查美琴，趙玉玲，李　疆*，朱　瑜，羅淑萍，胡　月

新疆枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析

查美琴1，趙玉玲2，李疆1*，朱瑜1，羅淑萍1，胡月1

(1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052;2.新疆精河縣枸杞管理中心, 新疆精河 833300)

摘要:利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對新疆枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行研究，為新疆枸杞種質(zhì)資源分類和雜交育種提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示：(1)篩選出的12對SRAP引物共擴(kuò)增出310個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)264個(gè)，多態(tài)性比率平均為84.61%，引物多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍為0.76～0.93，平均為0.83；觀測等位基因(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon信息指數(shù)(I)平均值分別為1.846 1、1.386 9、0.228 0和0.352 0。(2)聚類分析表明，供試材料間的遺傳相似系數(shù)為0.590 3～0.903 2，在遺傳相似性系數(shù)為0.70和0.76時(shí)，可將30份樣品分別分為2大類和5個(gè)亞類；主坐標(biāo)分析結(jié)果和聚類結(jié)果基本一致。研究表明，新疆枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富，且野生種與栽培品種 (系)間的遺傳差異較大，表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，而栽培品種(系)間的遺傳差異相對較小，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞:枸杞；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)；聚類分析；主坐標(biāo)分析；遺傳多樣性

枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)的一種多年生落葉灌木[1]。枸杞作為一種藥食同源植物，具有抗腫瘤、軟化血管、防衰老及增強(qiáng)免疫力等藥理作用[2]。全球枸杞屬植物約有80多種，多分布在南美洲南部和北美洲西南部，少數(shù)分布于歐亞大陸的溫帶[3]，中國野生自然分布的有7種和3變種，主要分布于西北和華北[4]，新疆作為中國枸杞主產(chǎn)區(qū)之一[5]，擁有的種質(zhì)資源十分豐富。因枸杞屬于常異花授粉植物，多數(shù)自交不親和，基因型高度雜合，種子繁育后代容易發(fā)生性狀分離，通過營養(yǎng)繁殖方式培育出的無性系新品種(系)在形態(tài)上極為接近[6]，加之基因組信息研究薄弱，使得遺傳信息缺乏，遺傳關(guān)系模糊不清[7]，優(yōu)良種質(zhì)的特性難以在品種(系)間雜交被有效遺傳利用[8]。因此，從DNA水平研究新疆枸杞種質(zhì)資源的遺傳多樣性，對枸杞種質(zhì)資源分類、有效利用及優(yōu)良品種選育具有重要意義。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)是Li等開發(fā)的一種針對外顯子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的新型分子標(biāo)記技術(shù)[9]，克服了RAPD、RFLP、AFLP等標(biāo)記技術(shù)的一些局限性，具有技術(shù)簡便、高效、重復(fù)性好、多態(tài)性明顯等優(yōu)點(diǎn)。目前已成功應(yīng)用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析、圖譜構(gòu)建、核心種質(zhì)庫的構(gòu)建、種質(zhì)鑒定等方面研究，如中國灌木辣椒[10]、不結(jié)球白菜[11]、山藥[12]、南瓜[13]等。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究主要側(cè)重于形態(tài)分類學(xué)[14]、染色體核型分析[15]、同工酶水平[16]等方面，后來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)成為枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究主要技術(shù)手段之一，已有基于PCR的RAPD[17]、ISSR[18]、SSR[19]、SRAP[20]等標(biāo)記技術(shù)的枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。傳統(tǒng)的枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究方法具有一定的局限性，分子標(biāo)記直接反映基因組DNA的遺傳變異信息，且該技術(shù)的種類日趨完善，檢測范圍日趨擴(kuò)大，但目前利用SRAP標(biāo)記技術(shù)針對新疆枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的分析鮮見報(bào)道,尤其在分子水平上的研究報(bào)道甚少。 本試驗(yàn)以新疆枸杞種質(zhì)資源圃栽培品種(系)和野生種共30份樣品為試材，擬采用SRAP標(biāo)記技術(shù)對其遺傳多樣性進(jìn)行分析，旨在從分子水平上確定新疆枸杞種質(zhì)間遺傳變異信息及親緣關(guān)系，為新疆枸杞種質(zhì)資源分類、保護(hù)和利用枸杞野生資源以及新品種選育提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試材料

