程馬龍,戴亮芳,羅向東,劉夢露,周　毅,程彥秋,謝建坤

瀕危羊躑躅自然居群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

程馬龍,戴亮芳,羅向東*,劉夢露,周毅,程彥秋,謝建坤

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022)

摘要：利用12對微衛(wèi)星(SSR)分子標(biāo)記對涉及6省8個羊躑躅自然居群193個體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，探討羊躑躅遺傳多樣性水平與分化程度的可能原因，為羊躑躅的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果顯示：(1)12對SSR引物共擴(kuò)出260個等位基因，每個位點的平均等位基因數(shù)為21.667，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為5.425，平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.900；物種水平的Shannon 多樣性指數(shù)(I)為1.768，基因多樣性指數(shù)(H)為0.777。(2)江西金溪(JX)的羊躑躅居群的遺傳變異最豐富，福建政和(ZH)的遺傳多樣性水平最低。(3)基于無限等位基因模型(IAM)的遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.142，基因流(Nm)為1.522；AMOVA分析顯示羊躑躅居群內(nèi)變異(87.71%)大于居群間變異(12.29%)。(4)遺傳距離法聚類NJ分析和Structure分析均表明，8個自然群體被分為三大類群；Mantel檢測發(fā)現(xiàn)，羊躑躅遺傳距離與地理距離無顯著相關(guān)性。研究表明，羊躑躅最好以就地保護(hù)為主，應(yīng)優(yōu)先保護(hù)江西金溪(JX)居群，同時增加對福建政和(ZH)和湖北京山(JS)居群的保護(hù)權(quán)重。討論了羊躑躅較高遺傳多樣性和中等程度分化的可能原因。

關(guān)鍵詞：羊躑躅；SSR；遺傳多樣性；瀕危植物保護(hù)

羊躑躅(R.molle)，又名黃杜鵑、鬧羊花等，是中國杜鵑花科羊躑躅亞屬中僅有的1個原生種[1]，具有較高的觀賞價值，是杜鵑花色品種改良的重要資源[2-3]。此外，羊躑躅全株器官均含有多種活性成分，具有重要的藥用價值，其提取物可治療溫瘧、慢性腎小球腎炎、高血壓和類風(fēng)濕等病[4-5]；對血吸蟲和作物害蟲也具有非常好的滅殺效果[6]。

20世紀(jì)80年代以前，羊躑躅遍及華中、華南，尤其在江蘇、浙江、安徽、江西和湖北等省比較多見，西南地區(qū)也有少量分布。但由于人們多年來的濫挖亂采及生境的破壞，羊躑躅的生殖環(huán)節(jié)受到嚴(yán)重影響，羊躑躅野外分布的地區(qū)和種群數(shù)量急劇減少，棲息地已呈“島嶼化”，有些省份野外已難見其蹤影，羊躑躅瀕于滅絕的風(fēng)險日益加劇，亟待加以保護(hù)[7]。

遺傳多樣性分析是評價和保護(hù)稀有瀕危物種的重要指標(biāo)，能夠反映一個物種適應(yīng)環(huán)境的能力和對環(huán)境變遷持續(xù)進(jìn)化的潛力和效應(yīng)，它能為確定瀕危植物優(yōu)先保護(hù)種群和制定有效的取樣策略提供重要依據(jù)[8]。簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat,SSR)，廣泛存在于真核基因組中，具有共顯性、高度重復(fù)性、高度豐富性等優(yōu)點，是研究群體遺傳多樣性的理想工具[9-10]。為了揭示瀕危羊躑躅自然居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)特征，利用課題組前期開發(fā)的12對羊躑躅微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記分析其自然居群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果可為羊躑躅野生資源保護(hù)和可持續(xù)利用策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料采集

實驗材料采集于2014和2015年的4月中旬至

5月上旬，樣品采自江西省金溪縣、鄱陽縣、永修縣，福建省政和縣，安徽省金寨縣，湖南省邵東縣，湖北省京山縣，浙江省磐安縣，共8個居群，合計193份個體樣品，每個個體樣品間隔至少10 m，采集好的樣品用冰袋盒保存帶回實驗室，液氮速凍后，放入-80℃冰箱保存。利用GIS數(shù)據(jù)采集器記錄各采樣點地理經(jīng)緯度，各居群的基本情況見表1。

