王海鵬　黃曉西　梁越洋　朱軍　張翠霞　王秀梅　貢常委　鄭愛萍　鄧其明　李雙成　王玲霞　李平　王世全

(四川農業(yè)大學 水稻研究所， 四川 溫江 611130；*通訊聯(lián)系人， E-mail: sqwangscau@163.com)

轉Cry30Fa1基因抗褐飛虱水稻的獲得及鑒定

王海鵬黃曉西梁越洋朱軍張翠霞王秀梅貢常委鄭愛萍鄧其明李雙成王玲霞李平王世全*

(四川農業(yè)大學 水稻研究所， 四川 溫江 611130；*通訊聯(lián)系人， E-mail: sqwangscau@163.com)

王海鵬, 黃曉西, 梁越洋, 等. 轉Cry30Fa1基因抗褐飛虱水稻的獲得及鑒定. 中國水稻科學， 2016， 30(3)： 256-264.

摘要:將編碼高效殺褐飛虱蛋白的蘇云金芽胞桿菌基因Cry30Fa1密碼子改造后，通過農桿菌介導法轉入蜀恢818(R818)，并最終獲得46個轉基因植株。通過定量PCR及Western Blot鑒定了Cry30Fa1在轉錄水平和蛋白水平的表達，并通過分子檢測固定穩(wěn)定表達的抗性基因，并結合傳統(tǒng)育種系譜法選擇具有優(yōu)良農藝性狀株系。對選育的株系在室內和大田環(huán)境下進行了抗蟲性鑒定，選育的R818-Cry30Fal株系抗性明顯優(yōu)于親本材料并達到抗的水平；在單株抗蟲試驗中，觀察到了轉基因株系對褐飛虱具有致死作用。說明轉入Cry30Fa1基因使水稻產生了對褐飛虱抗性。培育出了具有抗褐飛虱蛋白的新型恢復系R818-Cry30Fal，為三系雜交育種提供了新的抗性材料并豐富了抗褐飛虱水稻種質資源。

關鍵詞:褐飛虱； 農桿菌介導法； 抗蟲性； Cry30Fa1

水稻是世界三大主要糧食作物之一，其產量和質量對保障人類生活至關重要[1-2]。不過水稻也是蟲害最多的糧食作物之一。以稻飛虱吸取汁液的刺吸式口器的害蟲不僅直接為害，同時還傳播病毒病， 嚴重影響水稻的產量及品質。傳統(tǒng)的防治方法主要是使用各種農藥來殺滅害蟲，不但提高了生產成本，增加了環(huán)境污染，破壞了生態(tài)平衡，而且褐飛虱易產生抗藥性，因而培育自身能夠抗蟲的水稻品種是防治害蟲最經濟、有效的方法[3]。目前主流的培育抗蟲水稻品種方式是利用水稻本身的抗性基因通過分子標記育種等手段培育抗蟲的水稻，但培育周期相對較長，并且隨著抗性品種種植年限的增加，其對褐飛虱抗性水平逐漸下降，即褐飛虱群體克服了含抗性基因水稻品種的抗性[4]。同時，由于受到種質資源的限制，傳統(tǒng)抗蟲育種愈發(fā)困難。

隨著分子生物學、基因工程、轉基因技術的發(fā)展，遺傳轉化開始成為作物育種的一種有效途徑[5]。利用基因工程手段將外源抗蟲基因通過農桿菌介導法導入水稻，使水稻自身產生抗蟲蛋白從而達到防治害蟲的目的。應用于水稻抗蟲性改良的外源基因最多的是來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringinensis，Bt)的殺蟲基因，比如被導入水稻的Bt抗螟蟲基因有Cry2A[6]、Cry1A(b)[7]、Cry1C*[8]等。還有一些非Bt基因被成功導入水稻中，通過轉雪花蓮凝集素(Galanthusnivalisagglutinin，GNA)[9-10]和半夏凝集素基因(PTA)[11]等外源凝集素基因實現(xiàn)獲取抗褐飛虱的轉基因材料，但這些非Bt基因在水稻中可能會分泌出一種對人有低毒的蛋白[12]。Bt基因對應分泌的蛋白只對一種或少數(shù)的昆蟲產生毒害作用且不對人畜產生毒害作用，所以Bt基因將會有極大的應用價值。Bt基因的殺蟲范圍很廣包括很多鱗、鞘、雙翅目及螨、線蟲等害蟲，同時對抗半翅目基因的研究也有進展，比如Cry30GA1[13]、Cry54Ab1[14]、Cry54Aa1及Cry30Fa1[15]等Bt基因。

