葉衛(wèi)軍　胡時開　吳立文　郭龍彪　錢前

(1浙江大學 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院， 杭州 310058； 2中國水稻研究所， 杭州 310006；3 中國農(nóng)業(yè)科學院 深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所， 廣東 深圳 518120；#共同第一作者； *通訊聯(lián)系人， E-mail: qianqian188@hotmail.com)

水稻遲抽穗突變體dth9的遺傳分析與基因定位

葉衛(wèi)軍1,2,#胡時開2,3,#吳立文2郭龍彪2錢前2,3,*

(1浙江大學 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院， 杭州 310058；2中國水稻研究所， 杭州 310006；3中國農(nóng)業(yè)科學院 深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所， 廣東 深圳 518120；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人， E-mail: qianqian188@hotmail.com)

葉衛(wèi)軍， 胡時開， 吳立文， 等. 水稻遲抽穗突變體dth9的遺傳分析與基因定位. 中國水稻科學， 2016， 30(3)： 232-238.

摘要:在EMS誘變的93-11突變體庫中篩選到一個穩(wěn)定遺傳的遲抽穗突變體dth9 (days to heading 9)。該突變體的抽穗期比野生型延長了50d左右，其他農(nóng)藝性狀基本無異。遺傳分析表明遲抽穗性狀受一個隱性核基因控制。以突變體dth9與日本晴和武運粳7號雜交構(gòu)建的F2分離群體作為定位群體，利用SSR標記和新開發(fā)的8個InDel標記，將DTH9定位在第9染色體著絲粒附近D9-9和D9-17之間240 kb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)域尚未發(fā)現(xiàn)與抽穗期有關(guān)的基因。此外，實時熒光定量PCR結(jié)果表明，在突變體dth9中與抽穗期相關(guān)基因的表達量顯著降低。

關(guān)鍵詞:水稻；抽穗期； 遺傳分析； 基因定位

水稻(OryzasativaL.) 作為世界上最主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)受到多種因素的影響。抽穗期是水稻重要農(nóng)藝性狀之一，抽穗期的長短直接決定了水稻品種適宜種植區(qū)域和種植時間。此外，適當?shù)某樗肫诳梢允顾驹谔囟ǖ纳鷳B(tài)條件下高效地利用當?shù)氐墓鉄豳Y源，決定了水稻品種的增產(chǎn)潛力和米質(zhì)。所以，抽穗期的長短不僅決定了水稻品種的種植區(qū)域，也關(guān)系到水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，是水稻育種的重要目標之一[1]。

抽穗期屬于數(shù)量性狀，其遺傳基礎(chǔ)較為復雜，受主效基因和微效多基因的共同控制[2]。但也有研究發(fā)現(xiàn)水稻抽穗期既有表現(xiàn)為連續(xù)變異的數(shù)量性狀遺傳，也表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳[3]，且不同品種可能會表現(xiàn)出不同的遺傳特性，而同一品種的抽穗期在不同光溫條件下也表現(xiàn)各異，這些都使得抽穗期遺傳機制更為復雜。近年來，隨著新的分子標記技術(shù)的開發(fā)和應用，國內(nèi)外科研工作者對水稻抽穗期的研究取得了重大進展。目前，已有618個與水稻抽穗期相關(guān)的位點被定位到各個染色體上，其中，第3染色體上最多，最少的是第10染色體[4](http://archive.gramene.org/db/qtl)，并表現(xiàn)為區(qū)域分布。這些基因已有部分先后被克隆，如Hd1、Hd3a、Ehd1、Hd6、Ehd3、Ehd4、Ghd7、Ghd8[5-12]等(http://www.ricedata.cn/gene/index.htm)。這些基因的發(fā)現(xiàn)和功能分析為充分認識水稻抽穗期的遺傳機理奠定了堅實的基礎(chǔ)。

盡管目前已經(jīng)在水稻抽穗期的研究工作中獲得了巨大的進步，但水稻抽穗期受到內(nèi)部復雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡和外界環(huán)境條件的共同作用，其調(diào)控機制相當復雜，目前我們所了解的還很少，尤其是內(nèi)部的調(diào)控網(wǎng)絡以及基因間的互作關(guān)系，這些都需要進一步的深入研究。而更多相關(guān)基因的克隆將會完善水稻抽穗期的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡，加深對水稻抽穗期的認識，并對品種改良和擴大品種適宜種植區(qū)域有著重要的參考價值。本研究從秈稻93-11的突變體庫中篩選獲得一個穩(wěn)定遺傳的遲抽穗突變體dth9 (daystoheading9)，我們對該突變體的表型及主要農(nóng)藝性狀進行考查，并對dth9進行遺傳分析和基因定位，將該基因定位在第9染色體的著絲粒附近，以期為該基因的克隆、功能分析及應用提供參考。

