張宏根　王茂宇　張麗佳　胡雅　馬佳琦　張翼帆　湯述翥　梁國(guó)華　顧銘洪

(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州225009； #共同第一作者；*通訊聯(lián)系人， E-mail：sztang@yzu.edu.cn)

水稻類病斑突變體wy3的鑒定和基因定位

張宏根#王茂宇#張麗佳胡雅馬佳琦張翼帆湯述翥*梁國(guó)華顧銘洪

(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州225009；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人， E-mail：sztang@yzu.edu.cn)

張宏根，王茂宇，張麗佳，等. 水稻類病斑突變體wy3的鑒定和基因定位. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(3)： 239-246.

摘要:在粳稻品種武育粳3號(hào)栽培群體中獲得一個(gè)類病斑突變體wy3。該突變體類病斑出現(xiàn)于苗期，分蘗期擴(kuò)散至整張葉片，屬于擴(kuò)散型類病斑突變體。相比野生型，突變體wy3的株高明顯降低，有效分蘗數(shù)減少，穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率均顯著降低。遮光處理表明，突變體wy3類病斑的產(chǎn)生受自然光誘導(dǎo)。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明，類病斑部位有大量的死亡細(xì)胞。突變體wy3的光合色素含量和凈光合速率較野生型顯著降低，SOD、POD、CAT活性和MDA含量均顯著高于野生型。遺傳分析表明突變體表型受單隱性核基因控制，采用BSA將該基因初步定位在第2染色體短臂端粒附近。采用F2群體中1099株類病斑單株將基因定位在標(biāo)記W2-17和W2-18之間28kb的物理距離內(nèi)。測(cè)序結(jié)果表明，突變體wy3中的LOC_Os02g02000編碼區(qū)(CDS)第375位堿基C缺失，導(dǎo)致翻譯提前終止，突變體中該候選基因?yàn)镺sHPL3的一個(gè)新等位基因。

關(guān)鍵詞:水稻； 類病斑突變體； 基因定位

植物斑點(diǎn)葉(spotted leaf)突變體是指植物在沒有遭受病原物侵染或明顯逆境條件下在葉片或葉鞘上自發(fā)形成斑點(diǎn)的一類突變體，由于這些斑點(diǎn)與病原物侵染后產(chǎn)生的病斑非常相似，又被稱為類病變突變體(lesion simulating disease mutant,lsd)或類病斑突變體(lesion mimic mutant,lmm)[1]。類病斑突變體廣泛存在于水稻、擬南芥、玉米、大麥和大豆等植物中[2-7]。根據(jù)突變體的表型，類病斑突變體可分為起始型和擴(kuò)散型[8-10]，起始型突變 體的病斑有相對(duì)穩(wěn)定的分布位置和大小，而擴(kuò)散型突變體的病斑形成以后會(huì)很快擴(kuò)散到葉片的其他部位，甚至包括葉鞘和莖稈。已有研究表明，植物類病斑的發(fā)生主要與過敏性反應(yīng)(hypersensitive response, HR)導(dǎo)致的細(xì)胞程序性死亡以及細(xì)胞死亡途徑中自由基非正常產(chǎn)生有關(guān)[11-13]。此外，許多類病斑突變體對(duì)某些植物病原物表現(xiàn)出了一定的抗性[14-16]，能激發(fā)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)[17-18]，可以提高植株的持久、廣譜抗病性。因此，這類突變體對(duì)植物過敏反應(yīng)激活機(jī)制和植物抗病反應(yīng)機(jī)制的研究具有重要意義。

目前，水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了80多個(gè)類病斑突變[19]。其中，絕大部分呈單隱性核基因遺傳規(guī)律，也有部分表現(xiàn)為雙隱性核基因或顯性核基因遺傳規(guī)律。在這些類病斑基因中，spl5[20]、spl7[21]、spl11[22]、spl18[23]、spl28[16]、Ttml[24]等18個(gè)基因已被克隆，這些基因編碼許多不同類型的蛋白，如第一個(gè)被克隆的水稻類病變突變基因spl7編碼一個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子蛋白 (heat stress transcription factor protein, HSF)[21]，spl11編碼一個(gè) U-box/Armadillo 重復(fù)蛋白[22]，spl18編碼一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶[23]。類病斑基因的克隆與功能研究表明類病變過程非常復(fù)雜，這些基因的作用機(jī)制以及性狀表現(xiàn)各不相同，涉及到許多生化代謝過程，但突變體性狀大多與細(xì)胞程序性死亡相關(guān)[22]。