本研究采用農桿菌介導法將Cry30Fa1密碼子優(yōu)化后的基因導入恢復系蜀恢818，通過分子手段篩選出具有Cry30Fa1的轉基因株系，通過后代自交分離篩選獲得農藝性狀好且去除標記基因的純系，并進行實時熒光定量PCR檢測在轉錄水平上的表達量及對轉基因材料進行Western Blot相對定量檢測，同時選擇純系轉基因材料進行苗期及抽穗期大田抗蟲鑒定。通過分子育種與傳統(tǒng)育種相結合的方式，以期最終獲得安全的無選擇標記基因抗褐飛虱水稻株系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試水稻品種及褐飛虱

轉基因受體親本為本實驗室培育的三系恢復系：蜀恢818(即R818)；褐飛虱為本實驗室室內培養(yǎng)多代的稻褐飛虱。

1.1.2Bt基因及密碼子優(yōu)化改造

Cry30Fa1基因采用本實驗室從海螺溝采集的

Bt菌BtMc28分離克隆[15]，參照周宗梁等[16]Bt基因的改造方法，將Cry30Fa1按照水稻密碼子偏好性進行改造。修改后的基因序列見輔助性表S1(http://www.ricesci.cn/CN/articl/showSupportInfo.do？id=2597)。

1.1.3根癌農桿菌及轉基因載體

轉基因過程中使用根癌農桿菌(A.tumefaciens)，菌株為LBA4404。同時使用的表達載體為pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg(圖1)。

1.2方法

1.2.1農桿菌介導法轉化轉基因植株

參考李雙成等[17]的農桿菌介導法，獲得轉基因株系。

1.2.2轉基因植株的檢測

分別取轉基因植株分蘗盛期葉片3～5 cm，然后放入標記的試管中，加入5 mL濃度為40 mg/L潮霉素檢測溶液，同時取轉基因植株葉片作對照，每天觀察葉片情況，5 d后記錄實驗結果。

采用CTAB法提取水稻葉片組織總DNA。根據Cry30Fa1基因編碼序列分別設計PCR引物，上下游引物序列分別為F21(5′-CGGAGATGACTGGGCAAAGGC-3′)和F22(5′-CTGGCAGGGGAAGACAAGAAG-3′ )，擴增產物為957 bp。根據潮霉素抗性基因序列設計擴增引物，分別為Hyg F(5′-GGCGTAATAGCGAAGAGGC-3′)和Hyg R(5′-AATGTGTGAGTAGTTCCCAGA-3′)，擴增產物為568 bp。

1.2.3標記基因去除及高代純系的選擇

通過對T1、T2代分離株進行鑒定，采取PCR檢測手段和浸泡潮霉素兩種方法相結合選取含有目的基因且不含標記基因Hyg的陽性株，連續(xù)自交授粉收種，直至收獲目的基因連續(xù)兩代不分離轉基因種子為止。

圖1載體pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg的骨架

Fig.1. Skeleton of vector pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg.

1.2.4轉基因材料主要農藝性狀分析

在轉基因水稻株系后代選擇不僅需要選擇去除選擇標記基因的株系，而且需要選擇農藝性狀較好的材料。 選擇轉基因株系103、129、131和親本蜀恢818進行抽穗期、株高、分蘗數(shù)、穗長、結實率、千粒重等農藝性狀分析。具體方法如下：抽穗期，當小區(qū)主穗有50%的材料抽出5 cm時記為抽穗期；株高，從水稻地面直到最高穗頂?shù)母叨?；分蘗數(shù)，對灌漿后有超過5顆種子分蘗進行統(tǒng)計；主穗長，統(tǒng)計每顆水稻主穗穗尖至穗頸的長度；結實率，統(tǒng)計主穗的有效結實率；千粒重，統(tǒng)計主穗千粒重。