該試驗(yàn)所用材料(表1)于2014年7月采自新疆精河縣枸杞管理中心枸杞種質(zhì)資源圃，共計(jì)30個(gè)樣品，采摘一年生枝條上的鮮嫩葉片置于寫好編號且放有變色硅膠的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，放室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　試驗(yàn)材料編號及名稱

表2　供試SRAP引物序列

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取與檢測采用改良CTAB法提取供試材料基因組DNA[21]，用核酸蛋白儀檢測DNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，EB染色后，凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄，用ddH2O將DNA濃度稀釋至50 ng/μL后分裝,保存-40 ℃冰箱中備用。

1.2.2引物篩選所用SRAP正反向引物參照Li等公布的引物序列(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成，SRAP正反向引物各12條，兩兩組合成144個(gè)引物組合，PCR反應(yīng)相關(guān)試劑10×Buffer(含Mg2+)、TaqDNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNA marker和ddH2O均購自天根生化科技(北京)有限公司。從供試材料中抽取形態(tài)性狀差異較大的枸杞DNA模板5個(gè)對144對SRAP引物進(jìn)行篩選，最終篩選出清晰易辨認(rèn)、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的SRAP引物用于所有DNA樣品擴(kuò)增。

1.2.3PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)在Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行。在25 μL SRAP-PCR反應(yīng)體系中，含10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，DNA模板(50 ng/μL)1 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL, 正反引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性1 min,35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min反應(yīng)5個(gè)循環(huán), 94 ℃變性1 min,50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min反應(yīng)35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL 6×Loading Buffer混勻后，在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，電極緩沖液為1×TBE，200 V恒電壓電泳約50 min，電泳結(jié)束后，銀染法染色顯影，在熒光燈上觀察分析條帶并照相記錄，試驗(yàn)設(shè)定3個(gè)重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)的處理與分析

對清晰且易于辨認(rèn)的譜帶根據(jù)分子標(biāo)記的遷移率及其有無，統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù)，按條帶有無賦值，同一位點(diǎn)有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立二元原始數(shù)字矩陣；利用PIC_CALC Version 0.6軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)值；運(yùn)用POPGENE1.32軟件計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性百分率(PPB)、觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)等遺傳多樣性參數(shù)；利用NTSYS-pc2.1e軟件計(jì)算不同枸杞種質(zhì)間的Jaccard相似性系數(shù)(GS)，按非加權(quán)成組配對算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析,通過Tree plot模塊生成親緣關(guān)系聚類圖，最后，根據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析及繪制三維空間圖和二維平面散點(diǎn)圖以檢驗(yàn)聚類結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1SRAP引物擴(kuò)增結(jié)果分析

M. DL1500；編號1～30同表1圖1　引物組合me4-em8對枸杞所有試材的SRAP擴(kuò)增No. 1-30 are the same as Table 1Fig.1　SRAP amplification of Lycium barbarum L. germplasm by primer combination me4-em8

Table 3　The statistics of genetic diversity of L. barbarum

2.2遺傳多樣性分析

利用POPGENE1.32軟件對30份枸杞樣品擴(kuò)增的310個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得數(shù)據(jù)表明：觀測等位基因(Na)介于1.592 6～2.000 0，平均為1.846 1；有效等位基因(Ne)介于1.205 6～1.528 5，平均為1.386 9；Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)介于0.134 0～0.305 5，平均為0.228 0；Shannon信息指數(shù)(I)介于0.224 5～0.457 8，平均為0.352 0。這些研究結(jié)果表明，新疆枸杞種質(zhì)資源遺傳差異較大，遺傳多樣性水平較高。

