龍向淑， 黃　晶， 吳　強(qiáng)**， 田茂波， 宋　方， 肖　燕

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng)　550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 內(nèi)科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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·專題研究·

干擾素誘導(dǎo)蛋白204抑制大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞增殖*

龍向淑1， 黃晶1， 吳強(qiáng)1**， 田茂波1， 宋方1， 肖燕2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng)550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 內(nèi)科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 探討干擾素誘導(dǎo)蛋白204(p204)對(duì)大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞(VAFs)增殖的影響及可能機(jī)制。方法： 將大鼠VAFs分為空白對(duì)照組(N組)、非特異性小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染組(control組)、IFN-α干預(yù)組(IFN-α組)及Ifi204 siRNA轉(zhuǎn)染組(Ifi204 siRNA組)，給予相應(yīng)處理；應(yīng)用Real Time qRT-PCR法檢測(cè)p204 mRNA表達(dá)， MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期， Western blot 檢測(cè)p204、Ras蛋白表達(dá)及Raf與Erk磷酸化水平。結(jié)果： 與N組比較，IFN-α組p204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換下調(diào)(P<0.05)，伴Ras蛋白表達(dá)減少，Raf及Erk磷酸化水平下降(P<0.05)；Ifi204 siRNA組p204 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞活力增高，G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多(P<0.05)，Ras蛋白表達(dá)增多，Raf及Erk磷酸化水平升高(P<0.05)；而control組上述指標(biāo)與N組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： p204表達(dá)可抑制大鼠VAFs增殖，Ras信號(hào)通路可能參與p204對(duì)VAFs增殖的調(diào)控。

[關(guān)鍵詞]干擾素誘導(dǎo)蛋白204； 成纖維細(xì)胞； 增殖； Ras信號(hào)通路； 大鼠，Sprague-Dawley

血管外膜成纖維細(xì)胞(vascular adventitial fibroblasts, VAFs)是血管外膜最主要的細(xì)胞成分。既往認(rèn)為，在物理?yè)p傷、炎癥反應(yīng)及化學(xué)刺激等因素誘發(fā)的血管重塑過(guò)程中，VAFs僅對(duì)血管壁起著營(yíng)養(yǎng)和支持作用；近期研究顯示，當(dāng)血管內(nèi)膜損傷病變發(fā)生時(shí)，VAFs首先被激活，活化的VAFs增殖、遷移和合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強(qiáng)，同時(shí)分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)增殖，共同參與動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后再狹窄及高血壓等血管重塑性疾病(vascular remodeling disease，VRD)的發(fā)生、發(fā)展[1-4]。干擾素(interferon，IFN)誘導(dǎo)蛋白204(interferon inducible protein 204，p204)是IFN誘導(dǎo)蛋白200(interferon inducible protein 200，p200)家族的鼠類蛋白成員。p204或其同源蛋白IFN誘導(dǎo)蛋白16(interferon inducible protein 16, IFI16)對(duì)血管壁細(xì)胞生物學(xué)功能影響的前期研究顯示p204和IFI16分別表達(dá)于大鼠和人VAFs并通過(guò)影響P53/P21表達(dá)而抑制VAFs增殖和遷移[5-7]；p204在大鼠VSMCs表達(dá)并可能通過(guò)抑制Ras信號(hào)通路激活而影響VSMCs增殖，但Ras信號(hào)通路是否參與p204對(duì)大鼠VAFs增殖的調(diào)控尚未明了。本研究旨在探討p204對(duì)大鼠VAFs增殖及Ras信號(hào)通路的影響，為臨床防治VRD提供新思路。