1.2.5轉錄水平及蛋白表達量檢測

對T6代連續(xù)穩(wěn)定遺傳的轉基因水稻葉片提取RNA，反轉錄合成cDNA，稀釋10倍，密封后放置在-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。同時，根據Cry30Fa1基因編碼序列分別設計熒光定量PCR引物，上下游引物分別為30Fa1Q1-F(5′-TCCGTATGCGTTATGCC-3′)和30Fa1Q1-R(5′-GATGAAGGTTGTCCCGATT-3′)，擴增產物為89 bp。內參使用水稻通用的Ubi，上下游引物分別為Ubi-F(5′-GCCCAAGAAGAAGATCAAGAAC-3′)和Ubi-R(5′-AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC-3′)。

選取相應轉基因株系抽穗期的劍葉提取DNA，通過對Cry30Fa1基因的調取、亞克隆及表達載體構建、原核體系蛋白表達制備抗原、采用Western Blot檢測及最后使用Thermo Scientific NanoDrop 2000通過測量目標蛋白和內參蛋白的灰度值對目標蛋白進行相對定量分析。

1.2.6抗蟲性鑒定

采用目前普遍使用標準苗期集團篩選法 (the standard seedbox screening technique， 簡稱SSST)[18]并加以改進，同時為了更加全面客觀地了解轉基因材料苗期的抗蟲性，增加了苗期單株試管抗蟲鑒定。試驗中水稻材料苗期和大田抗蟲性均參考劉光杰等[19]的評價標準進行，選擇陰性對照為高感褐飛虱TN1和親本材料為蜀恢818，陽性對照含Bph14、Bph15基因的抗褐飛虱株系985，處理為轉Cry30Fa1材料分別為103、129、131。當實驗中TN1死苗率達到95%左右時，統(tǒng)計其他材料死苗率或者褐飛虱死亡率。

苗期單株試管抗蟲鑒定為了易于觀察和記錄數(shù)據，采用試管固體培養(yǎng)基在人工培養(yǎng)箱內培養(yǎng)水稻及養(yǎng)蟲。具體方法如下：每個株系為1個處理，每個處理1株苗，15個重復，待2～3葉時接20只2～3齡稻褐飛虱，記錄褐飛虱的存活情況。為了全面評價轉基因材料的抗蟲性，增加了集團苗期鑒定法。具體方法如下：1個株系為1個處理，3個重復，每個重復20株材料左右，待2～3葉期時接入2～3齡褐飛虱。

為了進一步探究轉基因水稻抗蟲性，同時采用了田間抗蟲性鑒定法。均以以上材料作為處理材料，在四川農業(yè)大學水稻研究所海南南繁基地按照每個材料40株，3次重復，采用完全隨機的方法排列，用孔徑100目的細網蓋住，田間正常管理但不施農藥，待水稻長到抽穗期，用人工方法在每個小區(qū)中心位置均勻放入帶有大量褐飛虱稻樁每天觀察，從第6天開始每天統(tǒng)計各個材料死亡情況，直到TN1死苗率為95%左右時，統(tǒng)計其他材料最終存活單株數(shù)，計算各材料水稻死亡率。以全株枯萎且失綠作為水稻死亡標準。

1.2.7統(tǒng)計分析

數(shù)據處理使用Excel 2010；數(shù)據統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗各處理之間的差異；制圖處理使用Origin 9.0完成。

2結果與分析

2.1轉基因植株的獲得

經過胚性愈傷組織的誘導及繼代、農桿菌介導的遺傳轉化、轉基因植株再生等階段，成功獲得水稻T0代轉化植株233株，如圖2所示。

2.2轉基因抗性植株T0代的檢測

2.2.1轉基因抗性植株T0代的抗潮霉素基因檢測

取轉基因T0代植株和陰性對照蜀恢818的離體葉片在潮霉素溶液中放置5 d后觀察，結果發(fā)現(xiàn)233株轉基因T0代植株的離體葉片中有80株一直保持綠色，其余植株的葉片與陰性對照相同，逐漸褪綠，最后完全枯黃。浸泡潮霉素結果與PCR潮霉素基因檢測結果保持一致(圖3)。浸泡潮霉素結果與PCR潮霉素基因檢測結果保持一致(圖4)。