本課題組在粳稻品種武育粳3號(hào)栽培群體中獲得一個(gè)穩(wěn)定遺傳的類病斑突變體wy3，該類病斑突變是自然誘變產(chǎn)生。本研究中以wy3為材料，描述了該突變體的形態(tài)特征、生理學(xué)特性，并對(duì)該突變基因進(jìn)行了精細(xì)定位與克隆，以期為該基因的功能研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

2013年揚(yáng)州正季，在粳稻品種武育粳3號(hào)栽培群體中獲得一個(gè)類病斑突變體wy3，經(jīng)過多代連續(xù)種植，突變體類病斑表型穩(wěn)定遺傳。2014年正季揚(yáng)州，以秈稻品種Kasalath為父本與wy3雜交獲得F1，2014年冬季在海南種植F1及相關(guān)親本，成熟期收獲F1植株自交種子。2015年正季，種植突變體wy3、野生型武育粳3號(hào)及組合wy3/ Kasalath F2群體。

1.2表型鑒定

2015年正季，將突變體wy3和對(duì)照武育粳3號(hào)種植于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，小區(qū)種植，3次重復(fù)，管理與一般大田相同。全生育期觀察田間突變體的表型，包括突變體斑點(diǎn)出現(xiàn)的時(shí)期、顏色及分布情況等。成熟后隨機(jī)從小區(qū)中央選取10株考查株高、單株穗重、每株有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等性狀。

1.3光照處理實(shí)驗(yàn)

通過遮光試驗(yàn)了解光照對(duì)斑點(diǎn)發(fā)生的影響。大田條件下，在苗期用寬度約為1 cm 的錫箔紙對(duì)突變體wy3 葉片已有斑點(diǎn)和無斑點(diǎn)部位進(jìn)行遮光處理，各重復(fù)3次。分別觀察遮光15 d及恢復(fù)光照7 d后斑點(diǎn)的發(fā)生及變化情況，并拍照。

1.4突變體死亡細(xì)胞鑒定

苗期，分別取野生型正常葉片與突變體wy3發(fā)生類病斑的葉片，剪成1 cm×1 cm大小。加入臺(tái)盼藍(lán)染液(染液配方參照Yin等[25]的方法)，真空抽濾使染液進(jìn)入細(xì)胞間隙，沸水蒸沸5～8 min。室溫下靜置6～8 h后用2.5 g/mL的水合氯醛溶液脫色，直到組織完全透明為止。脫色好的葉片在體視顯微鏡下觀察、拍照。

1.5葉綠素含量測(cè)定

分蘗期，分別取野生型正常葉片與突變體wy3發(fā)生類病斑的葉片，按Lichtenthaler等[26]修正的Arnon法進(jìn)行葉綠素和類胡蘿卜素含量測(cè)定，具體操作如下：將鮮葉去掉葉脈，截取葉片中段(葉片最寬處)，擦凈組織表面污物，并吸干葉片表面附著水；準(zhǔn)確剪成2 mm條狀并稱取0.2 g鮮樣3份，分別置于3個(gè)20 mL帶蓋的玻璃管中；吸取10 mL提取液(96%乙醇)置于玻璃管中，密封并置于30℃～50℃水浴鍋中萃取3 h，此過程中需輕搖幾次。當(dāng)葉片完全變白時(shí)即可比色。比色時(shí)，以提取液為空白，在波長(zhǎng)663 nm、646 nm和470 nm下測(cè)定吸光度。每樣重復(fù)測(cè)定2次。

1.6光合作用相關(guān)指標(biāo)的鑒定

始穗期，使用Li-6400型便攜式光合測(cè)定儀于晴天上午9:00-11:00分別測(cè)定wy3及其野生型劍葉葉片的凈光合速率(net photosynthetic,Pn)、氣孔導(dǎo)度(leaf conductance,Gs)、蒸騰速率(transpiration rate,Tr)和胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration,Ci)，各測(cè)定3片具有代表性的劍葉。光合測(cè)定儀使用紅藍(lán)光源，光強(qiáng)恒定為1200 μmol/(m2·s)，溫度為30℃，CO2濃度為空氣中的濃度，濕度為大氣中的濕度。取3次重復(fù)的平均值進(jìn)行分析。