1材料與方法

1.1實驗材料

以甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate,EMS)誘變93-11種子，在M2代獲得一個遲抽穗表型突變體dth9，經(jīng)多代自交后穩(wěn)定遺傳，遲抽穗性狀在杭州和海南都能穩(wěn)定表現(xiàn)，表明該性狀可穩(wěn)定遺傳。材料種植于中國水稻研究所試驗基地，常規(guī)水肥管理。

1.2突變體表型分析

突變體dth9和野生型93-11于2013年種植于中國水稻研究所試驗基地和海南南繁基地。抽穗期的調(diào)查方法：當株系中50%植株抽穗即認定為其抽穗，從播種到抽穗的天數(shù)記為抽穗期。在成熟期對突變體和野生型的株高、單株有效穗數(shù)、穗長、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)等重要的農(nóng)藝性狀進行調(diào)查，每個性狀至少3次重復，并利用MicrosoftExcel軟件進行統(tǒng)計分析。

1.3遺傳分析

2013年夏季在杭州將突變體dth9與野生型品種93-11進行正反交雜交配組，同年冬季將F1種植于海南陵水，并觀察兩個組合的F1表型。自交獲得F2種子，2014年夏季將這兩個F2群體種植于杭州富陽，并分別調(diào)查野生型表型和突變體表型植株數(shù)目，考查性狀分離比。

1.4遲抽穗基因定位

2013年夏季在杭州將突變體dth9與粳稻品種日本晴和武運粳7號雜交，同年冬季將F1種植于海南陵水，并觀察兩個組合的F1表型。自交獲得F2種子，2014年夏季將這兩個F2群體種植于杭州富陽，收取F2群體中全部遲熟表型單株的葉片，用于基因定位。具體實驗過程如下：從突變體dth9與日本晴衍生F2群體中首先挑選出21株表型為遲抽穗的單株用于dth9的連鎖分析。利用本實驗室均勻分布于12條染色體上的163對公共引物進行多態(tài)性篩選，共獲得140對在親本間多態(tài)性表現(xiàn)較好的引物。利用這些引物及21株單株初步確定目的基因所在的染色體位置。在與目標基因連鎖的標記附近設(shè)計引物并獲得了8對多態(tài)性較好的InDel標記(表1)。用F2群體中542株表現(xiàn)出突變體表型的單株對DTH9進行進一步的定位。為了縮小定位區(qū)間，從突變體和武運粳7號雜交獲得的F2分離群體中獲得了832株表型為突變體表型的單株，用于基因的精細定位。親本、F1及F2遺傳群體植株的總DNA提取采用CTAB法[13]。10μL的PCR體系包括：DNA模板1μL，10×PCR緩沖液1μL，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，dNTPs1μL，rTaq酶0.05μL，加ddH2O補足10μL。PCR擴增程序如下：94℃下預變性4min；94℃下變性30s，55℃～60℃下退火30s(溫度因引物不同而異)，72℃下延伸30s，40個循環(huán)；最后72℃下延伸5min。PCR產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀拍照并讀膠。

1.5抽穗期相關(guān)基因的表達分析

用總RNA提取試劑盒(Axygen)提取突變體和野生型幼穗分化前的葉片總RNA。以經(jīng)過DNaseⅠ處理過的總RNA為模板，采用實時PCR用cDNA合成試劑盒 (TOYOBO)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1 鏈。然后利用實時定量PCR(qRT-PCR)方法分析各基因在野生型和突變體中的表達量。以基因Actin1(Os03g0718100)作為內(nèi)參基因。20 μL 實時熒光定量PCR體系包括cDNA模板1 μL，2×SYBR qPCR Mix (TOYOBO) 10 μL，正反引物(10 μmol/L) 各1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序如下：95℃下預變性1.5 min；95℃下 10 s，60℃下 30 s，72℃下20 s，40個循環(huán)。以 2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量[14]。用于檢測與抽穗期相關(guān)基因表達量的引物見表2。

表1本研究中精細定位所用引物

Table 1. Primers used for fine mapping in the study.