1.2DNA提取和PCR擴(kuò)增

參照王軍等[11]方法提取羊躑躅幼葉基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA樣品的濃度和純度，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?5 μL的PCR擴(kuò)增體系包括7.5 μL 2×TaqPCR green mix(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司提供)，上下游SSR引物(表2)各1.0 μL，ddH2O 4 μL，基因組DNA 1.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃(部分引物56 ℃)退火45 s，72 ℃復(fù)性1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物以20 bp DNA ladder作為分子量標(biāo)記，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，緩沖液為1×TBE(pH 8.3)。150 V恒壓電泳90 min，銀染染色[12]，在燈箱上拍照。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)分子量大小估計一對等位基因，記錄條帶的堿基數(shù)大小(例如，分子量大小為120 bp的純合條帶可記為120/120；分子量為120 bp和126 bp的雜合條帶記為120/126)，條帶缺失記為“0/0”，得到SSR表型數(shù)據(jù)。首先，利用 GenALEx 6.1軟件[13]計算各遺傳多樣性指數(shù)；利用POPGENE計算Nei’s多樣性指數(shù)(H)、遺傳分化系數(shù)(Fst)及基因流(Nm)[14]；其次，利用GenALEx 6.1軟件中的分子方差(AMOVA)功能進(jìn)一步分析遺傳變異在羊躑躅居群間、居群內(nèi)的遺傳分化水平；隨后采用PowerMarker V3.25軟件對各位點分析多態(tài)性信息量(PIC)指數(shù)，計算遺傳距離(D)和遺傳一致度(GI)；運用Neighbor joining(NJ)算法構(gòu)建聚類圖，并利用GenALEx 6.1計算地理距離，經(jīng)Mantel檢測，分析其與遺傳距離的相關(guān)性。最后采用STRUCTURE 2.3.4軟件分析群體結(jié)構(gòu)[15]，估計最佳群體組數(shù)K，K取1～13，10次重復(fù)，采用Structure Harvester計算△K值作為最佳K值衡量標(biāo)準(zhǔn)[16]。

表1　羊躑躅居群采樣基本數(shù)據(jù)

2結(jié)果與分析

2.1羊躑躅SSR位點多態(tài)性

本研究利用12個多態(tài)性引物對羊躑躅8個自然居群共193個個體進(jìn)行SSR分析，總共擴(kuò)出260個等位基因，平均每個位點等位基因數(shù)為21.667，擴(kuò)增片段長度在90～182 bp之間。本研究所用的12對SSR引物多態(tài)性較好，擴(kuò)增條帶清晰，如圖1中引物HD88對邵東群體擴(kuò)增結(jié)果所示。分析表明，不同位點擴(kuò)增出的等位基因數(shù)差異較大，其中位點變異最少的是HD83，為14個，最多的是HD34、HD39和HD64，均為26個(表2)。12個位點的多態(tài)性信息含量(PIC)在0.790～0.941，平均值為0.900，顯示羊躑躅遺傳背景的復(fù)雜性。各位點的遺傳分化系數(shù)Fst值差異也較明顯，處于0.067～0.251，平均值為0.142，表明居群內(nèi)變異大于居群間變異。

