馬繼瓊 　楊奕　孫一丁　王炎炎　許明輝

(云南省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 昆明 650223； #共同第一作者; *通訊聯(lián)系人， E-mail： xuminhui@sohu.com)

云南地方水稻品種抗稻瘟病基因Pita功能區(qū)段序列變異分析

馬繼瓊#楊奕#孫一丁王炎炎許明輝*

(云南省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 昆明 650223；#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人， E-mail： xuminhui@sohu.com)

馬繼瓊， 楊奕，孫一丁，等. 云南地方水稻品種抗稻瘟病基因Pita功能區(qū)段序列變異分析. 中國水稻科學， 2016， 30(3)： 265-272.

摘要:稻瘟病抗性基因序列變異的分析與認識是挖掘水稻抗稻瘟病基因資源的基礎(chǔ)。對來源于云南省56個縣(市)的218份地方稻品種稻瘟病抗性基因Pita第二編碼區(qū)功能位點區(qū)段的609個堿基進行了測序分析。結(jié)果表明，所有供試品種在此序列上有18個變異位點，存在46種DNA單倍型和28種蛋白類型，其中DNA單倍型Pita-H1、Pita-H2、 Pita-H6頻率較高，三者比例分別為17.89%、29.82%、20.18%，合計67.89%，是云南的優(yōu)勢單倍型，而其他單倍型頻率較低，頻率0.46%～3.67%。攜帶Pita抗性基因(編碼區(qū)第2752位功能位點堿基為G)的品種共61個，占供試材料的27.98%，其中39個品種(占63.93%)與越南抗性品種Tetep序列一致。Pita抗性基因在水稻各亞種和生態(tài)型中的分布是不平衡的，秈稻中的頻率為35.06%，粳稻中為24.11%，水稻中31.03%，陸稻中21.92%，黏稻中30.77%，糯稻中18.37%。Pita抗性基因在云南省廣泛分布，36縣(市)檢測到了Pita抗性基因，但南部地區(qū)頻率高于其他地區(qū)，且有的縣頻率較高，呈小集中的特點，海拔2200m以上的7個品種未能檢測到Pita抗性基因。

關(guān)鍵詞:稻； 云南； 稻瘟??； Pita

稻瘟病是全世界各稻區(qū)最為嚴重的病害之一。由于稻瘟病菌的高度變異性和不穩(wěn)定性，新育成的具有單一抗性基因的抗性品種在推廣種植幾年后就成為感病品種，這已成為水稻生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要障礙，挖掘水稻抗性基因資源是抗稻瘟病育種的基礎(chǔ)。

主效抗稻瘟病基因Pita是最早被克隆和研究最多的基因之一[1-4]，在我國很多稻區(qū)表現(xiàn)高水平的稻瘟病抗性，被廣泛應用于我國的水稻育種和生產(chǎn)[5]。地方品種Tadukan和越南品種Tetep的Pita基因被廣泛應用于亞洲和美國的抗稻瘟病育種中[6,7]。李進斌等[8]的研究表明Pita抗性基因仍可在云南粳稻區(qū)利用。為了準確鑒定該基因，Jia等[9,10]已開發(fā)了引物YL155/YL87和YL183/YL87，并已廣泛應用于資源的鑒定和育種中。楊杰等[11]利用Pita基因的功能標記，檢測和分析了我國115份水稻地方品種的Pita基因型，結(jié)果表明Pita在我國浙江、福建、廣東、廣西、貴州、四川、安徽、江西、河南、河北、吉林均有分布。

Pita是單拷貝抗稻瘟病基因，包含2個外顯子和1個1463 bp的內(nèi)含子，編碼一個NBS-LRR 蛋白，缺乏經(jīng)典的富亮氨酸重復(LRR)區(qū)域，但含有一長度不等的不完全重復的氨基酸序列組成的富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRD)。在Pita蛋白LRD區(qū)域的單個氨基酸的差異，決定了等位基因?qū)儆诳共』蜻€是感病基因，即第918氨基酸是丙氨酸(A)則抗病,絲氨酸(S)則表現(xiàn)為感病反應[12]。Wang等[4]研究表明，除抗性位點外，Pita基因在栽培稻和野生稻中都存在大量的單核苷酸多態(tài)性位點和插入/缺失位點，存在15種Pita變異體和9種變異蛋白，而Thakur等[13]對印度地方稻種的分析表明存在64種單倍型和47種蛋白變異體。