2.2.2轉基因再生植株T0代的目的基因檢測

A-成熟胚的誘導; B-愈傷組織的繼代; C-抗性愈傷的篩選; D-抗性愈傷的分化; E-抗性植株的生根。

A, Induction of seed; B, Subculture of callus; C, Screening of resistant callus; D, Regeneration of resistance callus; E, Rooting of resistance callus.

圖2轉基因轉化的整個過程

Fig. 2. Procedure of transformation of rice.

1-陰性對照； 2，3-未轉進潮霉素基因的植株； 4-陽性對照； 5～7-轉入潮霉素基因的植株。

1， Leaves of non-transgenic rice; 2,3， Leaves of non-Hygtransgenic rice; 4， Positive control; 5,6,7， Leaves ofHygtransgenic rice.

圖3再生植株潮霉素T0代抗性檢測

Fig. 3. Response of leaves from transgenic plants T0to hygromycin solution.

對鑒定出含潮霉素基因的80個株系進行Cry30Fa1基因特異片段的PCR擴增，結果顯示，有46株為陽性，共轉化率為19.7%。蜀恢818轉Cry30Fa1基因陽性植株PCR擴增得到片段大小為957 bp，與陽性對照相同(圖5)。

2.3標記基因的去除及純系的選擇

經T0代收種，連續(xù)多代對各株系PCR檢測目的基因Cry30Fa1及潮霉素基因，最后在T6代150個小區(qū)中選擇出31個株系為連續(xù)兩代不分離的株系，其中帶有標記基因株系有15個，沒有標記基因的陽性株系16個。余下119個小區(qū)在轉基因水稻出現(xiàn)連續(xù)兩代中存在基因分離甚至全部丟失的現(xiàn)象。

2.4純系株系農藝性狀分析

對T6代材料中表現(xiàn)穩(wěn)定的材料103、129、131和親本蜀恢818進行農藝性狀分析。由表1可知，有效分蘗數(shù)、結實率、千粒重這三個農藝性狀中轉基因材料和親本之間沒有明顯差異，但從結實率上看轉基因材料均比親本高，材料103、129有效分蘗數(shù)和千粒重上也優(yōu)于親本蜀恢818；同時在株高和主穗長上兩個轉基因材料與親本存在顯著差異。綜上可見，轉基因材料經過人工對農藝性狀的選擇后，仍然可以選育出和親本農藝性狀相似甚至在某些農藝性狀上優(yōu)于親本的轉基因材料。

M-DNA 標記，“+”表示以質粒pCDMAR-Cry30Fa1作為陽性對照，“-”表示以未進行轉化的蜀恢818作為陰性對照；1-40為轉入Hyg的T0代植株。

M, DNA marker; “+”, Plasmid ofpCDMAR-Cry30Fa1; “-”, Non-transgenic Shuhui 818; 1-40, T0transformants carringHyg.

圖4T0轉化植株Hyg基因的PCR檢測

Fig. 4. Confirmation of Hyg gene in T0generation by PCR.

M-DNA 標記；“+”-質粒pCDMAR-Cry30Fa1作為陽性對照，“-”-未進行轉化的蜀恢818作為陰性對照;1～40-轉入Cry30Fa1的T0代植株。

M, DNA marker; +， Plasmid ofpCDMAR-Cry30Fa1; -, Non-transgenic Shuhui 818; 1-40, T0transformants carringCry30Fa1.

圖5T0轉化植株Cry30Fa1基因的PCR檢測

Fig. 5. Confirmation of Cry30Fa1 gene in T0plants by PCR.