2.2羊躑躅自然居群的遺傳多樣性

遺傳多樣性分析結(jié)果顯示(表3)，8個羊躑躅自然居群中的有效等位基因數(shù)為4.087～6.905，平均為5.425，其中最高為金溪(JX)居群，政和(ZH)居群最低。Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)變化范圍為0.706～0.820，平均值為0.777，8個居群的遺傳變異(Nei’s基因多樣性)排序由低到高依次為政和(ZH)<京山(JS)<永修(YX)<鄱陽(PY)<金寨(JZ)<磐安(PA)<邵東(SD)<金溪(JX)。Shannon指數(shù)(I)平均值為1.768(1.493～2.009)，其遺傳多樣性排序順序與Nei’s基因指數(shù)(H)的結(jié)果基本一致(表3)。綜合各遺傳多樣性參數(shù)的分析結(jié)果表明，金溪(JX)地區(qū)羊躑躅群體內(nèi)蘊(yùn)含較豐富的遺傳變異，邵東(SD)、磐安(PA)次之，金寨(JZ)、鄱陽(PY)、永修(YX)、京山(JS)4個地區(qū)居群遺傳多樣性水平居中，政和(ZH)居群遺傳多樣性水平最低。

M.20 bp DNA ladder

表2　羊躑躅12個SSR位點遺傳多樣性

2.3羊躑躅自然居群的遺傳結(jié)構(gòu)特征

2.3.1羊躑躅自然居群的AMOVA分析羊躑躅8個自然居群遺傳分化水平的分子方差分析結(jié)果表明(表4)，羊躑躅群體的變異大部分存在于居群內(nèi)(87.71%)，居群間的遺傳變異為12.29%(P<0.001)。該結(jié)果與由Nei’s指數(shù)計算的群體間分化系數(shù)(Fst=0.142)檢測的結(jié)果一致。同時，羊躑躅居群平均基因流Nm為1.522(表2)，表明羊躑躅居群間可能通過雜交或基因滲透產(chǎn)生一定程度的基因交流，從而削弱了因遺傳漂變引起的居群間分化程度。

2.3.2羊躑躅居群間遺傳距離與NJ聚類分析遺傳距離(D)和遺傳一致度(GI)分析表明(表5)，羊躑躅各居群Nei’s遺傳距離及遺傳一致度的平均值分別為0.142 6和0.866 2，表明各居群親緣關(guān)系比較近。浙江磐安(PA)與湖南邵東(SD)居群遺傳一致度最大，為0.905 4，同時遺傳距離最小，為0.099 4。江西永修(YX)與福建政和(ZH)居群一致度最小，為0.805 5，兩者間遺傳距離最大，為0.216 3。經(jīng)Mantel檢測發(fā)現(xiàn)，羊躑躅各居群間的遺傳距離與地理距離無顯著相關(guān)(r=-0.164，P=0.248)。

不同羊躑躅居群所構(gòu)建的NJ聚類結(jié)果(圖2)表明，8個居群主要分為3個類群，永修(YX)、京山(JS)居群為Ⅰ類，金寨(JZ)、金溪(JX)、政和(ZH)和鄱陽(PY)居群聚為Ⅱ類，磐安(PA)與邵東(SD)2個居群間遺傳距離最小，關(guān)系最密切，聚為Ⅲ類。

2.3.3羊躑躅自然居群的Structure分析基于貝葉斯算法的Structure結(jié)果顯示，羊躑躅各居群出現(xiàn)了一定的遺傳分化(圖3)。△K最大值所對應(yīng)的K值為3，表明羊躑躅自然居群Structure分析的最適K值為3。Structure分析結(jié)果顯示，羊躑躅8個居

群可分成3大組，分別用3種顏色來表示(圖4)，可以看出，金寨(JZ)、金溪(JX)、政和(ZH)居群聚為一組，磐安(PA)、邵東(SD)、鄱陽(PY)居群聚為一組，永修(YX)、京山(JS)為一組。進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，Structure分析結(jié)果與基于遺傳距離法的NJ聚類結(jié)果基本一致，即除鄱陽(PY)居群外，其余7個居群的聚類結(jié)果完全一致。進(jìn)一步對8居群分為3組進(jìn)行AMOVA分析發(fā)現(xiàn)，羊躑躅組間遺傳變異為6.86%(表4)，組間平均分化系數(shù)Φst為0.069(P<0.001)，再次說明羊躑躅自然居群組內(nèi)變異大于組間變異。

表3　羊躑躅自然居群的遺傳多樣性

注：居群代號同表1；下同。

Note:Population codes are same as table 1;The same as below.