云南地形氣候復雜，海拔76-2700 m區(qū)域均有亞洲栽培稻地方品種分布，是世界上最大的稻種遺傳多樣性中心之一，基因多樣性大于中國其他地理群[14]。趙國珍等[15]在云南景洪普通野生稻中發(fā)現(xiàn)存在Pita抗性基因，推測云南可能是抗稻瘟病基因Pita的起源地之一。李進斌等[16]曾用引物YL155/YL87和YL183/YL87對云南地方稻種進行分析，發(fā)現(xiàn)云南地方稻種攜帶Pita抗性基因的比例較高。

第二代測序技術(shù)的成熟與普及，為直接鑒定該位點DNA堿基提供了可能性，DNA測序同時可提供除功能位點外其他堿基變異的信息。本研究擬對云南地方稻種資源Pita基因包含功能位點的區(qū)段進行測序分析，明確Pita抗性基因的多樣性，以及品種攜帶Pita抗性基因的情況，積累種質(zhì)資源基因信息，為挖掘和利用基因資源提供指導。

1材料與方法

1.1材料

來源于云南省14個州市56個縣(市)的218份地方稻品種作為試驗材料。 按秈粳稻分類，秈稻77份，粳稻141份；按水陸稻分類，水稻175份，陸稻73份；按黏糯稻分類，黏稻169份，糯稻49份。材料均由云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所保存。以日本晴作為測序?qū)φ掌贩N，與從GenBank查詢到的日本晴Pita基因序列AF207842進行比對，以檢驗測序的可靠性。

1.2DNA提取

采用CTAB法提取基因組DNA[17]。

1.3PCR擴增及測序

根據(jù)Jia等(私人通訊)提供的160余份水稻Pita基因序列，設(shè)計一對引物。擴增的是第二編碼區(qū)后半段(包含功能位點)和終止子后的部分序列，大約1449 bp。前引物pita2-F位于基因編碼區(qū)1344-1364位(第二編碼區(qū)內(nèi))，序列為TACTTTGCAGGGGATGAGGC，后引物pita2-R 位于基因終止子后20 bp，序列為TGATTCAGGGTCACAACAATAACA，由華大基因公司合成。

20 μL反應體系包括緩沖液2 μL，dNTPs 1 μL，前后引物各1 μL，ExTaq酶 0.4 μL，ddH2O 13.6 μL，DNA模板1 μL。反應程序如下：95℃下5 min；95℃下40 s，57℃下30 s，72℃下50 s，41個循環(huán)，72℃下10 min。

PCR擴增產(chǎn)物送至華大基因公司用后引物pita2-R進行測序，每個材料重復測序2次，若兩次的測序結(jié)果不一致，則進行第3次測序，取其中2個相同的測序結(jié)果用軟件BioLign進行比較分析，用軟件MEGA 5.1進行系統(tǒng)樹分析。

2結(jié)果與分析

2.1Pita基因功能區(qū)段變異與編碼蛋白變異

引物pita2-F/pita2-R對所有供試材料基因組DNA進行擴增，均可擴增出一條大約1449 bp DNA片段，表明所有材料均攜帶Pita/pita基因片段。擴增片段用后引物pita2-R進行測序，每批次測序?qū)嶒炈@得的日本晴序列長度和堿基序列與從GenBank獲得的AL772419.4序列的對應序列一致，說明測序資料可靠。測序?qū)嶒炓话憧傻玫?50 bp左右的正確序列，超出此范圍測序準確性會受到影響。為了保證資料的準確性，我們只對所獲得的序列中的609個堿基序列進行比較分析。通過比對，該序列位于Pita基因編碼區(qū)2179-2787(終止子)位，包含了Pita基因功能位點2752位堿基和終止子。

表1云南水稻地方品種Pita基因功能序列變異位點與單倍型

Table 1. Sequence variant loci and haplotypes of Pita gene in rice landraces from Yunnan.