1.7抗氧化酶活性測(cè)定

分蘗期，測(cè)定突變體wy3 和對(duì)照相同部位葉片中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性和丙二醛(malonaldehyde, MDA)的含量。所有測(cè)定重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行分析。SOD活性采用SOD測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))測(cè)定，該試劑盒采用黃嘌呤氧化酶法；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[27]測(cè)定，以每1 min內(nèi)OD470變化0.01 為一個(gè)過氧化物酶活性單位(U)；CAT活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定；MDA含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測(cè)定。

1.8圖譜構(gòu)建與數(shù)據(jù)分析

采用隱性分離群體進(jìn)行遺傳分析和基因定位。在F2群體中，根據(jù)分子標(biāo)記檢測(cè)的結(jié)果，具有wy3突變親本帶型的個(gè)體賦值1，具有Kasalath帶型的個(gè)體賦值3，具有雙親帶型(雜合帶)的個(gè)體賦值2，利用MapMaker 3.0作圖軟件進(jìn)行基因位點(diǎn)與標(biāo)記間連鎖分析，用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離(centiMorgan, cM)。其他數(shù)據(jù)在Excel 2013中處理。

1.9候選基因分析

根據(jù)基因精細(xì)定位結(jié)果，查閱在水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(Rice Genome Annotation Project)中相應(yīng)區(qū)間內(nèi)的所有開放閱讀框(ORF)，并分析可能的候選基因。根據(jù)候選基因全長(zhǎng)基因組DNA序列，設(shè)計(jì)測(cè)序引物，分別對(duì)野生型和突變體的基因組進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用ContigExpress軟件拼接完整再通過DNASTAR軟件進(jìn)行比對(duì)，確定突變位點(diǎn)。

2結(jié)果與分析

2.1突變體表型鑒定

在大田自然條件下，突變體wy3從苗期開始葉片表面出現(xiàn)類病斑，分蘗期比較明顯。葉片上斑點(diǎn)出現(xiàn)的位置并無特殊規(guī)律，但最終都會(huì)擴(kuò)散到整張葉片，表現(xiàn)為擴(kuò)散型突變體?？疾橥蛔凅w與野生型的農(nóng)藝性狀，突變體的長(zhǎng)勢(shì)較差，株高、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀也顯著低于對(duì)照(表1，圖1)。造成突變體株高等性狀顯著降低的原因可能是由于突變?nèi)~片過早枯死，光合作用能力減退。

2.2光照對(duì)突變體的影響

對(duì)突變體wy3只出現(xiàn)少量類病斑的葉片未產(chǎn)生類病斑部位用錫箔紙遮光15 d后發(fā)現(xiàn)，整張葉片其他部位都產(chǎn)生類病斑，但是遮光部位沒有產(chǎn)生類病斑； 恢復(fù)光照，跟蹤觀察原遮光部位變化，一周后，原本沒有類病斑的遮光處產(chǎn)生了明顯的類病斑(圖2)。該結(jié)果表明，類病斑的發(fā)生受自然光照的誘導(dǎo)，適當(dāng)?shù)恼诠饪梢宰柚够蛘邷p輕類病斑的發(fā)生或者擴(kuò)散。

A-苗期植株表型；B-分蘗初期野生型(左)和突變體wy3(右)植株表型;C-成熟期野生型(左)和突變體wy3(右)植株表型；D-野生型(左)和突變體wy3(右) 穗部表型；E-分蘗期野生型(左)和突變體wy3(右)葉片表型。

A, Phenotypes ofwy3 during seedling stage; B, Phenotypes of WT (left) andwy3(right) during the early tillering stage; C, Phenotypes of WT (left) andwy3(right) during the mature stage; D, Panicle traits of WT (left) andwy3(right); E, Leaves of WT (left) andwy3 (right) during the early tillering stage.

圖1突變體wy3及其野生型表型

Fig.1. Phenotypes of wy3 and wild type(WT).