表4　羊躑躅遺傳分化水平的方差分析(AMOVA)

注：*P值表示比觀測值變異大的概率，這個概率是通過把居群中的樣本經(jīng)過1 000次隨機(jī)排列改變計算得到的。

Note：*Pvalues are the probabilities of having a more extreme variance component than the observed values alone.Probabilities were calculated by 1 000 random permutations of individuals across populations.

表5　Nei’s遺傳距離(下三角)與遺傳一致度(上三角)

圖2　羊躑躅群體間NJ聚類分析

圖3　利用△K對群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析

1～8分別為JZ、PA、YX、JS、JX、SD、PY和ZH居群；相同的顏色代表一個類群。

3討論

遺傳多樣性是物種長期生存和保持進(jìn)化潛力的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物多樣性保護(hù)的重要組成部分。一般而言，特有種、瀕危種的遺傳多樣性水平較低[17]，但也有些能保持較高水平的遺傳多樣性[18]。羊躑躅是中國羊躑躅亞屬中僅有的一個原生種，由于其藥用價值和園藝觀賞價值，人為濫挖造成生境破壞，分布逐漸呈現(xiàn)片斷化，最終導(dǎo)致羊躑躅成為瀕危種[19]。本研究中，12對SSR標(biāo)記分析顯示羊躑躅具有較高的遺傳多樣性(PIC=0.900，I=1.768，H=0.777)，高于此前利用ISSR標(biāo)記分析江西羊躑躅的遺傳多樣性[20](I=0.5007，H=0.3342)以及同屬的美容杜鵑[21](I=0.4972，H=0.3386)，稍低于SSR標(biāo)記分析的66個杜鵑品種遺傳多樣性[22](PIC=0.838，I=2.2293)，究其原因，一方面可能研究的自然居群大小及生態(tài)類型不同所致；另一方面可能是羊躑躅為多年生、壽命較長植物，原本分布范圍較為廣泛，長期的居群演化和延續(xù)已使其沉積較多遺傳變異，只是后期過度采挖及其生境遭破壞出現(xiàn)片斷化，但片斷化時間不長，遺傳多樣性處在散失階段。

片斷化生境對種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平產(chǎn)生很大影響。一般而言，生境片斷化降低有效居群大小，造成物種適應(yīng)環(huán)境能力下降，同時也可能會因為遺傳漂變和近交衰退而使居群間產(chǎn)生遺傳分化，進(jìn)而降低該種群的生存能力，由此在后代產(chǎn)生遺傳瓶頸[23]。我們的研究顯示，羊躑躅種群間分化系數(shù)Fst為0.142，屬中等程度分化[24]，且遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。AMOVA分析也表明羊躑躅群體變異中87.71%發(fā)生于居群內(nèi)，居群間遺傳變異僅為12.29%，基于Structure分析分為三組后的AMOVA分析也揭示居群內(nèi)遺傳變異大于居群間遺傳變異。上述指標(biāo)表明，羊躑躅經(jīng)歷居群片斷化之后居群內(nèi)呈中等程度的分化，究其原因可能是居群間還存在一定程度基因流。Slatkin[25]認(rèn)為當(dāng)Nm>1時，基因流可以抵消居群間因遺傳變異引起的居群分化，本研究中羊躑躅居群間Nm為1.522，表明影響羊躑躅8個居群遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素可能是基因流，而花粉和種子的擴(kuò)散是植物基因流主要兩種形式[26]。根據(jù)杜鵑花科花粉具粘性和種子細(xì)小具有膜翅特征[22]，推測蟲媒和風(fēng)媒是較遠(yuǎn)距離傳播基因流的主要方式。