單倍型Haplotype品種數(shù)No.ofaccessions比例Percentage/%21842249228322912354237323882395240224662477249525752584271527262752*2766TetepTTACCGACTTCCCGCCGA日本晴Nipponbare................T.H13917.89..................H26529.82................T.H331.38...............A..H483.67......T..........H583.67......T........T.H64420.18................TGH773.21...............T.H810.46..............GA..H910.46.......T....T.....H1031.38......GT........TGH1120.92......G........ATGH1210.46..............G.T.H1310.46......GT......GA..H1410.46.....CGT.......A..H1510.46C.....G.........TGH1610.46......GT.......AT.H1710.46......GT....T...T.H1810.46......GT....T..A..H1910.46.....CGT....T.....H2010.46......GT......GATGH2110.46......GT....T...TGH2210.46C....CGT....T.....H2310.46C.....GTC...T.....H2410.46.......T....T...T.H2510.46C.....GT....T...T.H2610.46C.....GT........TGH2710.46......GT......G.TGH2810.46.....CGT....T...T.H2920.92C....CGT....T...T.H3010.46......GT....T..ATGH3110.46.C....GT....T...TGH3210.46C.....GT......G.TGH3310.46C.....GT....T...TGH3410.46CC....GT.C..T.....H3510.46C.....GT....T..AT.H3610.46CC....GT....TC..T.H3720.92C....CGTC...TC..T.H3810.46C..T.CGT....T...TGH3910.46CC...CGT.C..T...TGH4010.46C..T.CGT.C..TC..TGH4110.46C.T.TCGT..G.T...TGH4210.46C....CGT.CGATC.A..H4310.46CC...CGT.CGAT.GA..H4410.46CC...CGTCCGATC..T.H4510.46C.TTTCGTCC.ATC..T.H4610.46CCTTTCGTCCG.T...TG合計218100

“.”代表與第一行堿基相同; “*”代表功能位點。下同。

“.”， Indicates the same as the bases of the first line; “*” ，Indicates the functional sites. The same as in tables below.

與越南抗性品種Tetep的Pita基因序列進行比對分析，所有供試品種在609個堿基序列上存在18個變異位點，根據(jù)18個變異位點，此段序列存在46種單倍型(表1)，其中日本晴歸為Pita-H2，Tetep歸為Pita-H1。各單倍型與抗性品種Tetep對應片段比較，每個單倍型存在0～13個位點的差異。各個單倍型出現(xiàn)頻率存在極大的差異，其中Pita-H1、Pita-H2、Pita-H6頻率較高，三者比例分別為17.89%、29.82%、20.18%，合計67.89%，是云南的優(yōu)勢單倍型，而其他單倍型頻率較低，頻率為0.46%～3.67%。綜上所述，云南水稻地方品種在Pita基因功能位點序列上存在豐富的變異，單倍型多，其中優(yōu)勢單倍型為3種，而多數(shù)單倍型頻率較低。

表2云南水稻地方品種Pita基因編碼蛋白序列變異位點與蛋白質(zhì)類型

Table 2. Sequence variant loci and type of Pita gene encoded proteins in rice landraces from Yunnan.