1材料和方法

1.1材料

清潔級(jí)6周齡SD大鼠(雌性1只，雄性1只)，體質(zhì)量100～120 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。IFN-α購(gòu)自北京三元基因工程有限公司。DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Hyclone公司。即用型細(xì)胞免疫組化試劑盒和顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。非特異性小干擾RNA(small interferon RNA，siRNA)和p204抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；p204基因(Ifi204 )siRNA由寶生物工程(大連)有限公司合成，其序列為：F 5′-AGG CAA CCA AAG UUA GUG UTG-3′，R5′-ACA CUA ACA UUG GUU GCC UAG-3′。LipofectamineTM 2000 Reagent 購(gòu)自Invitrogen公司。四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和Tubulin抗體購(gòu)自碧云天公司。TRNzol 總RNA提取試劑購(gòu)自北京天根公司；RT-PCR兩步法試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。PCR擴(kuò)增引物由寶生物工程有限公司合成(大連)。Vimentin、Ras、磷酸化Raf(p-Raf)及磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶44/42(p-Erk 44/42)抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1VAFs培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代主動(dòng)脈VAFs，經(jīng)傳代反復(fù)采用差速貼壁法去除VSMCs而純化VAFs。采用Vimentin抗體按細(xì)胞免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作鑒定VAFs。取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組(N組)、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組(Control組)、Ifi204 siRNA轉(zhuǎn)染組(Ifi204 siRNA組)和IFN-α干預(yù)組(IFN-α組)。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。Control組與Ifi204 siRNA組按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作分別同步轉(zhuǎn)染非特異性siRNA及Ifi204 siRNA干預(yù)6 h，IFN-α組用終濃度為2×106U /L的IFN-α干預(yù)6 h，N組予按時(shí)更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至48 h收集細(xì)胞。

1.2.2p204 mRNA的檢測(cè)Real Time qRT-PCR檢測(cè)p204 mRNA表達(dá)。收集各組細(xì)胞，按TRzol總RNA提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA，取總RNA 1 μg 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA產(chǎn)物3 μL進(jìn)行PCR循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，采用2﹣ΔΔCt法計(jì)算p204 mRNA相對(duì)含量。引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度,p204F 5′-TCA TGG TCC CAA ACA AGT GA-3′，R 5′-ACC CAT TGC ACC CAA AAT AA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度200 bp；β-actin F 5′-TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT G-3′，R 5′-TCA TCT TCT CGC GGT TGG C-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度103 bp。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s延長(zhǎng)，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.2.3p204、Ras蛋白表達(dá)及Raf與Erk磷酸化水平的檢測(cè)Western blot 檢測(cè)p204和Ras蛋白表達(dá)及Raf與Erk磷酸化水平。用細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，BCA法定量蛋白并按每組樣品60 μg/孔上樣，用10% SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，去除封閉液，加入1∶500稀釋的一抗， 4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，加入按1∶5 000稀釋的二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)，搖床孵育2 h(常溫)，收集二抗，TBST搖床漂洗3次。取ECL化學(xué)發(fā)光試劑覆蓋PVDF膜，X光膠片曝光、顯影及定影后掃描，用圖像軟件根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.4VAFs細(xì)胞活力檢測(cè)MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力。收集對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)3×103個(gè)/孔接種于96孔板，按上述分組進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用平板離心機(jī)離心沉淀細(xì)胞后吸盡上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置旋轉(zhuǎn)搖床上低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度A值。

1.2.5VAFs細(xì)胞周期檢測(cè)按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞周期。首先消化細(xì)胞，離心，1 000 r/min，5 min，棄舊的培養(yǎng)基，加入冰浴預(yù)冷的PBS 1 mL，重懸，再次離心；再加入冰上預(yù)冷的70 %乙醇1 mL，重懸并混勻，4 ℃固定24 h，離心，1 000 r/min，5 min，加入冰浴預(yù)冷的PBS 1 mL，重懸并離心；每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的樣品中加入500 μL碘化丙啶染色液，重懸并混勻，在37 ℃的水浴箱中，避光水浴30 min；然后用200鉬過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾各組細(xì)胞；用流式細(xì)胞儀進(jìn)行VAFs細(xì)胞周期的檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1p204 mRNA和蛋白表達(dá)