2.3遺傳相似性分析

利用NTsys-pc2.10e軟件計(jì)算SRAP引物產(chǎn)生的所有位點(diǎn)的遺傳相似系數(shù)(GS)，30份枸杞樣品兩兩間的遺傳相似系數(shù)介于0.590 3～0.903 2之間，平均(GS)值為0.736 1;遺傳相似系數(shù)最小的是‘野黑果枸杞’和‘寧杞5號’，相似系數(shù)為0.590 3，表明親緣關(guān)系最遠(yuǎn);遺傳相似系數(shù)最大的是‘1101’和‘1102’，為0.903 2，表明親緣關(guān)系最近。總體來說，30份枸杞樣品間遺傳相似系數(shù)較低，存在較高的遺傳差異。

2.4聚類分析

基于30份枸杞樣品間的遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法對30份枸杞樣品進(jìn)行聚類分析，獲得親緣關(guān)系聚類圖(圖2)，在遺傳相似性系數(shù)為0.70時(shí)，可將供試材料分成2大類。第Ⅰ大類包括野紅果枸杞、野黑果枸杞、野生雪青色果和野生黃果枸杞4個(gè)野生種，這說明4個(gè)野生種間遺傳差異小，親緣關(guān)系近，并以野生雪青色果和野生黃果枸杞之間的親緣關(guān)系最近。在相似系數(shù)為0.76時(shí)，第Ⅱ大類又可細(xì)分為5個(gè)亞類。首先，大麻葉枸杞一個(gè)品種作為第ⅰ亞類；第ⅱ亞類是‘寧杞1號’和‘寧杞5號’2個(gè)品種聚在一起；第ⅲ亞類是‘蒙杞1號’和‘白刺枸杞’2個(gè)品種被分為一類；第ⅳ亞類包括‘精杞3號’、‘精杞5號’、0901、1016、1017和‘寧杞7號’，其中的‘精杞3號’和‘精杞5號’、1016和1017分別表現(xiàn)出遺傳變異程度低、遺傳背景相近的親緣關(guān)系。第ⅴ亞類包括剩余的15個(gè)品種，其中，‘精杞1號’和‘精杞4號’、‘精杞8號’和1012、1407和‘寧菜1號’、1018和1021有較近的親緣關(guān)系，1101、1102和1103被分為一小類，說明它們遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳變異小，父本或母本相同。

遺傳相似性系數(shù)Genetic similarity coefficient 1～30材料編號同表1圖2　30份枸杞種質(zhì)的UPGMA聚類分析圖No.1-30 are the same materials as Table 1Fig.2　UPGMA dendrogram for 30 resources of L. barbarum L. based on SRAP data

2.5主坐標(biāo)分析

基于30份枸杞樣品間的遺傳相似性系數(shù)矩陣，利用NTSYS-pc2.10e軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析,建立三維空間圖(圖3，A)和平面散點(diǎn)圖(圖3，B)，結(jié)果表明，第1、第2 和第3主坐標(biāo)分別解釋了11.67%、10.11%和7.76%的樣本間相關(guān)性。將位置靠近者劃分為一組，30份枸杞樣品被分為2個(gè)大組(第Ⅰ、Ⅱ大組)，其中，4個(gè)野生種表現(xiàn)出較近親緣關(guān)系被單獨(dú)劃分為第Ⅰ大組，剩余的26份枸杞樣品作為第Ⅱ大組。根據(jù)供試材料在坐標(biāo)圖中的位置分布，第Ⅱ大組又可細(xì)分成Ⅴ個(gè)亞組?！畬庤?號’和1104組成第ⅰ亞組，‘精杞4號’、‘精杞8號’、‘寧杞5號’和‘白刺枸杞’4個(gè)樣品被聚為第ⅱ亞組，第ⅲ亞組包括‘精杞1號’、‘精杞3號’、‘精杞5號’、‘精杞7號’、0901、1012、1016、‘寧杞7號’和‘蒙杞1號’共9份栽培品種(系)；1017和1102聚在一起組成第ⅳ亞組；第ⅴ亞組包括1018、1021、1101、1103、1202、1407、‘寧菜1號’、‘柱筒枸杞’和‘大麻葉枸杞’共9份枸杞樣品。與UPGMA法聚類結(jié)果相比，2種分析方法在栽培品種(系)間親緣關(guān)系研究方面存在一點(diǎn)差異，如‘寧杞1號’和‘寧杞5號’在聚類圖中明顯被聚在一起，而主坐標(biāo)分析圖中卻沒有被劃分在一組，可見，栽培品種(系)基因型復(fù)雜。比較圖2和圖3可知，兩種方法的群組劃分趨向一致，但組群內(nèi)分析結(jié)果相似卻并不完全相同，但主坐標(biāo)分析能更直觀地反映出30份枸杞樣品的遺傳變異和親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