蛋白類型ProteintypeDNA單倍型Haplotypes750761764785791801826832859862905909918*TetepLRATMFSTLDSSA日本晴Nipponbare............SPita-p1Pita-H1,Pita-H4.............Pita-p2Pita-H2,Pita-H5,Pita-H6,Pita-H7,Pita-H10,Pita-H15,Pita-H26............SPita-p3Pita-H3...........Y.Pita-p4Pita-H9........F....Pita-p5Pita-H11,Pita-H16...........YSPita-p6Pita-H8,Pita-H13..........RY.Pita-p7Pita-H12,Pita-H27,Pita-H32..........R.SPita-p8Pita-H17,Pita-H21,Pita-H24,Pita-H25,Pita-H33........F...SPita-p9Pita-H18........F..Y.Pita-p10Pita-H23.....S..F....Pita-p11Pita-H14....I......Y.Pita-p12Pita-H19,Pita-H22....I...F....Pita-p13Pita-H34P.......F....Pita-p14Pita-H20.......T..RYSPita-p15Pita-H30,Pita-H35.......TF..YSPita-p16Pita-H28,Pita-H29....I..TF...SPita-p17Pita-H31P......TF...SPita-p18Pita-H36P......TFH..SPita-p19Pita-H39P...I..TF...SPita-p20Pita-H38..V.I..TF...SPita-p21Pita-H37....IS.TFH..SPita-p22Pita-H40..V.I..TFH..SPita-p23Pita-H41.S.II.CTF...SPita-p24Pita-H42....I.CNFH.Y.Pita-p25Pita-H43P...I.CNF.RY.Pita-p26Pita-H44P...ISCNFH..SPita-p27Pita-H45.SVIIS.NFH..SPita-p28Pita-H46PSVIISCTF...S

“.”代表與第一行氨基酸相同; “*”功能位點。

“.” Indicates the same as the amino acid of the first line; “*” Indicates the functional locus.

表3Pita抗性基因在云南地方水稻品種各亞種和生態(tài)類型中的分布

Table 3. Distribution of Pita resistance genes in different subspecies and ecotypes.

群體類型Grouptype材料數(shù)No.ofaccessions攜帶G樣品數(shù)No.ofvarietiescarryingGlocus頻率Frequency/%總體Totalpopulation2186127.98秈稻indica772735.06粳稻japonica1413424.11水稻Rice1454531.03陸稻Uplandrice731621.92黏稻Non-glutinousrice1695230.77糯稻Glutinousrice49918.37

根據(jù)前人結(jié)果，2752位出現(xiàn)堿基G的為抗性基因，出現(xiàn)T的為感病基因[12]。在46種單倍型中，Pita-H1、Pita-H3、Pita-H4、Pita-H8、Pita-H9、Pita-H13、Pita-H14、Pita-H18、Pita-H19、Pita-H22、Pita-H23、Pita-H34、Pita-H42、Pita-H43等14種為抗性單倍型，在2752位為G，攜帶抗性基因，合計61個品種，占27.98%，比中國其他地區(qū)高[11]，但比我們用分子標記YL155/YL87和YL183/YL87檢測的低[16]。值得注意的是，61個攜帶抗性基因的品種中有39個(占63.93%)與越南抗性品種Tetep序列一致，表明它們可能是同源的，而與越南抗性品種Tetep序列不一致的品種可能是云南特有或Tetep型的變異類型。

根據(jù)此段序列，理論上可翻譯成202個氨基酸，所有供試材料間存在13個氨基酸位點的差異，與越南抗性品種Tetep對比，存在0～10個氨基酸的差異，可歸為28種蛋白質(zhì)類型，類型較豐富(表2)。

為了了解各蛋白類型間的關(guān)系，根據(jù)202個氨基酸序列進行了系統(tǒng)進化分析。利用軟件MEGA(版本5.1)中的Maxinum-Likelihood, Mininum-Evolution, Neighbor-Joining等3種分析方法得到的系統(tǒng)樹完全一致，本研究給出Neighbor-Joining法Pita基因系統(tǒng)進化樹(圖1)。由圖1可以看出，云南水稻地方品種可分兩大枝，第一大枝包含了不攜帶Pita抗性基因的單倍型Pita-p16、Pita-p17、Pita-p18、Pita-p19、Pita-p20、Pita-p21、Pita-p22、Pita-p23、Pita-p26、Pita-p27、Pita-p28，品種數(shù)量少；其余單倍型歸為第二枝，包含了云南大多數(shù)品種，是云南的主體，有攜帶抗性基因的，也有不抗的。第二枝中抗感品種混合在一起，這意味著Pita抗性基因可能來源于野生稻，也可能來源于感病品種的突變,即二次起源。在第二枝中，抗性單倍型Pita-p4、Pita-p10、Pita-p12、Pita-p13比Tetep更接近樹基，說明Tetep型(云南的多數(shù)抗性品種)起源可能更晚些。

