肖　燕， 吳　強(qiáng)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 內(nèi)科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng)　550002)

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沉默干擾素誘導(dǎo)蛋白16對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響*

肖燕1， 吳強(qiáng)2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 內(nèi)科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng)550002)

[摘要]目的： 探討沉默干擾素誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)表達(dá)對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞(HAAFs)凋亡的影響及其部分機(jī)制。方法： 應(yīng)用IFI16小干擾RAN(siRNA)、Control siRNA轉(zhuǎn)染HAAFs分別IFI16基因沉默組(IFI16-siRNA組)、陰性對(duì)照組(Control-siRNA組)，未經(jīng)干預(yù)的HAAFs作為空白組；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，應(yīng)用Western blot檢測(cè)IFI16、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)。結(jié)果： 與Control-siRNA組或空白組相比，IFI16-siRNA組的細(xì)胞凋亡率下降，伴隨著IFI16蛋白表達(dá)減少，p-ERK1/2水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 沉默IFI16表達(dá)可減少HAAFs細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能部分與ERK信號(hào)通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]干擾素誘導(dǎo)蛋白； 血管外膜成纖維細(xì)胞； 凋亡

血管外膜成纖維細(xì)胞(vascular adventitial fibroblast，VAF)增殖和凋亡的失衡是血管重構(gòu)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。血管重構(gòu)是高血壓等血管增殖性疾病的主要病理生理特點(diǎn)[1-2]。人干擾素誘導(dǎo)蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)是由p200家族中人源蛋白基因IFI16編碼，在細(xì)胞生長(zhǎng)中起著負(fù)性調(diào)控作用，對(duì)細(xì)胞的凋亡起促進(jìn)作用[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IFI16在人腦血管外膜成纖維細(xì)胞(human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)存在基礎(chǔ)表達(dá)，通過(guò)下調(diào)IFI16表達(dá)能促進(jìn)HBVAFs增殖，提示HBVAFs增殖的調(diào)控可能部分與IFI16表達(dá)有關(guān)[4]。但I(xiàn)FI16對(duì)HAAFs凋亡的影響尚未見報(bào)道。本研究進(jìn)一步通過(guò)IFI16小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染使IFI16基因沉默從而抑制IFI16表達(dá)，觀察其對(duì)HAAFs凋亡的影響，探討其可能的機(jī)制，為治療血管疾病提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

原代HAAFs(6120)、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(2301)、胎牛血清(0010)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(2352)、青霉素/鏈霉素溶液(0503)購(gòu)自Sciencell公司；X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent購(gòu)自Roche公司；IFI16 siRNA(sc-35633)、Control siRNA(sc-37007)、Control siRNA(FITC-conjugated) (sc-36869)及IFI16抗體(sc-8023)購(gòu)自Santa Cruz公司；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)抗體(ab17942)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗體(ab47339)購(gòu)自Abcam公司；GAPDH抗體(sc-25778)購(gòu)自北京中杉金橋；Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I(559763)購(gòu)自BD生物科學(xué)。

1.2方法

1.2.1人主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞(HAAFs)的培養(yǎng)和分組HAAFs的培養(yǎng)按HAAFs說(shuō)明書的方法進(jìn)行培養(yǎng)，取3～5 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3 組，為IFI16基因沉默組(IFI16-siRNA組)和陰性對(duì)照組(Control-siRNA組)以及未經(jīng)干預(yù)的HAAFs組(空白組)。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染在六孔板中轉(zhuǎn)染，取生長(zhǎng)狀態(tài)好的HAAFs，以1.5×105個(gè)/孔鋪板，用不含雙抗的成纖維完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，第2天待細(xì)胞密度達(dá)30 %～50 %時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent說(shuō)明書操作，添加siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物干預(yù)6 h后，換不含雙抗的成纖維完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，使用Control siRNA(FITC-conjugated)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，大約在80 %～90 %之間。每組3 復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3IFI16、ERK1/2與p-ERK1/2蛋白測(cè)定按細(xì)胞裂解液(RIPA)說(shuō)明書提取細(xì)胞蛋白。應(yīng)用Protein A280檢測(cè)蛋白濃度。加人SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min變性。每孔上樣80 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶至PVDF膜。5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入一抗工作液(IFIl6抗體、ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體、GAPDH稀釋度分別為1∶200、1∶1 000、1∶1 000、1∶500)，置4 ℃冰箱過(guò)夜，TBST洗膜，室溫下孵育稀釋的二抗1 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光。ImageJ軟件分析IFI16與內(nèi)參條帶、p-ERK1/2與ERK1/2的吸光度值之比。

1.2.4HAAFs的凋亡按Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I說(shuō)明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HAAFs的凋亡情況 ，采用細(xì)胞凋亡分布圖，Q2象限代表晚期凋亡及壞死細(xì)胞，Q3象限表早期凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞比例(%)=Q2+Q3。Q1象限是壞死細(xì)胞，Q4象限是正常細(xì)胞。采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1HAAFs凋亡率

細(xì)胞凋亡包括早期凋亡和晚期凋亡。與Control-siRNA組和空白組比較，IFI16-siRNA組的細(xì)胞凋亡率減少(P<0.05),見圖1。以上各指標(biāo)在Control-siRNA組和空白組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2IFI16、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)

與Control-siRNA組和空白組比較，IFI16-siRNA組IFI16蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，同時(shí)p-ERK1/2蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)，見圖2。以上指標(biāo)在Control-siRNA組和空白組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