2.5Bt基因轉錄水平

取T6代中表現(xiàn)穩(wěn)定的株系103、129、131和親本蜀恢818灌漿期葉片進行實時定量PCR檢測(圖6)，結果顯示Cry30Fa1基因在親本蜀恢818中沒有表達，在3份轉基因材料上均有表達，但是各株系兩兩之間表達量均存在極顯著差異，其中株系129表達量最小。

2.6Bt蛋白相對表達量

采用Western Blot檢測3份穩(wěn)定材料灌漿期葉片里Bt蛋白的相對表達量(圖7)，結果顯示103、129、131這3份轉基因材料中均有Bt蛋白表達。

表1轉基因材料的主要農藝性狀(平均值±標準差，n=3)

Table 1. Major agronomic traits of transgenic materials(mean±SD,n=3).

性狀Traits蜀恢818Shuhui818株系103Line103株系129Line129株系131Line131株高Plantheight/cm115.0±0.6a99.3±2.0c113.3±2.4a105.7±0.9b有效分蘗數(shù)Effectivetillernumber7.0±1.5a8.0±2.0a7.3±0.9a6.7±0.9a主穗長Mainpaniclelength/cm21.4±0.4a22.6±0.5a24.6±0.3b23.8±0.3b結實率Seed-settingrate/%70.7±3.0a78.1±1.3a79.8±3.9a77.5±2.1a千粒重1000-grainweight/g25.4±1.2a27.0±0.6a27.6±0.2a25.0±1.3a

同一行數(shù)據后帶相同字母者表示品種間差異未達顯著水平(P>0.05)。

Within a row, data followed by the same letters show no significant difference(P>0.05).

**在0.01水平差異顯著。

**，Significant difference at 0.01 level.

圖6Cry30Fa1在灌漿期葉片中的表達情況

Fig. 6. Expression level of Cry30Fa1 in leaf at the filling stage.

株系103與129的相對表達量之間存在極顯著差異，株系129灌漿期葉片組織里蛋白相對表達量較株系103、131低。

2.7抗蟲鑒定結果

當感稻褐飛虱材料TN1死苗率達到95%左右時，統(tǒng)計其他處理材料死苗率(圖8，表2)。結果發(fā)現(xiàn)集團抗蟲鑒定中親本蜀恢818死苗率均高于其他處理材料且存在顯著性差異， 3份轉基因材料與抗稻褐飛虱材料985無顯著性差異，但這4份材料抗性級別均高達7級，屬于中感材料(MS)。在單株抗蟲鑒定時，結果表明3份轉基因材料稻褐飛虱死亡率比親本蜀恢818高且呈現(xiàn)顯著性差異。對比兩個抗蟲鑒定方法可以看出，抗稻褐飛虱材料985在集團苗期抗性上和轉基因材料抗性差異不明顯，同時在單株鑒定時抗稻褐飛虱材料985試管中褐飛虱死亡率低于3份轉基因材料且無顯著性差異。轉基因材料可能是由于表達了具有殺蟲性的Bt蛋白，造成轉基因材料的稻褐飛虱死亡率均顯著高于親本R818。

當大田感褐飛虱材料TN1死亡率在95%左右時統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(圖8，表2)，抗褐飛虱株系985水稻死亡率為0%，抗性級別為0級，屬于免疫材料(Ⅰ)；親本蜀恢818水稻死亡率為64.17%，抗性級別為7級，屬于中感材料；材料131水稻死亡率16.67%，株系103水稻死亡率29.17%，抗性級別都為3級，屬于抗材料(R)；129水稻死亡率為35.5%，抗性級別為5級，屬于中抗材料，同時3份轉基因材料與親本蜀恢818在水稻存活率上存在顯著差異，且抗性水平明顯優(yōu)于親本蜀恢818。

ns-無顯著差異； **在0.01水平差異顯著。

ns，No significant difference；**，Significant difference at 0.01 level.

圖7Cry30Fa1在灌漿期葉片中的表達情況

Fig. 7. Expression of Cry30Fa1 in leaf at the filling stage.