表1突變體和野生型的農(nóng)藝與產(chǎn)量性狀

Table 1. Performance of agronomic and yield traits of the mutant wy3 and the wild type(WT).

材料Material株高Plantheight/cm分蘗數(shù)No.oftillers穗長(zhǎng)Paniclelength/cm結(jié)實(shí)率Seed-settingrate/%每穗粒數(shù)Grainnumberperpanicle粒長(zhǎng)Grainlength/mm粒寬Grainwidth/mm千粒重1000-grainweight/gwy356.9±0.6**3.5±0.6**14.8±1.2**79.0±0.1**89.6±6.8**7.5±2.23.4±1.426.54±0.56WT87.5±0.510.0±1.716.6±0.898.3±0.1123.6±11.07.3±2.83.3±0.926.85±0.62

**表示在0.01水平差異顯著。下同。

**denote significant difference at 0.01 level. The same as below.

表2突變體wy3和野生型葉片光合色素含量

Table 2. Pigment contents in leaves of wy3 and wild type(WT).

材料Material葉綠素a含量Chlorophyllacontent/(mg·g-1)葉綠素b含量Chlorophyllbcontent/(mg·g-1)葉綠素a/bChlorophylla/b類胡蘿卜素含量Carotenoidcontent/(mg·g-1)wy31.28±0.09**0.27±0.11**4.68±0.13**0.15±0.11**WT2.28±0.030.99±0.082.31±0.070.59±0.04

A-遮光前wy3； B-未發(fā)生斑點(diǎn)部位遮光15 d后； C-遮光部位恢復(fù)光照7 d后； D-野生型。

A, Leaf ofwy3 before shading; B, Leaf without lesion after shading for 15 days; C, Leaf shaded for 7 days then under normal light for 7 days; D, Wild type.

圖2遮光對(duì)突變體wy3葉片的影響

Fig. 2. Effects of shading on wy3 leaves.

2.3葉綠素含量變化

分蘗期，通過對(duì)突變體和野生型葉片葉綠素含量的測(cè)定結(jié)果可以看出，突變體的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均顯著低于野生型，但葉綠素a/b比值顯著高于其野生型，說明突變體wy3是一個(gè)葉綠素缺陷突變體(表2)。

2.4突變對(duì)光合作用的影響

始穗期，測(cè)定突變體wy3和野生型劍葉的光合參數(shù)，包括凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。由于在該時(shí)期突變體葉片類病斑明顯，突變體wy3所測(cè)得的Pn、Gs、Tr和Ci4個(gè)參數(shù)均顯著低于野生型(表3)，說明類病斑的發(fā)生導(dǎo)致突變體光合能力的降低。

2.5突變體葉片細(xì)胞死亡鑒定

利用臺(tái)盼藍(lán)染色方法對(duì)突變體及野生型葉片中死亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，野生型葉片整體呈淡藍(lán)色，沒有深藍(lán)色染色，說明野生型葉片基本上沒有細(xì)胞死亡。與野生型葉片不同的是，突變體類病斑發(fā)生處對(duì)應(yīng)著嚴(yán)重的深藍(lán)色小點(diǎn)，說明斑點(diǎn)部位有大量的死亡細(xì)胞，而在大塊深藍(lán)色染色間隙也出現(xiàn)了深藍(lán)色的小點(diǎn)，說明類病斑正在擴(kuò)散中(圖3)。

2.6抗氧化酶活性的變化

植物細(xì)胞程序性死亡時(shí)常產(chǎn)生活性氧的沉積，因此測(cè)定了突變體wy3和野生型相同部位葉片中一系列的活性氧代謝生理指標(biāo)。結(jié)果顯示，突變體wy3中CAT、POD、T-SOD以及MDA含量均顯著高于野生型(圖4)，說明在突變體葉片產(chǎn)生類病斑后，活性氧大量積累，活性氧的積累誘發(fā)了植物細(xì)胞合成大量的超氧化物歧化酶，超氧化物歧化酶將自由基狀態(tài)的氧負(fù)離子以及單線態(tài)氧歧化為過氧化氫，過氧化氫在細(xì)胞中的積累誘發(fā)過氧化物酶(過氧化氫酶)的大量表達(dá)。同時(shí)，在突變的葉片中活性氧大量積累導(dǎo)致葉片細(xì)胞中的生物膜的磷脂分子的不飽和脂肪酸鏈大量過氧化，生成大量丙二醛。

表3突變體wy3和野生型武育粳3號(hào)分蘗期葉片光合特性

Table 3. Photosynthetic parameters of wy3 and wild type(WT) at the initial tillering stage.