與N組比較，IFN-α組p204 mRNA和蛋白表達(dá)增多，Ifi204 siRNA組p204 mRNA和蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；而Control組與N組之間p204 mRNA和蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表1。

表1　各組VAFs p204 mRNA和

(1)與N組比較，P<0.05

2.2VAFs活力及細(xì)胞周期

與N組比較，IFN-α組的MTT吸光度A值降低(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(P<0.05)；Ifi204 siRNA組MTT吸光度A值增高(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多(P<0.05)；Control組MTT吸光度A值、G0/G1期細(xì)胞及S期細(xì)胞與 N組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠VAFs增殖情況

(1)與N組比較，P<0.05

2.3Ras蛋白表達(dá)和Raf及Erk磷酸化水平

與N組比較，IFN-α組Ras蛋白表達(dá)減少，Raf及Erk磷酸化水平降低(P<0.05)；Ifi204 siRNA組Ras蛋白表達(dá)增多，Raf及Erk磷酸化水平升高；而Control組上述指標(biāo)與N組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

3討論

各種理化因素及炎癥因子導(dǎo)致血管損傷后，血管外膜作為血管壁的第一“感知者”對(duì)損傷信號(hào)最先發(fā)生反應(yīng)[9]。相對(duì)于分泌因子較少的VSMCs，VAFs通過(guò)分泌大量的因子或蛋白如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecule，CAM)等來(lái)調(diào)節(jié)血管炎癥反應(yīng)。因此, 現(xiàn)在越來(lái)越多的研究集中在外膜對(duì)于VRD如動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后再狹窄及高血壓等的作用, 而VAFs作為外膜最主要的細(xì)胞成分在其中起著非常重要的作用。

(1)與N組比較，P<0.05圖1　Ras蛋白表達(dá)及Raf和Erk磷酸化水平(Western blot)Fig.1　Ras proteins and the phosphorylation levels of Raf and Erk

p204是p200家族的鼠類蛋白成員。所有p200家族蛋白在羧基端均含有一個(gè)或兩個(gè)部分重復(fù)及保守的與蛋白和(或)DNA的結(jié)合相關(guān)的HIN-200結(jié)構(gòu)域，據(jù)此結(jié)構(gòu)域部分氨基酸的差異分為A、B及C三型[10]。p204 HIN-200結(jié)構(gòu)域含A和B兩種類型，其A結(jié)構(gòu)域中含有與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, pRb)結(jié)合的IXCXE和LXCXE兩個(gè)序列，而B(niǎo)結(jié)構(gòu)域中僅包含LXCXE一個(gè)序列[10]。p204蛋白氨基酸序列含有多種蛋白激酶潛在的磷酸化位點(diǎn)如cAMP依賴性激酶、蛋白激酶C、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等[10-11]。基于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)p204具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化等功能[12]。前期研究表明，p204在VAFs存在基礎(chǔ)表達(dá)，且p204過(guò)表達(dá)可抑制VAF增殖、遷移并促進(jìn)其凋亡，在p204表達(dá)上調(diào)的同時(shí)伴隨p53/p21表達(dá)增多，提示p204對(duì)VAFs的上述效應(yīng)可能與p204促進(jìn)p53/p21表達(dá)相關(guān)[5-6]。本研究顯示，IFN作用于VAFs可致p204 mRNA和蛋白表達(dá)增多，VAFs增殖活性下降；針對(duì)p204基因保守序列設(shè)計(jì)的siRNA轉(zhuǎn)染VAFs后，p204 mRNA和蛋白表達(dá)減少，VAFs增殖活性升高，提示VAFs p204表達(dá)可能存在IFN誘導(dǎo)性，p204 siRNA可分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平有效沉默p204表達(dá)，p204具有抑制VAFs增殖的作用。然而，p204除通過(guò)影響p53/p21表達(dá)調(diào)控VAFs增殖外，是否還有其它機(jī)制參與尚屬未知。