3討論

3.1轉基因材料的獲得及選育

程海鵬等[20]研究表明，多拷貝插入基因容易造成基因沉默，同時也會導致后代的遺傳和抗性不穩(wěn)定。本研究經過轉基因水稻連續(xù)多代的自交分離選擇了31份純系的轉基因材料，但仍有株系高代分離和丟失基因的現(xiàn)象存在，這與前人研究結果相似。有研究表明農桿菌介導的遺傳轉化過程中，外源基因的插入是一個隨機的過程， 有可能插入某個基因內部而造成農藝性狀的變化，外源基因拷貝數(shù)越高，其農藝性狀變異越大[21]。通過對3份轉基因材料的主要農藝性狀進行分析，我們可以看出通過連續(xù)多次的人工選育及分子標記選擇，仍然可以獲得農藝性狀變化不大的轉基因株系，根據前人的研究結果猜測這3份轉基因材料可能是低拷貝轉基因株系，同時接下來需要對拷貝數(shù)進行分析予以驗證。

3.2轉基因材料分子水平的表達

A-單株抗蟲性鑒定; B-苗期集團抗蟲鑒定; C-大田抗蟲性鑒定。

A, Individual identification of pest resistance; B, Pest resistance identification in seedling group; C, Field identification of pest resistance.

圖8三種不同抗蟲鑒定方法的鑒定結果

Fig. 8. Pest resistance identification results by three different methods.

在轉錄和翻譯水平分析外源基因表達時，往往容易出現(xiàn)個別樣品在轉錄和翻譯水平不一致的問題[22]，在轉基因植物中外源基因拷貝數(shù)常影響目的基因的表達水平和遺傳穩(wěn)定性[23]。通過對31份轉基因株系進行了實時熒光定量PCR和Western Blot蛋白分析，31份材料在轉錄水平均有表達，但有6份材料沒有蛋白表達，這可能由于蛋白表達量過低無法檢測到或者翻譯受阻造成蛋白未表達；同時我們對3份材料進行重點分析，3份材料在基因表達量和目標蛋白表達量上均有差異且兩者差異變化趨勢相同，可以看出基因的轉錄水平和翻譯水平的表達量呈現(xiàn)正相關。

表2不同鑒定方法下水稻抗蟲性的分析(平均值±標準差,n=3)

Table 2. Insect resistance of rice by different identification methods(mean± SD, n=3).

%

同一行數(shù)據后帶相同字母者表示品種間差異未達顯著水平(P>0.05)。

Within a row, data followed by the same letter show no significant difference(P>0.05).

3.3轉基因材料抗蟲性鑒定

目前水稻品種抗性篩選中最常用的為標準苗期集團篩選法，該法僅能反應出水稻品種幼苗階段的抗性水平，可能使得一些具有成株期抗性的品種得不到利用[24]，且水稻生產過程中苗期飛虱數(shù)量極少，通常要到成株期才能表現(xiàn)出大量飛虱的侵害，大田抗性鑒定因其與水稻生產安全緊密相關而越來越受到重視[25]；同時，汪秀峰等[26]研究表明，不同生育期Bt蛋白的表達量不同，在水稻生長旺盛的時期表達量相對較高，故這個時候檢測的準確性更高。本研究采用3種不同抗蟲性鑒定方法的目的在于探究轉基因水稻株系真實的抗蟲性。研究表明，通過單株試管鑒定法說明轉基因株系有一定的殺稻褐飛虱效果。雖然標準苗期集團篩選法結果顯示苗期材料均不抗褐飛虱，但轉基因材料的死苗率較親本材料出現(xiàn)了明顯改善；田間水稻抗蟲性鑒定結果說明轉基因材料129達到中抗水平，材料103和131達到了抗的水平。以上結論表明水稻成株期與苗期的抗性存在不同的情況，這與前人的研究結果有相似的地方，說明水稻抗性鑒定需要苗期和大田相結合。

單株鑒定結果表明轉基因材料存在一定殺蟲效果，但是殺蟲效果并沒有達到較高的水平。以上現(xiàn)象我們推測可能是由于在水稻苗期Bt蛋白表達有限或者苗期水稻生命力弱而不足以抵抗褐飛虱侵害；同時在單株抗蟲鑒定中出現(xiàn)非轉基因材料中褐飛虱死亡情況，分析可能是由于褐飛虱比較弱小掉落在固體培養(yǎng)基上不能移動造成饑餓致死或者可能由于前期死亡的水稻單株里褐飛虱不能長期取食以致死亡。這有待進一步研究證實。