材料Material凈光合速率Pn/(mmol·m-2s-1)蒸騰速率Tr/(mmol·m-2s-1)氣孔導(dǎo)度Gs/(mol·m-2s-1)胞間CO2濃度Ci/(mmol·mol-1)wy314.16±0.27**193.27±10.10**0.13±0.02**2.76±0.23**WT22.46±0.29276.96±6.300.66±0.088.93±0.43

圖3武育粳 3號(hào)和wy3葉片的臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)

Fig. 3. Trypan blue staining of leaves of the mutant wy3 and wild type(WT).

2.7wy3的遺傳控制與基因定位

2014年海南， Kasalath與突變體wy3配置的F1植株葉片表型正常，2015年F2群體中出現(xiàn)明顯的分離，分別表現(xiàn)雙親性狀，其中正常株3000株，類病斑單株1099株。經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，正常株與突變株符合3∶1分離比(2=3.84)。表明突變體wy3類病斑性狀受一對(duì)隱性核基因控制。

**P<0.01.

圖4突變體wy3與野生型(WT)對(duì)照在分蘗期的生理學(xué)特性比較

Fig. 4. Physiological characteristics of the wild type(WT) and the wy3 mutant during the tillering stage.

表4 本研究開發(fā)的多態(tài)性STS標(biāo)記

Table 4. Polymorphic STS markers developed in this study.

標(biāo)記Marker反向引物Forwardprimer(5'-3')正向引物Reverseprimer(5'-3')W2-10GAGATGCCAGGAGAATGATGTAGCTGAGGGTTTGATAW2-17AAATCTGGACCTGAAAGTTTAGGGAAGATTCTCAAAW2-18GCCAGCGAGAAGAAGAAGGAGGATGTGGTCGGGTGTW2-3GCAGCACGGACTACAAGACAATTCTGCCATGACCAAW2-13TAGTGTCGCCCCTTTTAACATCACAGCAAACAAGCA

A-基因的初步定位； B-基因的精細(xì)定位； C-覆蓋基因物理圖譜; D-基因內(nèi)變異位點(diǎn)。

A, Primarily mapping of target gene; B, Fine mapping of target gene; C, Physical map of genes; D, The mutation locus of target gene.

圖5水稻類病斑突變體基因定位

Fig. 5. Mapping of the target gene in wy3.

為定位該類病斑基因，在均勻分布于水稻12條染色體的380對(duì)SSR標(biāo)記中，篩選出120對(duì)在Kasalath雙親間顯示多態(tài)性的標(biāo)記。分別取15株正常株和15株突變株構(gòu)建正常基因池和突變基因池，利用上述多態(tài)標(biāo)記對(duì)這兩個(gè)基因池進(jìn)行檢測(cè)。在所用檢測(cè)的120對(duì)標(biāo)記中，第2染色體的標(biāo)記RM3340和RM12368在兩個(gè)混池間表現(xiàn)出差異，初步推測(cè)這兩個(gè)標(biāo)記與基因連鎖。進(jìn)一步選取30株正常株和30株類病斑植株，利用RM3340、RM12368進(jìn)行檢測(cè)，正常株表現(xiàn)為Kasalath或F1條帶，類病斑植株表現(xiàn)為突變體wy3條帶，說明標(biāo)記RM3340、RM12368與基因連鎖(圖5)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已有的SSR標(biāo)記和Gramene(http://www.gramene.org)網(wǎng)站上提供的SSR信息，在標(biāo)記RM3340、RM12368附近篩選了14對(duì)SSR標(biāo)記，其中RM12317、RM12339和RM12348在雙親之間具有多態(tài)。利用這些標(biāo)記對(duì)F2群體中1099株類病斑單株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在標(biāo)記RM3340處找到28個(gè)交換株，在標(biāo)記RM12339處找到53對(duì)交換株，根據(jù)交換株信息，初步將基因定位在RM3340和RM12339之間。為了進(jìn)一步精細(xì)定位基因，結(jié)合已經(jīng)公布的水稻品種9311和日本晴全基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件，在水稻第2染色體上發(fā)展了13對(duì)新的STS標(biāo)記，其中5對(duì)標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)性(部分引物序列如表4所示)。利用5對(duì)多態(tài)標(biāo)記和81株交換株，最終把基因定位在W2-17和W2-18之間，兩標(biāo)記間物理距離約為28 kb。