此外，分布區(qū)氣候因子、生境多樣性及人工栽培等因素，均對遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)變異模式產(chǎn)生較大影響[27]。我們野外實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，羊躑躅主要分布在海拔20～1200 m的山脊或沿路山坡，各省羊躑躅居群所處生境有很大不同。邵東(SD)、政和(ZH)及江西3個居群屬于非保護(hù)區(qū)內(nèi)居群，多處于已墾荒的丘陵，多與里白科、杜鵑科等灌木伴生，人類開墾、砍伐挖掘等因素干擾比較明顯，致使羊躑躅居群數(shù)量銳減，剩下的多以零散分布為主。京山(JS)、金寨(JZ)、磐安(PA)3個居群處在森林自然保護(hù)區(qū)，多與杉科、松科等喬木伴生，自然居群生境破壞較少，但也遭到了不同程度人為因素的破壞。因此對羊躑躅野生居群的保護(hù)亟需重視。本研究的Structure分析和NJ聚類分析均表明，8個居群可以分為三大類，均顯示永修(YX)、京山(JS)聚為一組，磐安(PA)、邵東(SD)聚為一組，金寨(JZ)、金溪(JX)、政和(ZH)居群聚為一組，表明各自然居群的遺傳多樣性與地理距離無直接相關(guān)性。由于該物種的海拔分布、生境和種群數(shù)量各不相同，羊躑躅的保護(hù)最好以就地保護(hù)為主。金溪(JX)的遺傳多樣性水平比較高，應(yīng)優(yōu)先保護(hù)；但由于政和(ZH)和京山(JS)居群均有一定數(shù)量的野生幼苗，應(yīng)增加保護(hù)權(quán)重。另外，遷地保護(hù)、植物組織培養(yǎng)之后人工栽培也是保存野生羊躑躅的遺傳多樣性有效途徑，而具體取樣策略還待進(jìn)一步對幼苗遺傳多樣性進(jìn)行分析之后制定。

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(編輯:宋亞珍)

Genetic Diversity and Genetic Structure Analysis on Natural Populations of EndangeredRhododendronmolleG.Don

CHENG Malong,DAI Liangfang,LUO Xiangdong*,LIU Menglu,ZHOU Yi,CHENG Yanqiu,XIE Jiankun

(College of Life Science,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China)

Abstract:In the present study,12 pairs of simple sequence repeat (SSR) primers were used to evaluate genetic diversity and genetic structure of Rhododendron molle G.Don in eight populations from six provinces.The results showed that:(1)A total of 260 alleles with an average 21.667 alleles per locus were amplified from 193 individuals.Average values of number of effective alleles (Ne) and polymorphism information content (PIC) were 5.425 and 0.900,respectively.This species has higher genetic diversity and gene flow among different populations.For R.molle,the Shannon’s information index (I) and Nei’s gene diversity (H) were 1.768 and 0.777,respectively.(2)Comprehensive analysis suggested that Jinxi (Jiangxi Province) population exhibits great level of variability,whereas the population of Zhenghe (Fujian Province) exhibits the lowest level of variability.(3)The genetic differentiation coefficient (Fst) based on infinite allele model (IAM) was 0.142 and the gene flow (Nm) was 1.522,respectively.Analysis of molecular variance (AMOVA) revealed that the genetic variation mainly occurred within populations (accounted for 87.71%),more than inter-populations (accounted for 12.29%).(4)The results of neighbor joining (NJ) analysis based on genetic distance and structure analysis showed that eight populations were clustered into three groups.The mantel test showed there was no significant correlation between genetic distance and geographical distance in R.molle.Our results indicated the priority should be given to in situ conservation,natural populations in Jinxi,Zhenghe,and Jingshan (Hubei Province) deserve prior conservation.The possible formation of the high level genetic diversity and the moderate differentiation of R.molle were also discussed.Key words:Rhododendron molle G.Don;SSR;genetic diversity;conservation of endangered plant

文章編號:1000-4025(2016)04-0674-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0674

收稿日期：2016-01-02；修改稿收到日期：2016-03-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31360147,31260255)；江西省自然科學(xué)基金(20151BAB204008)

作者簡介：程馬龍(1990- )，男，在讀碩士研究生，主要從事植物生態(tài)與分子生物學(xué)研究。E-mail：422281228@qq.com *通信作者：羅向東，博士，教授，主要從事植物遺傳與分子生物學(xué)研究。E-mail：xdluolf@163.com

中圖分類號：Q346.+5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A