分子標記Marker正向引物(5'-3')Forwardprimer(5'-3')反向引物(5'-3')Reverseprimer(5'-3')大小Size/bp物理位置Physicalposition/MbD9-4AGCCTCATACCTCCCACACGCCTGGAAGACAATCAA1513.047D9-7AAAGATTCTCAAGGCCAGTCTATCTAGATCGTGGCCCA1723.583D9-8TTGCATGGTCACGTTCCTTGATTGCGGAGTGATGAG2603.608D9-9CCAATGTAGCAGCCGTAACGTTGAGGATTCAGTGGT1293.983D9-17AATCGGTGAATGTCCTTGGAAACATCCATGCCTTGC1244.223D9-19TCCATCGCATTTGAGTGTAAGTTAGTAGGCGGAAGG2234.332D9-12GGGGTGATGCTGGTTTATAAGGGTCTCATCTGGAAAA2554.354D9-2GGCTTCTCAACCAAGGTAAACGCATCAAATCAGGCAC2054.554RM444GCTCCACCTGCTTAAGCATCTGAAGACCATGTTCTGCAGG1625.925

PCR產(chǎn)物大小和物理位置參考日本晴的序列。

The sizes of PCR products and the markers’ physical positions are based on the sequence of Nipponbare.

表2抽穗期相關(guān)基因表達量分析引物

Table 2. Primers used for qRT-PCR analysis of genes associated with heading date.

分子標記 Marker 正向引物(5'-3')Forwardprimer(5'-3')反向引物(5'-3')Reverseprimer(5'-3')Ghd7AGGTGCTACGAGAAGCAAATCCGGGCCTCATCTCGGCATAGGhd8CGTGCAATGGTTTAGACTAAAGAACAGCATCAGCATCAACAAHd6ACGTGAAGCTATGGCACATCTGTGGTCGTGCTCTGCTATTHd3aGCTAACGATGATCCCGATCCTGCAATGTATAGCATGCHd1CGTTTCGCCAAGAGATCAGAGATAGAGCTGCAGTGGAGAACRFT1CGTCCATGGTGACCCAACACCGGGTCTACCATCACGAGTEhd1AATCGATTCCAACAACAAGCAATGTCGAGAGCGGTGGATGAOsMADS51GTCGGCAAGCTCTACGAGTACTCGCGAATTGCTGATAGCGATCAOsActin1GCTATGTACGTCGCCATCCAGGACAGTGTGGCTGACACCAT

2結(jié)果與分析

2.1突變體的表型分析

與野生型93-11相比，突變體dth9的抽穗期延長了50 d左右。在苗期和分蘗期，野生型和突變體的表型基本無差異。但當93-11抽穗時，DTH9仍處于分蘗期；當93-11處于成熟期時，DTH9處于孕穗期(圖1-A)。突變體dth9在浙江杭州(長日照)的抽穗期要長于海南陵水(短日照)，表明該基因在長日照下對抽穗期的影響可能更大。其他主要農(nóng)藝性狀與野生型相比無顯著差異(表 3)。

2.2突變體的遺傳分析

2.3遲抽穗基因定位

A-93-11和突變體的植株表型，標尺=20 cm。B-DTH9成熟期表型，標尺=20 cm。

A, Phenotypes of the wild-type and the heading-delayed mutantDTH9, bar=20 cm. B， Phenotype ofDTH9 at mature stage, bar=20 cm.

圖1野生型和遲抽穗突變體dth9的表型

Fig. 1. Phenotypes of the wild-type and the heading-delayed mutantdth9.

表3野生型和突變體的主要農(nóng)藝性狀比較(浙江杭州，2013年)

Table 3. Comparison of major agronomic traits between the wild-type and the mutant (Hangzhou, Zhejiang, 2013).

農(nóng)藝性狀Agronomictrait野生型Wild-type突變體Mutant株高Plantheight/cm118.67±1.52115.30±0.58*穗長Paniclelength/cm23.05±0.9121.33±1.15有效穗數(shù)No.ofeffectivepanicles8.3±0.58.0±0.8抽穗期Headingdate/d98.0±0.8147.3±2.5**每穗實粒數(shù)No.offilledgrainsperpanicle171.5±4.0173.0±2.7結(jié)實率Seed-settingrate/%93.72±0.0192.20±0.01千粒重1000-grainweight/g31.50±0.5731.57±0.40一次枝梗數(shù)Primaryrachisbranchnumber12.0±0.712.6±0.6二次枝梗數(shù)Secondaryrachisbranchnumber36.8±1.337.3±0.6

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示(n=3)。*，**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著(t檢驗)。

Figures are shown as mean ±SD(n=3).*,**Significant at 0.05 and 0.01 levels byt-test, respectively.

