雷　剛, 周坤華, 方　榮, 吳　茵，陳學(xué)軍*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 南昌 330200; 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 南昌 330045)

基于表型數(shù)據(jù)的辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建研究

雷剛1,2, 周坤華1, 方榮1, 吳茵1,2，陳學(xué)軍1*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 南昌 330200; 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 南昌 330045)

摘要:以收集保存的603份辣椒種質(zhì)為材料，根據(jù)果形指數(shù)大小將其分成5組?；?8個(gè)性狀的表型數(shù)據(jù)，采用簡單比例、平方根比例、對數(shù)比例及遺傳多樣性指數(shù)比例法計(jì)算各組內(nèi)取樣份數(shù)，比較4種組內(nèi)取樣比例法、6種總體取樣規(guī)模和2種取樣方法在構(gòu)建辣椒核心種質(zhì)中的作用和效果。結(jié)果表明：(1)簡單比例、平方根比例、對數(shù)比例、遺傳多樣性指數(shù)比例法入選的材料份數(shù)占預(yù)選核心種質(zhì)份數(shù)依次為24.2%、22.2%、21.1%、17.8%，說明遺傳多樣性指數(shù)比例法對各組取樣數(shù)量的修正能力最強(qiáng)，使取樣更加均衡。(2)當(dāng)總體取樣規(guī)模為15%時(shí)，遺傳多樣性指數(shù)比例法構(gòu)建的預(yù)選核心種質(zhì)遺傳多樣性指數(shù)(I)達(dá)到最大，表型保留比例(RPR)超過98%；當(dāng)總體取樣規(guī)模超過20%時(shí)，RPR值、變異系數(shù)(CV)和極差符合率(CR)雖然平緩增加，但I(xiàn)值反而減?。徽f明15%為合適的總體取樣規(guī)模。(3)利用對數(shù)比例法和多樣性比例法，在15%的總體取樣規(guī)模下，聚類取樣構(gòu)建的核心種質(zhì)I值、RPR值、CV值及CR值均高于隨機(jī)取樣。(4)該研究根據(jù)所獲得的優(yōu)化方案最終在表型水平建立了包含91份種質(zhì)的辣椒核心種質(zhì)。

關(guān)鍵詞:辣椒；表型數(shù)據(jù)；核心種質(zhì)；取樣規(guī)模；取樣方法

核心種質(zhì)(Core collection)是指用一定的方法選擇整個(gè)種質(zhì)材料的一部分，以最小的材料數(shù)量和遺傳重復(fù)來最大程度地保存整個(gè)資源群體的遺傳多樣性[1]。核心種質(zhì)的構(gòu)建是農(nóng)作物種質(zhì)資源深入研究與有效利用的基礎(chǔ)，迄今國內(nèi)外已構(gòu)建水稻、小麥、玉米、大豆、油菜以及蔬菜作物、果樹作物等80余種農(nóng)作物的核心種質(zhì)[2-5]。

辣椒(Capsicumspp.)為茄科辣椒屬蔬菜作物，是我國主要果菜之一，在中國已有400余年的栽培歷史[6]。在長期的栽培馴化過程中，形成了豐富的品種類型。國內(nèi)雖然對辣椒種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀、品質(zhì)和抗病抗逆性進(jìn)行了一些研究[7～10]，但尚缺乏全面系統(tǒng)的鑒定與評價(jià)，特別是在核心種質(zhì)構(gòu)建水平上的研究匱乏，難以滿足科研、育種和生產(chǎn)對辣椒種質(zhì)資源多方面的需求。為有效提高辣椒種質(zhì)資源利用效率，本研究以603份辣椒種質(zhì)為試材，基于28個(gè)表型性狀，探討了辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建的取樣策略，建立了基于表型數(shù)據(jù)的辣椒核心種質(zhì)。

1材料和方法

1.1供試材料

供試?yán)苯贩N質(zhì)材料共603份，包含辣椒屬的3個(gè)栽培種(C.annuum、C.chinense和C.frutescens)及種間材料。其中，國內(nèi)材料560份，來自全國30個(gè)省市自治區(qū)，國外材料43份。603材料中，274份引自國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫，其余均由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。

1.2田間試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2014年10月至2015年3月在海南三亞海棠灣鎮(zhèn)進(jìn)行，前茬為水稻。2014年10月8日采用防雨遮陰棚播種育苗，11月6日地膜覆蓋定植。高壟窄畦，壟寬90 cm，每壟定植兩行，株距34 cm，每份材料定植12株。周圍以‘贛椒15號’設(shè)保護(hù)行，田間管理與常規(guī)栽培相同。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析方法