2.2Pita抗性基因在水稻亞種和生態(tài)型中的分布

功能位點2752位攜帶G的云南地方稻品種在秈粳亞種間、水陸稻間、黏糯稻間的分布存在明顯的差異(表3)，秈稻中的頻率為35.06%，粳稻中為24.11%，水稻中31.03%，陸稻中21.92%，黏稻中30.77%，糯稻中18.37%。說明Pita抗性基因在水稻各亞種和生態(tài)型中的分布是不平衡的。

2.3Pita抗性基因在云南的地理分布

218個材料來源14個州市58縣市(表4)，其中13個州市36縣(市)檢測到了Pita抗性基因，而西雙版納州、紅河州、文山州等南部邊緣地區(qū)頻率高于其他地區(qū)。在檢測到Pita抗性基因的縣(市)中，有的縣頻率較高，呈小集中的特點。如永勝縣、鹽津縣、廣南縣、墨江縣、西盟縣等較為集中，特別是保山市的各縣都檢測到了抗性基因?？梢姡琍ita抗性基因在云南呈現(xiàn)廣泛分布，小集中的特點。在云南，海拔是稻種類型分布最重要的影響因子，Pita抗性基因在不同海拔地區(qū)的分布見表5。海拔1200-2200 m地區(qū)Pita抗性基因分布頻率相對較高。值得一提的是，海拔2200 m上有7個品種，卻沒有1個品種攜帶抗性基因，可能是材料少造成的，也可能是這一區(qū)域的品種不攜帶抗性基因，需要加大材料數(shù)目研究后才可得知。

3討論

Pita抗性基因標記YL155/YL87和YL183/YL87設(shè)計在內(nèi)含子中，利用了分子標記與功能位點的連鎖關(guān)系，鑒定一般需2個PCR。Wang等[18]用該Pita-InDel分子標記篩選來自全球的1790份水稻種質(zhì)資源，其中183份攜帶類抗病基因，經(jīng)測序證實148份材料功能位點為G，攜帶抗性基因，而29份攜帶T，為感病基因，鑒定準確率為80.87%，存在一定的誤差。李進斌等[16]也曾用Pita引物YL155/YL87和YL183/YL87對云南稻種資源Pita基因進行鑒定，攜帶抗病基因材料高達40.9%，而本研究對功能位點測序結(jié)果表明抗病基因材料占27.98%，用Pita-InDel分子標記篩選存在較大誤差。Wang等[18]對163份功能位點為G的材料進行接種鑒定，發(fā)現(xiàn)有4份盡管攜帶抗病基因但表現(xiàn)感病，可能由抗病信號轉(zhuǎn)導元件的突變所致，準確率為97.55%。可見，利用測序方法直接鑒定功能位點，結(jié)果直觀準確，在測序技術(shù)成熟與普及的今天不失為Pita基因鑒定首選方法。

表4Pita抗性基因在云南不同地區(qū)和縣(市)的分布

Table 4. Distribution of Pita resistance genes in Yunnan different regions.