表4遲抽穗突變體dth9的遺傳分析

Table 4. Genetic analysis of the dth9 mutant.

組合CrossF1表型PhenotypeofF1F2正常植株數(shù)No.ofnormalplants遲抽穗植株數(shù)No.ofheading-delayedplants總數(shù)Totalχ2DTH9/93-11正常抽穗期Normal6622088700.28193-11/DTH9正常抽穗期Normal3891195080.343

1-日本晴； 2-93-11； 3-F1； 4～24-F2群體中突變體表型的單株； 7-單交換單株。

1, Nipponbare; 2, 93-11; 3, F1; 4-24, Individuals with mutant phenotype in the F2population; 7, Single crossing-over plant.

圖2利用標記RM444對F2群體中21個突變體單株進行基因型分析

Fig. 2. Genotype analysis of the 21 F2plants with mutant phenotype using the marker RM444.

圖3DTH9基因的精細定位

Fig. 3. Fine mapping of DTH9.

從dth9與日本晴雜交獲得的F2群體中，隨機挑選21株遲抽穗表型的單株，并篩選了140對在親本間多態(tài)表現(xiàn)較好的引物用于DTH9的連鎖分析。發(fā)現(xiàn)第9染色體著絲粒附近SSR標記RM444與DTH9表現(xiàn)出連鎖現(xiàn)象(圖2)。在連鎖標記附近設(shè)計引物獲得了1對多態(tài)性良好的InDel連鎖標記D9-4。用這兩對引物對F2群體中93株遲抽穗表型的單株進行基因型分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩個標記處都有交換發(fā)生，但沒有單株在兩個標記處同時發(fā)生交換。因此，我們將DTH9初步定位在標記D9-4和RM444中間。為了進一步精細定位DTH9基因，我們在D9-4和RM444標記之間開發(fā)了7對有多態(tài)性的InDel標記。從dth9和日本晴以及dth9和武運粳7號雜交衍生的F2群體中共獲得了1374個遲抽穗表型的單株，利用這些單株最終將該基因精細定位在D9-9和D9-17之間大約240 kb的區(qū)間內(nèi)，橫跨AP005590 和AP005738 這兩個BAC(圖3)。

2.4抽穗期相關(guān)基因的表達分析

為了研究該基因突變后對其它抽穗期相關(guān)基因表達的影響。我們通過熒光定量PCR技術(shù)對Hd1、Hd3a、Ghd7等與抽穗期相關(guān)基因的表達進行分析。結(jié)果顯示，與野生型相比，所有檢測基因的表達量在突變體中都明顯下調(diào)(圖4)。其中，Hd6在野生型和突變體中的表達差異達到了顯著水平，Ghd7、Ghd8、Hd3a、Hd1、RFT1、Ehd1和OsMADS51的表達差異達到了極顯著水平，且Hd1、RFT1、OsMADS51在突變體中幾乎不表達。說明DTH9的突變影響其他抽穗期相關(guān)基因的表達。

3討論

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示(n=3)。*，**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著(t檢驗)。

Figures were shown as mean ± SD (n=3).*,**Significant at 0.05 and 0.01 levels byt-test, respectively.

圖4抽穗期相關(guān)基因在dth9和野生型中的表達差異

Fig. 4. Expression levels of genes associated with heading date in the dth9 mutant and the wild-type.