Ras蛋白是分子量約為21 kD的單體GTP酶，參與典型的G蛋白激活與失活循環(huán)。Ras蛋白能被不同上游信號(hào)激活而調(diào)控多種信號(hào)通路，其中Ras/Raf/MEK/Erk是眾多信號(hào)通路中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞間功能同步等作用的通路之一。激活型Ras使下游信號(hào)蛋白逐級(jí)磷酸化而激活，最終活化Erk，活化的Erk轉(zhuǎn)至細(xì)胞核激活不同轉(zhuǎn)錄因子而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。血管損傷后，包括Ras在內(nèi)的一些原癌基因表達(dá)增多，促進(jìn)血管壁主要實(shí)質(zhì)細(xì)胞VAFs、VSMCs及VECs增殖而導(dǎo)致血管重構(gòu)。因此，研究如何中斷Ras等介導(dǎo)的信號(hào)傳遞過(guò)程對(duì)VRD的防治具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，IFN可誘導(dǎo)p204表達(dá)增多，伴隨Ras蛋白表達(dá)減少，其下游信號(hào)蛋白R(shí)af、Erk磷酸化水平下降；反之，p204 基因siRNA沉默p204表達(dá)后，Ras蛋白表達(dá)增多，其下游信號(hào)蛋白R(shí)af和Erk磷酸化水平隨之升高，提示Ras信號(hào)通路參與了p204 對(duì)VAFs增殖的調(diào)控，p204可能具有抑制Ras信號(hào)通路激活的作用。

綜上所述，p204表達(dá)可抑制大鼠VAFs增殖，Ras/Raf/MEK/Erk信號(hào)通路可能參與了p204對(duì)VAFs增殖的調(diào)控。

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(2016-02-15收稿，2016-04-27修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Interferon-α Inducible Protein 204 Inhibition of Proliferation of Vascular Adventitial Fibroblasts in Rats

LONG Xiangshu1, HUANG Jing1,WU Qiang1, TIAN Maobo1, SONG Fang1, XIAO Yan2

(1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincePeople'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550002,Guizhou,China; 2.DepartmentofInternalMedicine,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the effect of interferon inducible protein204(p204) expression on rats' vascular adventitial fibroblasts(VAF) proliferation and possible mechanism. Methods: The cultured VAFs were divided into four groups: blank comparison group(N group), nonspecific siRNA transfection group(Control group), IFN-α intervention group(IFN-α group, treated with transfection of IFN-α) and Ifi204 siRNA transfection group(Ifi204 siRNA group, treated with transfection of p204 gene(Ifi204) siRNA ). Expression of p204 mRNA was monitored by real time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(Real Time qRT-PCR). Cell vitality was detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) method. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. Proteins of 204 and Ras and the phosphorylation levels of Raf and Erk were examined by Western blot. Results： Compared with N group, in IFN-α intervention group, the expression of p204 mRNA and protein up-regulated(P<0.05), the cell vitality and the cell cycle of G1/S transition down-regulated(P<0.05), the expression of Ras protein and the phosphorylation levels of Raf and Erk decreased(P<0.05); Compared with N group, in Ifi204 siRNA transfection group, the expression of p204 mRNA and protein down-regulated(P<0.05), the cell vitality increased, cells of G0/G1 stage decreased and S stage increased(P<0.05), the expression of Ras protein and the phosphorylation levels of Raf and Erk increased(P<0.05); There were no statistically significant differences in above-mentioned indicators between Control group and N group(P>0.05). Conclusion： The expression of p204 can inhibit the proliferation of VAFs in rat, and Ras signaling pathway may participate in regulation of p204 on proliferation of VAFs.

[Key words]interferon inducible protein 204; fibroblasts; proliferation; Ras signaling pathway; rats,Sprague-Dawley

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260030)； 貴州省科技攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合LH 字(2014)7023號(hào)]

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0502-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.002

**通信作者 E-mail:gzgywq@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2102.030.html