地點Location材料數(shù)No.ofaccessions抗性基因數(shù)No.ofresistancegenes頻率Frequency/%地點Location材料數(shù)No.ofaccessions抗性基因數(shù)No.ofresistancegenes頻率Frequency/%西雙版納州Xishuangbanna21838.10保山市Baoshan14535.58 勐臘縣Mengla20 騰沖縣Tengchong72 勐?？hMenghai112 昌寧縣Changning21 景洪市Jinghong83 龍陵縣Longling21普洱市Pu'er521732.69 隆陽區(qū)Longyang31 孟連縣Menglian93玉溪市Yuxi13323.08 瀾滄縣Lancang81 新平縣Xinping82 西盟縣Ximeng53 峨山縣Eshan21 江城縣Jiangcheng51 江川縣Jiangchuan20 寧洱縣Ning’er31 易門縣Yimen10 墨江縣Mojiang218昆明市Kunming2150.00 景東縣Jingdong10 富民縣Fumin21紅河州Honghe16637.50曲靖市Qujing3133.33 金平縣Jinping42 富源縣Fuyuan10 屏邊縣Pingbian72 師宗縣Shizong10 紅河縣Honghe11 麒麟?yún)^(qū)Qilin11 開遠市Kaiyuan31昭通市Zhaotong13430.77 彌勒縣Mile10 巧家縣Qiaojia10文山州Wenshan12541.67 鎮(zhèn)雄縣Zhenxiong10 富寧縣Funing10 彝良縣Yiliang21 文山縣Wenshan52 大關(guān)縣Daguan30 廣南縣Guangnan63 鹽津縣Yanjin32臨滄市Lincang36616.67 威信縣Weixin31 滄源縣Cangyuan20大理市Dali3133.33 雙江縣Shuangjiang21 大理市Dali11 耿馬縣Gengma122 劍川縣Jianchuan10 鎮(zhèn)康縣Zhenkang41 云龍縣Yunlong10 臨翔區(qū)Linxiang10麗江市Lijiang12325.00 永德縣Yongde101 永勝縣Yongsheng33 云縣Yunxian31 寧蒗縣Ninglang30 鳳慶縣Fengqing20 玉龍縣Yulong30德宏州Dehong20420.00 華坪縣Huaping30 瑞麗縣Ruili61迪慶州Diqing100 芒市Mangshi20 維西縣Weixi10 隴川縣Longchuan20總計Total2186127.98 盈江縣Yingjiang52 梁河縣Lianghe51

目前的研究表明普通野生稻中有攜帶Pita抗

*抗性單倍型。

* Indicates the resistant haplotypes.

圖1云南地方水稻品種Pita基因功能片段編碼的29種蛋白單倍型系統(tǒng)進化關(guān)系

Fig. 1. Phylogenetic tree constructed with the 29 protein haplotypes encoded by Pita genes from Yunnan rice landraces.

表5Pita抗性基因在云南不同海拔地區(qū)的分布

Table 5. Distribution of Pita resistance genes at different elevation in Yunnan.

海拔Elevation/m材料數(shù)No.ofaccessions抗性基因數(shù)No.ofresistancegenes比例Percentage/%<80020630.0801-1200852023.51201-1600732331.51601-2000281035.72001-22005360.0>2200700.0

性基因的材料[15,19]，普通野生稻是栽培稻Pita抗性基因的來源之一，栽培稻與野生稻進行基因交流可能是重要的原因之一。云南南部的景洪普通野生稻攜帶Pita抗性基因，巧合的是西雙版納州及周邊的熱帶地區(qū)紅河州、文山州Pita抗性基因頻率明顯高于其他地區(qū)，可能是栽培稻與野生稻進行基因交流造成的。據(jù)此推測云南東南部以南地區(qū)(越南、老撾等)稻種中可能也存在較高頻率的Pita抗性基因，這需要進一步的分析才可得知。

R基因的進化是對病原強加到植物上的選擇壓力所做出的回應[20]。云南稻瘟病菌群體遺傳多樣性水平較高[21,22]，云南水稻地方品種在Pita基因上存在豐富的變異類型，這可能與云南稻瘟病菌復雜相關(guān)。

參考文獻：

[1]Huang E, Hwang S, Chiang Y, Lin T. Molecular evolution of thePi-tagene resistant to rice blast in wild rice (Oryzarufipogon).Genetics, 2008, 179: 1527-1538.

[2]Jia Y, Martin R. Identification of a new locusPtr(t) required for rice blast resistance genePi-ta-mediated resistance.MolPlantMicrobeInteract, 2008, 21: 396-403.

[3]Lee S, Costanzo S, Jia Y, Olsen K M, et al. Evolutionary dynamics of the genomic region around the blast resistance genePi-tain AA genomeOryzaspecies.Genetics, 2009, 183: 1315-1325.