1.3.1性狀記載與數(shù)據(jù)處理調(diào)查的性狀共28個(gè)，包括21個(gè)描述性表型性狀和7個(gè)數(shù)量性狀。描述性表型性狀有：莖色、莖節(jié)色澤、莖表茸毛、葉卷曲否、花梗著生狀態(tài)、花冠色澤、花苞端部形狀、花藥色澤、花藥花絲色澤、花柱長短、柱頭色澤、花萼收縮否、花萼邊緣形狀、嫩果色澤、老果色澤、幼果花青素有無、果實(shí)縮莖否、果形、果梗著生處形狀、果實(shí)著生狀態(tài)和果實(shí)辣味。數(shù)量性狀有：株高、主莖高、始花節(jié)位、果重、果長、果寬和果肉厚度。

調(diào)查方法和標(biāo)準(zhǔn)以及描述性表型性狀的分級賦值參照本團(tuán)隊(duì)的方法[11]進(jìn)行，數(shù)量性狀依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差(δ)和均值(X)，按1級n

1.3.2取樣方法核心種質(zhì)取樣方案研究分為3 個(gè)層次，一是確定原始樣品分組方法，二是確定組內(nèi)取樣策略和總體取樣比例，三是確定組內(nèi)取樣方法。

(1)分組方法：辣椒果形變化豐富，本研究依據(jù)果形指數(shù)Fs(果長/果寬)大小將603份種質(zhì)分為5組。第1組包含144份材料，果型指數(shù)在0.1≤Fs≤2；第2組71份，果型指數(shù)29。

(2)取樣策略與總體取樣比例：①取樣策略：使用簡單比例(Proportional ratio,P)、平方根比例(Square root ratio,S)、對數(shù)比例(Logarithmic ratio,L)和遺傳多樣性指數(shù)比例(Genetic diversity index ratio,G)4 種取樣策略，構(gòu)建預(yù)選核心種質(zhì)，從中選擇最適方法。②總體取樣比例：設(shè)置5%、10%、15%、20%、30%和40%共6種總體取樣比例，以研究構(gòu)建辣椒核心種質(zhì)的適宜取樣比例。

(3) 組內(nèi)取樣方法：采用系統(tǒng)聚類取樣和隨機(jī)取樣2種方法。系統(tǒng)聚類取樣參考Zewdie等[12]的方法，即在聚類樹狀圖中，優(yōu)先選取遺傳距離最短簇中有特殊表型性狀的材料，每簇選取1份，單獨(dú)成簇的材料直接入選。入選的材料接著進(jìn)入下輪聚類，直到所剩材料達(dá)到所需的數(shù)量。隨機(jī)取樣則以15%取樣規(guī)模，在多樣性指數(shù)比例和對數(shù)取樣比例下進(jìn)行。

(4)核心種質(zhì)取樣方案設(shè)計(jì)：根據(jù)上述分組原則和取樣策略原理，設(shè)計(jì)了辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建的26種不同取樣方案，從中篩選最佳方案。

(5)核心種質(zhì)取樣方案效果的評價(jià)：根據(jù)前人研究成果[13-16]分別選擇了遺傳多樣性指數(shù)(Index of genetic diversity,I )、變異系數(shù)(Coefficient of variation,CV)、表型保留比例(Ratio of phenotype retained,RPR)和極差符合率(Coincidence rate of range,CR)4個(gè)參數(shù)，對辣椒預(yù)選核心種質(zhì)有效性進(jìn)行評價(jià)和檢驗(yàn)。

數(shù)據(jù)處理和各參數(shù)的計(jì)算均在Excel中進(jìn)行，系統(tǒng)聚類應(yīng)用SPSS17.0軟件，聚類方法采用歐氏