于志晶等[26]的研究表明，Bt蛋白含量與其抗蟲性表現(xiàn)基本成正比。束春娥等[27]的研究表明，殘蟲量達到防治指標時， 必須及時輔以化學防治。本研究通過對田間抗蟲結果分析，發(fā)現(xiàn)與預期抗蟲性有所差異，分析原因有可能是這3份轉基因材料Bt蛋白表達量較少，造成殺蟲效果欠佳；當然也有可能是由于加蓋透氣網在褐飛虱危害后期蟲口壓力過大，未及時輔以化學防治以致出現(xiàn)抗蟲數(shù)據偏差。

為了獲得轉基因抗稻褐飛虱的優(yōu)良恢復系材料，我們通過農桿菌介導法轉入抗稻褐飛虱Bt基因并對基因進行分子水平檢測，同時也采取了兩種苗期抗蟲性鑒定和田間抗蟲性鑒定。綜上所述，本研究已經實現(xiàn)了一個新的抗蟲基因(Cry30Fa1基因)的優(yōu)化及成功轉化，篩選出了多個具有抗蟲性的轉基因純合株系，為以后培育更多的抗稻褐飛虱水稻創(chuàng)造了新的材料。

謝辭：特別感謝中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所朱禎實驗室提供pCDMAR-Hyg載體；感謝福建省農業(yè)科學院生物技術研究所王鋒實驗室提供轉基因技術幫助。

在線輔助信息：表S1放在中國水稻科學網站，網址為(http://www.ricesci.cn/CN/articl/showSupportInfo.do？id=2597)。

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Development and Identification of Insect Resistant Transgenic Rice withCry30Fa1 Gene

WANG Hai-peng， HUANG Xiao-xi， LIANG Yue-yang, ZHU Jun, ZHANG Cui-xia, WANG Xiu-mei, GONG Chang-wei, ZHENG Ai-ping, DENG Qi-ming, LI Shuang-cheng， WANG Ling-xia, LI Ping， WANG Shi-quan*

(RiceResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang611130,China;*Corresponding author, E-mail: sqwangscau@163.com)

WANG Haipeng, HUANG Xiaoxi, LIANG Yueyang, et al. Development and identification of insect resistant transgenic rice withCry30Fa1 gene. Chin J Rice Sci, 2016, 30(3): 256-264.

Abstract:Modified Cry30Fa1, a Bacillus thuringiensis (Bt) gene encoding a high-efficiency insecticidal protein to the brown planthopper(BPH),was introduced into Shuhui 818(R818) by Agrobacterium-mediated genetic transformation and 46 transgene lines were obtained. We confirmed the valid transformation by RT-qRCR and Western blot at transcriptional level and translational level, and fixed the stable expression Cry30Fa1 in homozygosis. The classical pedigree breeding methods were also used to select the important agronomic traits in transgenic lines. Furthermore, we evaluated the resistance to BPH of different lines in growth chamber and field, and found that the R818-Cry30Fal displayed higher resistance than untransformed R818 in seedling stage. We also observed the reduced population of BPH feeding the transgenic lines, suggesting that the transformed Cry30Fa1 enhanced resistibility to BPH in rice. We cultivated new BT protein transgenic rice restorer line R818-Cry30Fal, which may provide new BPH resistance material to three line hybrid rice breeding and enrich BPH resistance germplasm resources in rice.

Key words:brown planthopper; Agrobacterium-mediated method; insect resistance; Cry30Fa1

DOI:10.16819/j.1001-7216.2016.5190

收稿日期:2015-12-25； 修改稿收到日期: 2016-01-15。

基金項目:國家轉基因生物新品種培育科技重大專項(2011ZX08001001)。

中圖分類號:Q786;S435.112+.3

文獻標識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)03-0256-09

中國水稻科學(Chin J Rice Sci),2016,30(3):256-264

http://www.ricesci.cn