2.8候選基因測(cè)序分析

根據(jù)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(Rice Genome Annotation Project)中的數(shù)據(jù)，在定位區(qū)間共有6個(gè)開放閱讀框(LOC_Os02g01960-LOC_Os02g02010)。 對(duì)這6個(gè)ORF進(jìn)行基因組測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型武育粳3號(hào)相比，突變體wy3中的LOC_Os02g02000編碼區(qū)(CDS)第375位堿基C缺失，編碼序列在920 bp處出現(xiàn)終止子TGA，使得翻譯提前終止 (圖5)，并且野生型武育粳3和日本晴在這個(gè)ORF上的序列完全相同。

3討論

在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的大量斑點(diǎn)葉或類病斑突變體中，斑點(diǎn)或者類病斑的出現(xiàn)往往伴隨著其他農(nóng)藝性狀的改變，但不同突變體表現(xiàn)并不一致。例如hm197[19]、lms1[28]、lmm4[29]等植株株高降低，而突變體spl32[30]株高未有顯著變化； 在分蘗數(shù)上，hm197[28]、g340[31]、spl32[30]等均未發(fā)生顯著變化；在結(jié)實(shí)率上，lmm4[29]、spl31[32]、spl32[30]等突變體均顯著下降，但g340[31]突變體結(jié)實(shí)率沒有顯著變化。本研究中，wy3株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率均顯著低于其野生型，植株光合作用能力的下降是造成這些農(nóng)藝、產(chǎn)量性狀降低的主要原因。類病斑突變體葉綠素各組分含量顯著低于野生型，葉綠素含量降低這一結(jié)果也與突變體植株葉片表型相符合，這也導(dǎo)致突變體中葉片光合作用能力的下降。

已有研究發(fā)現(xiàn)，類病斑形成部位通常伴隨自由基和活性氧的積累。在植物細(xì)胞中，無法及時(shí)清除的活性氧積累是誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行程序性死亡的重要信號(hào)因子。Samuilov等[33]研究表明活性氧的積累與植物細(xì)胞凋亡的起始與調(diào)節(jié)有重要關(guān)系。在水稻中已經(jīng)被克隆的類病斑突變體基因中，OsLSD1[34]、spl11[22]、spl28[16]等突變體基因與細(xì)胞的凋亡有關(guān)。本研究中，臺(tái)盼藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)類病斑葉片出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞，進(jìn)一步測(cè)得突變體wy3類病斑葉片中的SOD、POD、CAT和MDA均極顯著高于對(duì)照葉片，這一結(jié)果說明在突變體wy3葉片產(chǎn)生類病斑后，葉片細(xì)胞中存在大量的活性氧自由基，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞非程序性死亡，造成了突變體葉片最終枯死。

本研究中，利用組合Kasalath/wy3衍生F2群體中的1099株隱性單株，將突變體中控制類病斑基因定位在第2染色體短臂標(biāo)記W2-17和W2-18之間28 kb的物理區(qū)間內(nèi)。根據(jù)已有的報(bào)道，在此區(qū)間內(nèi)已經(jīng)報(bào)到了3個(gè)類病斑基因spl2[35]，cea62[36]和OsHPL3[37]，其中spl2未進(jìn)行精細(xì)定位，cea62與OsHPL3已克隆。通過對(duì)定位區(qū)間內(nèi)候選ORF進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體wy3中的LOC_Os02g02000編碼區(qū)(CDS)第375位堿基C缺失，編碼序列在920 bp處出現(xiàn)終止子TGA，使得翻譯提前終止。不同的是，突變體cea62是在LOC_Os02g02000編碼區(qū)第1146bp處發(fā)生單堿基替換(TAC→TAG)從而使得翻譯過程提前終止，OsHPL3突變體中的LOC_Os02g02000編碼區(qū)518 bp和519 bp之間插入了一個(gè)大約700 bp大小的轉(zhuǎn)座子，使得該基因功能喪失，從而發(fā)生類病斑突變。由此可以看出，本研究中定位到的類病斑基因和cea62、OsHPL3為變異位點(diǎn)不同的復(fù)等位基因。盡管spl2沒有被精細(xì)定位，但比較已有的定位結(jié)果及突變體表型，可以推斷cea62、OsHPL3及本研究中克隆的基因與已報(bào)到的spl2均為等位基因。