距離最遠(yuǎn)距離法。

2結(jié)果與分析

2.1組內(nèi)取樣比例法的確定

依據(jù)辣椒果型指數(shù)Fs把原始材料分成5組，在5%、10%、15%、20%、30%和40%總體取樣規(guī)模下，采用簡單比例、平方根比例、對數(shù)比例及遺傳多樣性指數(shù)比例法計(jì)算各組取樣份數(shù)(表1)。以第Ⅱ組為例，該組樣品數(shù)71份，占總材料數(shù)的11.8%。在15%的總體取樣規(guī)模下，4種比例法入選的材料份數(shù)占預(yù)選核心種質(zhì)份數(shù)依次為簡單比例12.1%、對數(shù)比例17.8%、平方根比例15.5%、多樣性指數(shù)比例22.2%。與簡單比例相比，后3種比例法入選的材料份數(shù)均增加，其中遺傳多樣性指數(shù)比例法增加最多。而對于第Ⅳ組來說，該組樣品數(shù)149份，占總體的24.7%，在15%的取樣規(guī)模下，4種比例法入選的材料份數(shù)占預(yù)選核心種質(zhì)份數(shù)依次為簡單比例24.2%、對數(shù)比例21.1%、平方根比例22.2%、遺傳多樣性指數(shù)比例17.8%。后3種比例法入選的材料份數(shù)比簡單比例均減少，以遺傳多樣性指數(shù)比例減少最多。其余各組的結(jié)果都相似?？梢?，4種比例法對各組取樣數(shù)量均衡的修正能力以遺傳多樣性指數(shù)比例最好。

表1　不同取樣方案下各組入選種質(zhì)份數(shù)及其占預(yù)選核心種質(zhì)的比例

2.2總體取樣規(guī)模的確定

依據(jù)4種取樣比例法和6個(gè)總體取樣規(guī)模，采用系統(tǒng)聚類取樣獲得24個(gè)預(yù)選核心種質(zhì)。分別用遺傳多樣性指數(shù)(I)、變異系數(shù)(CV)、表型保留比例(RPR)和極差符合率(CR)4個(gè)參數(shù)對24個(gè)預(yù)選核心種質(zhì)進(jìn)行比較。

圖1　不同取樣方案構(gòu)建的24個(gè)預(yù)選核心種質(zhì)的遺傳多樣性指數(shù)比較Fig.1　Comparison of indices of genetic diversity of 24 pre-core collections under different sampling strategies

圖2　不同取樣方案構(gòu)建的24個(gè)預(yù)選核心種質(zhì)的變異系數(shù)比較Fig.2　Comparison of coefficients of variation of 24 pre-core collections under different sampling strategies

從圖1可以看出，總體取樣規(guī)模從10%增加到15%時(shí)，預(yù)選核心種質(zhì)的I值均大幅增加，且達(dá)到最大。當(dāng)取樣規(guī)模從15%上升到20%時(shí)，各預(yù)選種質(zhì)的I值都大幅降低。此后，I值均隨著取樣規(guī)模的增加不斷減小。這表明，當(dāng)取樣規(guī)模超過15%之后，預(yù)選核心種質(zhì)的冗余度增加，各性狀變異分布的均一性下降。

從圖2看到，多樣性指數(shù)比例法構(gòu)建的預(yù)選核心種質(zhì)的CV值均較其它3種方法大。各預(yù)選核心種質(zhì)的CV值在取樣規(guī)模從5%上升到20%時(shí)不斷增大。當(dāng)取樣規(guī)模繼續(xù)增加到30%時(shí)，除了多樣性比例和對數(shù)比例構(gòu)建的預(yù)選核心種質(zhì)的CV值有較大增加外，簡單比例和平方根比例均小幅下降。取樣規(guī)模從30%增加到40%時(shí)，除簡單比例法外，其它3種組內(nèi)取樣比例法構(gòu)建的預(yù)選核心種質(zhì)CV值都較大幅度減小。

圖3　不同取樣方案構(gòu)建的24個(gè)預(yù)選核心種質(zhì)的表型保留比比較Fig.3　Comparison of ratios of phenotypic retained of 24 pre-core collections under different sampling strategies

取樣比例法Methodofsamplingratio總體取樣規(guī)模Theoverallsamplesize取樣方法Samplingmethod遺傳多樣性指數(shù)I變異系數(shù)CV極差符合率CR表型保留比例RPR多樣性指數(shù)比例Diversityindexproportion15%R0.9660.85630.83910.9669S1.0910.89160.96900.9834對數(shù)比例Logarithmicproportion15%R0.9690.84310.79860.9504S1.0860.87910.96900.9834

表3　預(yù)選核心種質(zhì)4個(gè)檢驗(yàn)指標(biāo)的方差分析

各預(yù)選核心種質(zhì)的RPR值隨取樣規(guī)模的增加均不斷增加，到30%時(shí)達(dá)到最大99%(圖3)。總體取樣規(guī)模從5%增加到10%時(shí)，各取樣比例法構(gòu)建的預(yù)選核心種質(zhì)的RPR值均大幅增加，并且都達(dá)到了96%以上。當(dāng)取樣規(guī)模為15%時(shí)，除了簡單比例法，其它3種組內(nèi)取樣比例法構(gòu)建的預(yù)選核心種質(zhì)的RPR值均達(dá)到了98%。當(dāng)總體取樣規(guī)模超過30%，各預(yù)選核心種質(zhì)的RPR值不再增加，此時(shí)通過增加取樣規(guī)模來增加核心種質(zhì)的變異豐度的效果甚微。