A．三維圖； B．平面圖；1～30材料編號表同1圖3　枸杞各試材的SRAP標(biāo)記主坐標(biāo)分析圖A.Three-dimensional graph；B.Planar graph；No.1-30 are the same materials as Table 1Fig.3　Principal coordinates analysis of Lycium bararum L. genotypes from SRAP markers

3討論

3.1新疆枸杞種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

DNA是生物的主要遺傳物質(zhì)，DNA水平上的遺傳變異大小直接體現(xiàn)該物種在特定環(huán)境中遺傳多樣性水平的高低，只有了解種質(zhì)資源DNA遺傳變異信息及親緣關(guān)系，才能有效并合理地利用物種的種質(zhì)資源和有目的地進(jìn)行品種選育中的親本選配，從而培育出優(yōu)良新品種[22]。本試驗(yàn)采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對30份枸杞樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出12對SRAP引物擴(kuò)增出264個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，占84.61%，這充分表明新疆枸杞種質(zhì)資源具有較為廣泛的遺傳基礎(chǔ)。安魏等在枸杞種質(zhì)資源的SRAP分析中多態(tài)性比率為76.68%[23]，尹躍在枸杞品種(系)分子鑒定及親緣關(guān)系分析中多態(tài)性比率達(dá)87.7%[24]，和本試驗(yàn)的PPB值相當(dāng)；多態(tài)信息含量(PIC)值大于0.5的標(biāo)志基因具有高度信息，本試驗(yàn)平均每對引物的(PIC)值為0.83，屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)；有效等位基因和Nei’s基因多樣性指數(shù)是目前遺傳多樣性研究中應(yīng)用較為廣泛的一個(gè)指數(shù)，而且，Nei’s基因多樣性指數(shù)也是衡量物種遺傳多樣性的一個(gè)重要指標(biāo)[25]，本試驗(yàn)供試樣品Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)介于0.134 0～0.305 5，平均為0.228 0，反映了新疆枸杞種質(zhì)資源具有較為豐富的基因型，這可能與其常異花授粉的生物學(xué)特性有關(guān)。另外，本研究遺傳相似系數(shù)介于0.590 3～0.903 2之間，平均(GS)值為0.736 1，這也充分說明供試材料間遺傳差異較大，SRAP標(biāo)記可有效應(yīng)用于新疆枸杞種質(zhì)資源的親緣關(guān)系分析。

汽輪機(jī)軸封間隙的調(diào)整是機(jī)組重要的檢修內(nèi)容，間隙調(diào)整的質(zhì)量關(guān)系機(jī)組能效指標(biāo)，同時(shí)也是涉及汽輪發(fā)電機(jī)組運(yùn)行時(shí)振動(dòng)安全的因素之一；文中介紹了不同類型的汽封特點(diǎn)，對應(yīng)各機(jī)組實(shí)際情況，需做到合理選用汽封；另外，對汽封間隙的調(diào)整進(jìn)行了說明，希望在汽封維護(hù)檢修方面給大家?guī)硪欢ǖ慕梃b。