VAF是血管外膜的主要細(xì)胞，在血管重構(gòu)中扮演者重要角色，有效地抑制VAF的增殖、遷移以及表型轉(zhuǎn)化等對(duì)防治血管增殖性疾病有重要意義[1]。

注：A為細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果，(1)與Control-siRNA組及空白組比較，P<0.05；B為細(xì)胞凋亡分布情況，Q2象限代表晚期凋亡及壞死細(xì)胞，Q3象限代表早期凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞比例(%)=Q2+Q3；Q1象限是壞死細(xì)胞，Q4象限是正常細(xì)胞圖1　沉默IFI16表達(dá)對(duì)HAAFs凋亡的影響Fig.1　Effect of inhibition of IFI16 expression on apoptosis of HAAFs

注：A為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，B為蛋白電泳結(jié)果。(1)與Control-siRNA組及空白組比較，P<0.05圖2　IFI16、p-ERK1/2及 ERK1/2蛋白的表達(dá)Fig.2　Protein expression of IFI16, p-ERK1/2 and ERK1/2

IFI16在多種上皮細(xì)胞，消化道，泌尿生殖道如卵巢、前列腺、乳腺和乳管表達(dá)，并發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、衰老以及細(xì)胞分化等廣泛的生物學(xué)功能[5]。在骨肉瘤和軟骨肉瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)IFI16能抑制細(xì)胞增殖[6]。在前列腺癌細(xì)胞核過(guò)表達(dá)IFI16表達(dá)能抑制腫瘤增殖，而異位表達(dá)IFI16于細(xì)胞質(zhì)則促進(jìn)癌細(xì)胞衰老[7]。在乳腺癌細(xì)胞中缺失或減少的IFI16水平是導(dǎo)致腫瘤抑制因子p53活性降低，p53介導(dǎo)的凋亡失調(diào)，促使腫瘤發(fā)生的原因之一[8]。在衰老的前列腺上皮細(xì)胞和老年人成纖維細(xì)胞IFI16表達(dá)增加，且在衰老的成纖維細(xì)胞沉默IFI16后細(xì)胞表現(xiàn)出增殖能力[7-8]。本研究結(jié)果表明，在HAAFs中沉默IFI16能抑制細(xì)胞凋亡。

ERK1/2由相對(duì)分子量分別為44 kD和42 kD的ERKl和ERK2組成，能被各種刺激因子磷酸化而激活，并通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及分化等生物學(xué)功能。激活的ERK1/2能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子c-myc和Sp1，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子c-myc和Sp1與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動(dòng)子特異性結(jié)合，增加轉(zhuǎn)錄活性，抑制細(xì)胞凋亡[9-10]。在腫瘤細(xì)胞中，IFI16蛋白能通過(guò)c-myc的介導(dǎo)抑制hTERT的轉(zhuǎn)錄[11]。在正常人細(xì)胞中抑制內(nèi)源性的IFI16表達(dá)能增加hTERT的轉(zhuǎn)錄[11]。細(xì)胞凋亡受抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的調(diào)控，其中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 (B-cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)具有抗凋亡作用，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Assaciated X protein，Bax)和Bcl-2相關(guān)凋亡促進(jìn)因子(Bcl-2 associated death promoter，Bad)具有促凋亡作用，而細(xì)胞中Bcl-2/Bax的比值決定細(xì)胞是否凋亡。ERK1/2能磷酸化Bad蛋白，從而抑制Bcl-2/Bax異二聚體中的Bax游離，導(dǎo)致Bax同二聚體的形成減少，抑制細(xì)胞凋亡[12]。本研究顯示，抑制IFI16的表達(dá)，伴隨著p-ERK1/2蛋白的上調(diào)，HAAFs細(xì)胞凋亡的減少。

綜上所述，通過(guò)IFI16小干擾RNA(siRNA)技術(shù)，能抑制IFI16蛋白表達(dá)，下調(diào)HAAFs細(xì)胞的凋亡，伴隨著p-ERK1/2蛋白表達(dá)量增多，提示IFI16能調(diào)控HAAFs細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能部分與ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)，但I(xiàn)FI16是否通過(guò)ERK1/2/c-myc/hTERT以及ERK1/2/Bad/Bax信號(hào)通路調(diào)節(jié)HAAFs細(xì)胞凋亡，仍需進(jìn)一步研究。

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(2016-02-25收稿，2016-04-28修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅

Reducing Effect of IFI16 Expression on Human Aortic Adventitial Fibroblasts Apoptosis

XIAO Yan1, WU Qiang2

(1.DepartmentofInternalMedicine,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincePeople'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of silencing interferon-inducible protein 16(IFI16) expression on the apoptosis of human aortic adventitial fibroblasts(HAAFs). Methods: The specific small interference RNAs (siRNAs) of IFI16 and Control siRNA were transected into HAAFs in IFI16-siRNA group, negative control group and untreated blank group. Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein levels of IFI16, extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK1/2) were measured by Western Blot. Results: The protein expression levels of IFI16 were decreased in the HAAFs, the cell apoptosis was downregulated, the protein expression levels of p-ERK1/2 were increased, differences were statistic significant (P<0.05). Conclusion: Inhibition of IFI16 expression can downregulate HAAFs cell apoptosis, which may be related to the ERK signaling pathway.

[Key words]interferon-inducible protein; human aortic adventitial fibroblasts; apoptosis

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260030)； 貴州省科學(xué)技術(shù)廳-貴州省人民醫(yī)院科技聯(lián)合基金項(xiàng)目[黔科合LH字(2015)7159號(hào)]

[中圖分類號(hào)]R541

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0507-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.003

**通信作者 E-mail:gzgywq@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2037.020.html