從圖4可以看出，當(dāng)取樣規(guī)模大于15%時(shí)，各預(yù)選核心種質(zhì)的CR值變化均趨于平緩，而取樣規(guī)模從5%上升到10%時(shí)，CR值增加的幅度最大，繼續(xù)增加到15%，CR值增加相對減少，說明取樣規(guī)模從5%增加到15%入選材料份數(shù)增加的同時(shí)，也增加了核心種質(zhì)的極差。同時(shí)，當(dāng)取樣規(guī)模達(dá)到15%時(shí)，各預(yù)選核心種質(zhì)的CR值均接近或超過了95%，且多樣性指數(shù)比例法和對數(shù)比例法獲得的預(yù)選核心種質(zhì)的CR值達(dá)到了97%，說明預(yù)選核心種質(zhì)很好地保存了原始群體的極差。

2.3組內(nèi)抽樣方法的確定

用遺傳多樣性指數(shù)、變異系數(shù)、極差符合率及表型保留比例來比較檢驗(yàn)15%取樣規(guī)模下組內(nèi)采用多樣性指數(shù)比例和對數(shù)比例法，進(jìn)行隨機(jī)抽樣和系統(tǒng)抽樣獲得的預(yù)選核心種質(zhì)，結(jié)果見表2。不論是多樣性指數(shù)比例還是對數(shù)比例，通過系統(tǒng)取樣獲得的預(yù)選核心種質(zhì)的4個(gè)指標(biāo)均比隨機(jī)取樣的大，說明系統(tǒng)取樣能有效降低核心種質(zhì)的冗余度，提升種質(zhì)變異豐度。

對通過4種取樣比例法和6種取樣規(guī)模以及聚類分析構(gòu)建的預(yù)選核心種質(zhì)的各檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表3)表明，各檢驗(yàn)指標(biāo)在6個(gè)取樣規(guī)模的差異都達(dá)到了極顯著水平，而對于4個(gè)取樣比例法，只有CV和I達(dá)到了顯著水平。由此可見，取樣規(guī)模主要影響核心種質(zhì)的I、CV、RPR及CR，而取樣比例則影響核心群體的I和CV，因而通過不同的取樣比例法和取樣規(guī)模構(gòu)建的核心種質(zhì)的變異豐度有顯著的差異。

3討論

在作物核心種質(zhì)構(gòu)建過程中，一般首先確定分組方法。常見的分組標(biāo)準(zhǔn)和方法包括地理及農(nóng)業(yè)生態(tài)分組[14]、按分類體系分組[17]及多數(shù)據(jù)組合分組[15,18]等。辣椒果形變異豐富，一年生辣椒(C.annuum)5個(gè)變種(燈籠椒、長椒、簇生椒、圓錐椒和櫻桃椒)的分類即是基于其果形變異特點(diǎn)[6]。本研究供試材料包含一年生辣椒所有變種，果形指數(shù)變化大，變幅在0.61～23.33之間，本文應(yīng)用果形指數(shù)對原始樣品進(jìn)行了合理分組，為進(jìn)一步篩選優(yōu)化辣椒核心種質(zhì)取樣方案奠定了基礎(chǔ)。

在分組基礎(chǔ)上，確定組內(nèi)取樣比例是重要步驟之一。李國強(qiáng)等[17]在構(gòu)建大白菜核心種質(zhì)時(shí)，比較了簡單比例法、對數(shù)比例法、平方根比例法及遺傳多樣性指數(shù)比例法4種取樣策略，認(rèn)為遺傳多樣性指數(shù)比例法效果更佳。本研究結(jié)果也表明，遺傳多樣性指數(shù)比例法在提高預(yù)選核心種質(zhì)表型保留比例、變異系數(shù)及對組內(nèi)取樣量的修正方面效果均較好。但李自超等[14]和李保印等[18]的研究結(jié)果卻有所不同。因此，在確定取樣策略時(shí)，要依據(jù)種質(zhì)材料的數(shù)量、分組情況及遺傳多樣性等信息來選擇或遴選最優(yōu)方法。

