑制細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，使S細(xì)胞比率降低[9]。說明IFI16能調(diào)控細(xì)胞的衰老。本課題組前期研究也表明IFN-α能誘導(dǎo)VEC中IFI16的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而通過IFI16 siRNA下調(diào)IFI16表達(dá)可抑制VEC凋亡[10]。因此，在HAAFs中，本研究通過siRNA技術(shù)下調(diào)IFI16蛋白的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，下調(diào)IFI16的表達(dá)，能減少HAAFs細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的、細(xì)胞主動(dòng)性死亡方式，在個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育、衰老過程中發(fā)揮中重要作用。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，能被細(xì)胞表面死亡受體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，引發(fā)“瀑布式”蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。Caspase-3是Caspase家族中的成員之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，活化后的Caspase-3能裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。PARP是一種存在于許多真核細(xì)胞中的DNA修復(fù)酶。當(dāng)DNA損傷時(shí)能激活PARP，并介導(dǎo)DNA的修復(fù)，然而其又是Caspase-3切割底物[5]。在各種理化因子的刺激作用下，細(xì)胞中的PARP能被活化的Caspase-3剪切成Cleaved-PARP，從而失去DNA修復(fù)功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。本研究顯示，下調(diào)IFI16的表達(dá)，能抑制Cleaved PARP蛋白的表達(dá)，并減少HAAFs細(xì)胞凋亡。說明在HAAFs細(xì)胞中，沉默IFI16蛋白可能通過抑制Caspase-3的激活，下調(diào)Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，通過IFI16 siRNA技術(shù)，下調(diào)IFI16蛋白的表達(dá)，能抑制HAAFs細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能部分與下調(diào)Cleaved PARP蛋白有關(guān)。

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(2016-01-06收稿，2016-04-28修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅

Downregulating Effect of IFI16 Expression Downregulating on Human Aortic Adventitial Fibroblasts Apoptosis

XIAO Yan1, WU Qiang2

(1.DepartmentofInternalMedicine,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincePeople'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect and mechanism of silencing interferon-inducible protein 16 (IFI16) on the apoptosis of human aortic adventitial fibroblasts (HAAFs). Methods: The specific small interference RNA(siRNA) and Control siRNA of IFI16 were transfected into HAAFs in vitro instantaneously. HAAFs were divided into three groups, IFI16 siRNA transfection group (I group), negative control group (C group), untreated HAAFs as blank group (N group).Then cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein levels of IFI16, Cleaved PARP were measured by Western Blot. Results: Comparing with group C and N, the protein expression levels and IFI16 were decreased in group I, the cell apoptosis was downregulated(P<0.05), accompanied with decrease of protein expression of Cleaved PARP. Conclusion: Downregulating of IFI16 expression can inhibit HAAFs cell apoptosis, which may be partially related to the downregulating of Cleaved PARP expression.

[Key words]interferon-inducible protein; fibroblasts; cells; aorta; RNA,small interfering; apoptosis

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260030)； 貴州省科學(xué)技術(shù)廳，貴州省人民醫(yī)院科技聯(lián)合基金項(xiàng)目[黔科合LH字(2015)7159號(hào)]

[中圖分類號(hào)]R541

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0511-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.004

**通信作者 E-mail:gzgywq@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2111.038.html