水稻是重要的糧食作物，且作為單子葉的模式植物，其功能基因組學研究受到越來越來越多科研工作者的關(guān)注[15]。抽穗期是水稻重要的農(nóng)藝性狀之一，適宜的抽穗期對擴大水稻品種的種植區(qū)域和提高產(chǎn)量有著重要意義。更多水稻抽穗期相關(guān)基因的克隆對充分認識抽穗期的遺傳機制和品種改良都有重大意義。迄今已克隆了20多個水稻抽穗期基因，還精細定位了9個抽穗期QTL[16]，如dth.1a、Hd9、Hd8、Hd16、Hd3b、Hd4、Hd2[17-23]。Hd1是水稻中第一個通過圖位克隆方法克隆的水稻抽穗期基因，編碼與擬南芥CO同源的基因，表現(xiàn)為短日照下促進開花，長日照下抑制開花[5]。Hd3a編碼一個與擬南芥中促進開花的FLOWERINGLOCUST(FT)基因高度相似的基因。在短日照條件下，Hd3a的轉(zhuǎn)錄水平直接影響水稻的抽穗期，且Hd3a的表達受到Hd1的調(diào)控[6]。Ehd1編碼一種B型反應調(diào)節(jié)子，與水稻中未知的組蛋白激酶形成雙組分信號級聯(lián)傳遞通路，調(diào)控水稻的開花，且Ehd1能獨立于Hd1調(diào)控水稻抽穗期[7]。水稻抽穗期基因除了直接調(diào)控抽穗期外，部分基因還表現(xiàn)出一因多效的現(xiàn)象。Ghd7是一個同時控制株高、每穗粒數(shù)和抽穗期的基因，編碼一個CCT結(jié)構(gòu)域蛋白。研究表明，在長日照條件下增強Ghd7的表達，能延長抽穗期，增加株高，使稻穗變大[11]。Ghd8編碼轉(zhuǎn)錄因子CCAAT盒結(jié)合蛋白的HAP3亞基，同時調(diào)控水稻產(chǎn)量、株高和抽穗期，并在長日照下下調(diào)Ehd1和Hd3a的轉(zhuǎn)錄水平[12,24]。此外，Ghd8上調(diào)水稻分蘗和側(cè)枝發(fā)生基因MOC1的表達，從而調(diào)控水稻的分蘗數(shù)、一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)，進而影響產(chǎn)量[24]。另外，也有科研工作者將水稻抽穗期基因應用于育種實踐[25]。中國科學院遺傳和發(fā)育生物學研究所林少楊研究組將Hd1導入到越光品種中，新品種Koshihikari H3號的種植區(qū)域由原品種的北緯35.0°～37.5°延伸至北緯10°，且產(chǎn)量增加了30%。

本研究從93-11為背景的突變體庫中篩選到一個遲抽穗突變體dth9，并進行了遺傳分析和精細定位。遺傳分析表明該性狀受一對隱性核基因控制，并將DTH9定位在第9染色體著絲粒附近，位于標記D9-9和D9-17之間約240 kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)段內(nèi)未見抽穗期相關(guān)基因的報道。因此，DTH9是一個新的抽穗期基因。由于該區(qū)段靠近著絲粒，因此需要更大的定位群體進行進一步的精細定位。通過對突變體和野生型中抽穗期相關(guān)基因表達的分析，發(fā)現(xiàn)所有檢測基因的表達量在突變體中均下調(diào)，表明該基因的突變影響了其他相關(guān)基因的表達。本研究為該基因的進一步克隆和功能分析提供參考。該突變體也可作為種質(zhì)資源來改良水稻品種抽穗期，比如解決雜交配組時抽穗期差異太大而無法配組的問題。

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Genetic Analysis and Gene Mapping of a Heading-delayed Mutantdth9 in Rice (OryzasativaL.)

YE Wei-jun1,2, #, HU Shi-kai2, 3,#, WU Li-wen2, GUO Long-biao2, QIAN Qian2,3,*

(1College of Agriculture & Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;2China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2Agricultural Genomics Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: qianqian188@hotmail.com)

YE Weijun, HU Shikai, WU Liwen, et al. Genetic analysis and gene mapping of a heading-delayed mutantdth9 in rice (OryzasativaL.). Chin J Rice Sci, 2016, 30(3): 232-238.

Abstract:A heading-delayed mutant, dth9 (days to heading 9)was identified from an ethyl methylsulfonate (EMS)-induced 93-11 mutant library. The heading date of dth9 delayed about 50 days compared to the wild-type and there was no significant difference in other agronomic traits. Genetic analysis showed that the phenotype of dth9 was controlled by a single recessive nuclear gene. To map this gene, two F2populations were generated by crossing the dth9 mutant with Nipponbare or Wuyunjing 7 as mapping populations. By using SSR markers and eight new designed InDel markers, DTH9 was narrowed to a 240kb interval between the markers D9-9 and D9-17 near the centromere of chromosome 9, there were no reports about genes associated with heading date in this interval. In addition, the expression levels of genes related to heading date were significantly decreased in dth9 by quantitative real-time PCR analysis.

Key words:rice; heading date; genetic analysis; gene mapping

DOI:10.16819/j.1001-7216.2016.5156

收稿日期:2015-10-26； 修改稿收到日期: 2015-12-19。

基金項目:國家自然科學基金資助項目(31501279,31521064,31271700)； 國家973計劃資助項目(2013CBA01405)； 中國博士后科學基金資助項目(2015M570181)； 深圳市科技計劃資助項目(JCYJ20150630165133402)。

中圖分類號:Q343.5;S511.01

文獻標識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)03-0232-07

中國水稻科學(Chin J Rice Sci),2016,30(3):232-238

http://www.ricesci.cn