關(guān)于核心種質(zhì)的總體取樣規(guī)模，目前報(bào)道的總體取樣比例多在5%～40%[4]。Yonezawa 等[19]認(rèn)為20%～30%比較合適，Casler等[ 20]認(rèn)為低于1000份的資源取樣比例宜在6.54%～26.04%之間。但所有研究都沒有提供一個(gè)統(tǒng)一的總體取樣比例，這主要是不同作物種質(zhì)資源在收集程度、遺傳多樣性狀況和內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)上存在較大差異。Zewdie等[12]基于21個(gè)形態(tài)性狀，以10%的取樣規(guī)模構(gòu)建了辣椒核心種質(zhì)。本文通過比較24個(gè)預(yù)選核心種質(zhì)遺傳多樣性指數(shù)(I)、變異系數(shù)(CV)、表型保留比(RPR)及極差符合率(CR)，認(rèn)為15%是本研究適合的取樣規(guī)模。

本研究比較了分組情況下隨機(jī)取樣和系統(tǒng)聚類取樣所構(gòu)建核心種質(zhì)的效果，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)取樣在降低冗余度、增加遺傳多樣性和變異豐度方面均較隨機(jī)取樣效率高，這與國內(nèi)外研究結(jié)果是一致的[12-14,17,18]。隨機(jī)抽樣是基于對所有原始材料等同看待，通過隨機(jī)抽樣可獲得種質(zhì)資源最基本的變異[21]。而聚類取樣打破了原始群體的遺傳結(jié)構(gòu)，給予材料不同的權(quán)衡，在較少增加冗余度的基礎(chǔ)上保持了原始群體的變異豐度。鑒于核心種質(zhì)構(gòu)建的要求和目的，實(shí)際應(yīng)用中很少采用隨機(jī)抽樣法，僅在一些研究中作方法比較[22]。

基于28個(gè)表型性狀數(shù)據(jù)，本研究構(gòu)建的辣椒核心種質(zhì)最佳取樣方案為：按照果形指數(shù)大小進(jìn)行分組，組內(nèi)采用遺傳多樣性指數(shù)比例法確定取樣量，總體取樣規(guī)模為15%，使用歐氏距離最遠(yuǎn)距離法進(jìn)行組內(nèi)聚類抽樣獲得核心種質(zhì)。經(jīng)檢測，所得91份核心種質(zhì)對原始樣品具有較好的代表性。

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(編輯:潘新社)

Studies on the Constructing of Pepper Core Collection Based on Phenotypic Data

LEI Gang1,2, ZHOU Kunhua1, FANG Rong1, WU Yin1,2, CHEN Xuejun1*

(1 Vegetable and Flower Institute,Jiangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanchang 330200,China;2 College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:The method to construct pepper core germplasm based on phenotypic data was studied with 603 accessions which were divided into 5 groups by the fruit shape index.Four types of sampling proportion methods in group,six overall sampling scales and two sampling methods were compared by the phenotypic data of 28 characters.The main results were as follows:(1) The proportions of materials selected by proportional ratio,square root ratio,logarithm ratio and diversity ratio in primary core germplasm were 24.2%, 22.2%, 21.1% and 17.8%, respectively,which illustrated that the best proper sampling proportion within group was based on index of genetic diversity which enabled the sampled number or proportion from different groups tend to balance.(2) The index of genetic diversity (I) of the core germplasm established according to the method of genetic diversity index proportion reached maximum and the ratio of phenotypic retained (RPR) reached 98% when the over all sampling scale increased to 15%.Although the proportion of phenotypes retained,coefficient of variation (CV) and the coincidence rate of range (CR) all increased gently,the genetic diversity index of the preconcentrated core germplasm decreased accordingly when the overall sampling scale increased to over 20%.So 15% of the overall sampling sizes were more appropriate.(3) Using logarithmic ratio method and diversity ratio,under 15% of the total sample size,the I,RPR,CV and CR of the core germplasm constructed by cluster sampling were much higher than that by random sampling.(4) Based on the optimized sampling scheme,the core germplasm of 91 accessions of pepper germplasm were established.

Key words:pepper;phenotypic data;core germplasm;sampling scale;sampling method

文章編號:1000-4025(2016)04-0804-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0804

收稿日期:2016-01-18;修改稿收到日期:2016-03-30

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(31260479)，江西省自然科學(xué)基金(20133BAB20010)，江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科研協(xié)同創(chuàng)新專項(xiàng)(JXXTCX2015005)

作者簡介:雷剛(1988-)，男，在讀碩士研究生,主要從事蔬菜遺傳育種與分子生物學(xué)技術(shù)研究。E-mail: leixxgang@163.com *通信作者:陳學(xué)軍，二級研究員，碩士生導(dǎo)師,主要從事茄果類蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與分子生物技術(shù)研究。E-mail: 19889766@163.com

中圖分類號:Q346

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A