[4]Wang X, Jia Y, Shu Q Y, et al. Haplotype diversity at thePi-talocus in cultivated rice and its wild relatives.Phytopathology, 2008, 98: 1305-1311.

[5]時克, 雷財林, 程治軍, 等. 稻瘟病抗性基因Pita和Pib在我國水稻主栽品種中的分布. 植物遺傳資源學報, 2009, 10(1): 21-26.

Shi K, Lei C L, Cheng Z J, et al. Distribution of two blast resistance genesPitaandPibin major rice cultivars in China.JPlantGeneticResour, 2009, 10(1): 21-26.(in Chinese with English abstract)

[6]Moldenhauer K A K, Lee F N, Gibbons J W, et al. Registration of ‘Ahrent’ rice.CropSci, 2007, 47: 446-447.

[7]Rybka K, Miyamoto M, Ando I, et al. High resolution mapping ofindica-derived rice blast resistance genesPi-ta2 andpi-taand a consideration of their origin.MolPlantMicrobe-Interact, 1997, 10: 517-524.

[8]李進斌, 李成云, 陳艷, 等. 二十二個抗稻瘟病基因在云南的利用價值評價. 植物保護學報, 2005, 32(2): 113-119.

Lin J B, Li C Y, Chen Y, et al. Evaluation of twenty-two blast resistance genes inYunnan using monogenetic rice lines.ActaPhytophylSin, 2005, 32(2): 113-119. (in Chinese with English abstract)

[9]Jia Y, Wang Z, Singh P. Development of dominant rice blastPi-taresistance gene markers.CropSci, 2002, 42: 2145-2149.

[10]Jia Y, Wang Z, Robert G. RicePi-tagene confers resistance to the major pathotypes of the rice blast fungus in the United States.Phytopathology, 2004, 94: 296-301.

[11]楊杰, 楊金歡, 王軍, 等. 稻瘟病抗病基因Pita和Pib在中國水稻地方品種中的分布. 華北農(nóng)學報, 2011, 26(3): 1-6.

Yang J, Yang J H, Wang J, et al. Distribution of two blast resistant genesPitaandPibin landrace rice in China.ActaAgricBoreali-Sin, 2011, 26(3): 1-6.(in Chinese with English abstract)

[12]Bryan G T, Wu K S, Farrall L, et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance genePi-ta.PlantCell, 2000, 12(11): 2033-2046.

[13]Thakur S， Gupta Y K， Singh P K, et al. Molecular diversity in rice blast resistance genePi-tamakes it highly effective against dynamic population ofMagnaportheoryzae.FunctIntegrGenom, 2013, 13: 309-322.

[14]黃燕紅,孫新立,王象坤. 中國栽培稻遺傳多樣性中心和起源研究. 植物遺傳資源學報, 2005, 6(2): 125-129.

Huang Y H, Sun X L, Wang X K. Study on the center of genetic diversity and its origin of cultivated rice in China.JPlantGeneticResour, 2005, 6(2): 125-129.(in Chinese with English abstract)

[15]趙國珍, 蔣春苗, 劉吉新, 等. 云南野生稻抗稻瘟病Pi-ta基因的檢測及分析. 中國水稻科學, 2014, 28(6): 675-680.

Zhao G Z, Jiang C M, Liu J X, et al. Identification and analysis on the rice blast resistance genePi-tain wild rice from Yunnan, China.ChinJRiceSci, 2014, 28(6): 675-680.(in Chinese with English abstract)

[16]李進斌, 王甜, 許明輝. 云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-ta和Pib的鑒定. 中國水稻科學, 2012, 26(5): 593-599.

Li J B, Wang T, Xu M H. Identification ofPitaandPi-bgenes for rice blast resistance of rice landraces from Yunnan Province.ChinJRiceSci, 2012, 26(5): 593-599.(in Chinese with English abstract)

[17]Doyle J J, Doyle J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue.Focus, 1990, 12(1): 13-15.