3.2聚類分析和主坐標(biāo)分析

本試驗(yàn)采用UPGMA法聚類分析和主坐標(biāo)分析兩種方法對30份枸杞樣品遺傳多樣性進(jìn)行分析，兩種分析方法均反映出供試的野生種與栽培品種(系)間的遺傳差異較大，表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，而栽培品種(系)間的遺傳差異相對較小，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。一方面，這可能與UPGMA法聚類側(cè)重于種質(zhì)間關(guān)系差異的量化分析，提供豐富的數(shù)量信息，而主坐標(biāo)分析則是從多個(gè)角度分析不同種質(zhì)或群體間的關(guān)系有關(guān)[26]，兩種方法不矛盾。另一方面，這可能與新疆枸杞種質(zhì)資源在長期進(jìn)化和人工選擇過程有關(guān)，為保留種質(zhì)的優(yōu)良特性，栽培品種(系)種苗的繁育主要采用人工選育方式，如利用自然變異選擇突變單株，然后通過實(shí)生、分株、硬枝和嫩枝扦插以及組織培養(yǎng)等方式擴(kuò)大繁殖，從而使不同栽培品種(系)之間基因型類似且高度雜合，導(dǎo)致栽培品種(系)間產(chǎn)生了復(fù)雜的遺傳關(guān)系，而野生種就地保存了大量的原始種質(zhì)。從新疆枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的角度看，今后應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用的范圍，篩選出更多適合于新疆枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的引物，從DNA水平上更加準(zhǔn)確地反映出其種質(zhì)間的遺傳變異信息及親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，從新疆枸杞產(chǎn)業(yè)長遠(yuǎn)發(fā)展的角度來看，在以后的枸杞種苗的繁育過程中，應(yīng)注重與不同基因型的野生種進(jìn)行雜交親本選配，不斷增加基因型的聚合和優(yōu)良基因型的選擇幾率，這對品種改良和優(yōu)良品種選育具有較大的利用價(jià)值。從整體上看，這兩種分析方法對種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析是可行的，將兩種方法結(jié)合起來使用能使結(jié)果更加形象直觀，又更加全面，起到相互補(bǔ)充的作用。

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(編輯:宋亞珍)

Analysis of Genetic Diversity of Germplasm Resources ofLyciumbarbarumL.Revealed by SRAP in Xinjiang of China

ZHA Meiqin1, ZHAO Yulin2,LI Jiang1*, ZHU Yu1, LUO Shuping1, HU Yue1

(1. College of Forestry Science and Horticulture, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052,China;2.Management Center of Jinghe County Wolfberry , Jinghe, Xinjiang 833300 , China)

Abstract:SRAP markers were used to study the genetic diversity and phylogenetic relationship for providind a theoretical basis for identification and crossbreeding of genetic resources of Lycium barbarum L.in Xinjiang of China. The results are: (1)a total of 310 loci were produced by 12 pairs of SRAP primers, and polymorphic loci were 264 which accounted for 84.61% in the total amplified fragments. The polymorphism information content (PIC) values of these markers varied from 0.76 to 0.93 with an average of 0.83. Mean values of observed number of alleles(Na),effective number of alleles (Ne),Nei’s gene diversity (H) and Shannon’s information index(I) were 1.846 1, 1.386 9, 0.228 0 and 0.352 0.(2)Range of genetic similarity (GS) was 0.590 3 to 0.903 2 among 30 wolfberry samples. Cluster analysis showed that samples could be divided into 2 groups and 5 subgroups accordingly at the GS of 0.70 and 0.76. The principal coordinate analysis and clustering results are basically consistent. Research shows the genetic diversity of germplasm resources of L. barbarum L. in Xinjiang was relatively abundant. The genetic difference between wild species and cultivars (lines) was relatively large,show a distant relationship, and the genetic difference among cultivars (lines) was relatively small, show a close relationship.

Key words:Lycium barbarum L.；sequence-related amplified polymorphism (SRAP)；cluster analysis；principal coordinates analysis；genetic diversity；

文章編號:1000-4025(2016)04-0681-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0681

收稿日期:2015-10-12;修改稿收到日期:2016-03-24

基金項(xiàng)目:國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201304701-1)；新疆自治區(qū)果樹學(xué)重點(diǎn)學(xué)科基金資助

作者簡介:查美琴(1981-)，女，在讀碩士研究生，主要從事林木生物技術(shù)研究。E-mail:zhamq2016@126.com *通信作者:李疆(1959-)，男，教授，博導(dǎo)，主要從事林木種質(zhì)資源研究。E-mail：lijiangxj@163.com

中圖分類號:Q346+.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A