從表型來看，突變體wy3與已報(bào)道的cea62和OsHPL3基本一致，但也有所差異。突變體wy3在發(fā)生突變時(shí)期、病斑擴(kuò)散形式、病斑顏色以及植株株高和分蘗等性狀上都與cea62、OsHPL3表現(xiàn)一致，但是wy3在千粒重上與野生型并沒有發(fā)生顯著變化，這與OsHPL3的千粒重較野生型顯著下降有所不同[36]；突變體wy3在結(jié)實(shí)率上的表現(xiàn)與cea62有所不同，cea62結(jié)實(shí)率極顯著低于野生型，這種極顯著降低是由于花粉育性降低造成的[37]，而本研究中wy3花粉育性與野生型并無顯著差異(數(shù)據(jù)未列出)，突變體wy3結(jié)實(shí)率下降是由于植株后期葉片枯死，籽粒灌漿不充實(shí)而出現(xiàn)大量癟粒造成的。另外，OsHPL3突變體來源于粳稻品種中花11，cea62背景源于日本晴，結(jié)合性狀上的差異，我們推測(cè)差異的原因可能是突變位點(diǎn)的不同或核背景不同。鑒于此，我們將該突變基因?qū)肴毡厩绫尘?，以期在不同背景下研究該基因的差異。由于?shí)驗(yàn)進(jìn)度限制，結(jié)果仍在進(jìn)一步研究中。

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Characterization and Gene Mapping of Lesion Mimic Mutantwy3 in Rice

ZHANG Hong-Gen#, WANG Mao-yu#, ZHANG Li-jia, HU Ya, MA Jia-qi, ZHANG Yi-fan, TANG Shu-zhu*,LIANG Guo-hua, GU Ming-hong

(KeyLaboratoryofCropGeneticsandPhysiologyofJiangsuProvince/KeyLaboratoryofPlantFunctionalGenomics，MinistryofEducation，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；#These authors contributed equally to this work；*Corresponding author， E-mail：sztang@yzu.edu.cn)

ZHANG Honggen, WANG Maoyu, ZHANG Lijia,et al. Characterization and gene mapping of lesion mimic mutantwy3 in rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(3): 239-246.

Abstract:A lesion mimic mutant wy3 was obtained from the progeny of a japonica variety Wuyujing 3 by natural mutation. The lesions were first observed on the leaves at the seedling stage, then spread gradually to the whole leaf at the initial tillering stage. Compared with the wild type(WT), the plant height, the number of effective tiller, panicle length, grain number per panicle and seed setting rate of wy3 were reduced significantly. The shading assay showed that the lesions on leaves of wy3 were induced by natural light. Compared with the wild type, the photosynthetic pigment and the net photosynthetic rate of wy3 were significantly reduced, but the SOD activity, POD activity, CAT activity and MDA content of wy3 were significantly higher than those of WT. Trypan blue staining experiments showed that there were a large number of dead cells in the mutant lesion. Genetic analysis suggested that the phenotype of wy3 was controlled by a single recessive nuclear locus, and the target gene was mapped between markers W2-17 and W2-18 with the physical distance of 28 kb on chromosome 2. Sequence analysis revealed that the mutated gene in wy3 had a single nucleotide deletion at the 375th in CDS of LOC_Os02g02000, resulting in a premature termination of translation of the target gene, which is an new allele of OsHPL3.

Key words:rice; lesion mimic mutant; gene mapping

DOI:10.16819/j.1001-7216.2016.5176

收稿日期:2015-11-30； 修改稿收到日期: 2015-12-24。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071384，31000533)； 江蘇省科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(BE2013301)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

中圖分類號(hào):Q343.5;Q754

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1001-7216(2016)03-0239-08

中國(guó)水稻科學(xué)(Chin J Rice Sci),2016,30(3):239-246

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