[18]Wang X, FjeIlsrom R, Jia Y, et al. Characterization ofPitablast resistance gene in an international rice core collection.PlantBreeding, 2010(129): 491-501.

[19] Huang C L, Hwang S Y, Chiang Y C, et al. Molecular evolution of thePi-tagene resistant to rice blast in wild rice (Oryzarufipogon).Genetics, 2008, 179(3): 1527-1538.

[20]Rausher M D. Co-evolution and plant resistance to natural enemies.Nature, 2001, 41: 857-864.

[21]Li J B, Yang J, Liu L, He H M, He X H, Zhu Y Y, Li C Y. Geographic distribution of avirulence genes in rice blast fungus in Yunnan Province, China.JResourEcol, 2011, 2(2): 181-185.

[22]李進斌, 羅朝喜, 李成云, 等. 云南省近年稻瘟病菌生理小種的組成和分布. 植物保護, 2001, 27(2): 12-14.

Li J B, Luo C X, Li C Y, et al. Race composition and distribution ofMagnaporthegriseaCavara in Yunnan Province in recent years.PlantProt, 27(2): 12-14.(in Chinese with English abstract)

Sequence Variation of Functional Fragment inPitaGene for Rice Blast Resistance in Yunnan Rice Landraces

MA Ji-qiong#, YANG Yi#, SUN Yi-ding, WANG Yan-yan, XU Ming-hui*

(InstituteofBiotechnologyandGeneticResources,YAAS,KeyLaboratoryofBiotechnologyResearchofYunnanProvince/KeyLaboratoryofSouthwesternCropGeneResourcesandGermplasmInnovationofMinistryofAgriculture,Kunming650223,China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author， E-mail： xuminhui@sohu.com)

MA Jiqiong, YANG Yi, SUN Yiding, et al. Sequence variation of functional fragment inPitagene for rice blast resistance in Yunnan rice landraces. Chin J Rice Sci, 2016, 30(3): 265-272.

Abstract:Identification and analysis of the variations of rice blast resistance gene sequence is the basis to dig into the genetic resources of the rice blast resistance. In this paper, 609 bases in the second code functional region of the rice blast resistance gene Pita were analyzed using 218 rice landraces from 56 counties of Yunnan Province. A total of 18 nucleotide variations were found in the sequence and the ORFs of 218 rice accessions were grouped into 46 haplotypes and 28 proteins types. Pita-H1 (17.89%), Pita-H2(29.82%) and Pita-H6(20.18%) were high-frequency types in Yunnan, while other types were at low frequency (0.46%-3.67%). So the advantage haplotypes in Yunnan were Pita-H1, Pita-H2 and Pita-H6 (totally 67.89%). A total of 61 rice landraces carrying the resistance gene Pita, the base functional site 2752 was G with the rate of 27.98%. The sequence of Pita in 39 resistance varieties was identical with the sequence obtained from the Vietnamese resistance variety Tetep. The distribution of resistance gene Pita in rice subspecies or ecotypes was unbalanced. The distribution frequency of indica was 35.06%, japonica 24.11%, rice 31.03%, upland rice 21.92%, no-glutinous rice 30.77%, glutinous rice 18.37%. The distribution of blast resistance gene Pita in Yunnan Province featured wide distribution and small concentration. Pita gene was detected in 36 counties of Yunnan Province. The distribution frequency in southern Yunnan was higher than other area. Moreover, some counties were of high distribution frequency. The resistance gene Pita was not detected in seven rice varieties growing over 2200 m elevation.

Key words：rice； Yunnan； blast； Pita

DOI:10.16819/j.1001-7216.2016.5188

收稿日期:2015-12-22； 修改稿收到日期: 2016-01-08。

基金項目:國家基礎(chǔ)研究計劃資助項目(2012FY110200)； 國家自然科學基金資助項目(31360331)。

中圖分類號:S435.111.4+1;S511.034

文獻標識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)03-0265-08

中國水稻科學(Chin J Rice Sci),2016,30(3):265-272

http://www.ricesci.cn