劉鑫　張恒　闞虎飛　周立帥　黃昊　宋林林　翟煥趁　張君　魯國(guó)東

(福建農(nóng)林大學(xué) 功能基因組學(xué)研究中心， 福州 350002； *通訊聯(lián)系人， E-mail： gdlufafu@163.com)

水稻泛素結(jié)合酶基因家族的生物信息學(xué)與表達(dá)分析

劉鑫張恒闞虎飛周立帥黃昊宋林林翟煥趁張君魯國(guó)東*

(福建農(nóng)林大學(xué) 功能基因組學(xué)研究中心， 福州 350002；*通訊聯(lián)系人， E-mail： gdlufafu@163.com)

劉鑫, 張恒, 闞虎飛, 等. 水稻泛素結(jié)合酶基因家族的生物信息學(xué)與表達(dá)分析. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(3)： 223-231.

摘要:泛素/蛋白酶體系統(tǒng)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成和抗病反應(yīng)等過(guò)程中起著重要的作用。近年的研究表明，某些病原菌能夠模擬寄主植物泛素/蛋白酶體系統(tǒng)組分，從而達(dá)到利用該系統(tǒng)為病原菌服務(wù)的目的。泛素結(jié)合酶是泛素化反應(yīng)過(guò)程中的第二個(gè)酶，對(duì)植物泛素/蛋白酶體系統(tǒng)的正常運(yùn)行不可或缺。已有的研究表明，水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中存在48個(gè)預(yù)測(cè)的泛素結(jié)合酶基因。為了初步揭示這些泛素結(jié)合酶基因在植物抗病防御反應(yīng)中的功能，研究其與植物抗病性的關(guān)系。本研究通過(guò)生物信息學(xué)、RNA-seq和qRT-PCR的方法，分析了水稻泛素結(jié)合酶基因家族的特征及其表達(dá)模式。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，48個(gè)水稻泛素結(jié)合酶基因可分為3個(gè)大組，總共7個(gè)亞組。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，水稻泛素結(jié)合酶基因主要由一個(gè)泛素結(jié)合酶催化結(jié)構(gòu)域組成。電子表達(dá)譜分析表明，大多數(shù)水稻泛素結(jié)合酶基因能被稻瘟病菌誘導(dǎo)表達(dá)。啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析表明，4個(gè)抗病相關(guān)順式作用元件和1個(gè)過(guò)敏性反應(yīng)相關(guān)順式作用元件在48個(gè)水稻泛素結(jié)合酶基因的啟動(dòng)子區(qū)有很高的分布。稻瘟病菌接種親和性和非親和性水稻單基因系的RNA-seq結(jié)果表明，處理36 h讀取到的水稻泛素結(jié)合酶基因?yàn)?4個(gè)，其中高表達(dá)基因數(shù)量超過(guò)讀取到的泛素結(jié)合酶基因總數(shù)的50%。qRT-PCR分析結(jié)果表明稻瘟病菌的侵染在親和和非親和組合中都能誘導(dǎo)部分水稻泛素結(jié)合酶基因的表達(dá)。在非親和組合中水稻泛素結(jié)合酶基因的表達(dá)傾向于受到抑制。

關(guān)鍵詞:水稻； 泛素結(jié)合酶； 泛素/蛋白酶體系統(tǒng)； 生物信息學(xué)； 稻瘟病菌； RNA-seq； qRT-PCR

植物泛素/蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成和抗病反應(yīng)等過(guò)程中起著重要的作用[1]。近年的研究又表明，某些病原菌能夠模擬寄主植物泛素/蛋白酶系統(tǒng)組分，從而達(dá)到利用該系統(tǒng)為病原菌服務(wù)的目的[2]。泛素/蛋白酶體途徑主要由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素蛋白連接酶E3、蛋白酶體和去泛素化酶(DUBs)組成。反應(yīng)的過(guò)程從泛素分子在ATP提供能量的情況下被E1激活開(kāi)始，激活的泛素分子以硫酯鍵連接到E1上，E1進(jìn)一步與E2結(jié)合，通過(guò)交酯作用將泛素分子轉(zhuǎn)移到E2上，E2再與E3結(jié)合，而E3主要負(fù)責(zé)招募底物，就這樣底物被泛素標(biāo)記上了，之后被蛋白酶體降解成小段多肽。同時(shí)，在去泛素化酶的作用下，泛素分子重新回收利用[3,4]。泛素化在植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中扮演了重要角色[2-5]。

稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一，其發(fā)生導(dǎo)致水稻產(chǎn)量大幅減少，嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無(wú)收[7]。Zeng等[8]的研究結(jié)果表明，Spl11是一個(gè)擁有泛素蛋白連接酶E3活性的植物細(xì)胞死亡和防御反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)子，非親和及親和的水稻-稻瘟病菌互作都能誘導(dǎo)Spl11的表達(dá)。Park等[9]的研究表明，稻瘟病菌效應(yīng)蛋白AvrPiz-t通過(guò)作用于RING型E3泛素連接酶APIP6來(lái)抑制病原相關(guān)分子模式(PAMPs)觸發(fā)的PTI反應(yīng)。蔣春苗等[10]從疣粒野生稻中克隆到一個(gè)泛素結(jié)合酶基因OmE2，并證明這個(gè)基因受白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)。這些研究說(shuō)明，泛素/蛋白酶體系統(tǒng)在水稻抗病防御中有著重要的作用,但目前已有的研究多集中于E3泛素連接酶的功能。胡婷麗等[11]綜述了不同類(lèi)型E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化在植物抗病中的作用。楊玖霞等[12]近來(lái)對(duì)E3泛素連接酶在植物抗病分子機(jī)理方面的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了專(zhuān)題論述。相比之下，對(duì)于泛素結(jié)合酶E2在植物抗病防御反應(yīng)中功能的研究則很少。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)水稻的一個(gè)泛素結(jié)合酶基因能夠增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性，相應(yīng)的RNAi株系對(duì)稻瘟病菌的抗性減弱[13]。而已有研究表明，水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中存在48個(gè)預(yù)測(cè)的泛素結(jié)合酶基因,其中只有39個(gè)含有有活性的半胱氨酸位點(diǎn)[14,15]。擬南芥AtUBC1和AtUBC2基因參與開(kāi)花抑制基因FLC的激活并抑制開(kāi)花[16]。過(guò)表達(dá)擬南芥AtUBC32基因使植株對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)敏感度下降[17]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)綠豆VrUBC1基因、花生AhUBC2基因或大豆GmUBC2基因能增強(qiáng)植株的抗旱性[18-20]。在擬南芥中異位表達(dá)野生稻OgUBC基因增強(qiáng)了植株對(duì)灰葡萄孢及紫外線UV-B輻射的抗性[21]。為了初步探討水稻泛素結(jié)合酶基因在水稻抗病反應(yīng)中扮演的角色，本研究通過(guò)生物信息學(xué)、RNA-seq及qRT-PCR的方法對(duì)該家族基因的特征及表達(dá)模式進(jìn)行了初步研究。

1材料與方法

1.1水稻泛素結(jié)合酶基因序列的獲取

根據(jù)Hansol等[14]的補(bǔ)充材料信息，從TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中下載到48個(gè)水稻泛素結(jié)合酶基因的堿基序列和氨基酸序列[14,22]。

1.2水稻泛素結(jié)合酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

48個(gè)水稻OsUBC基因的蛋白氨基酸序列通過(guò)MEGA 5.05軟件的ClustalW算法比對(duì)，其中(gap-open)和(gap-extension penalties)值分別設(shè)置為10和0.1。比對(duì)完的序列用鄰接法，bootstrap 10 000次抽樣來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

1.3水稻泛素結(jié)合酶基因的結(jié)構(gòu)域分析

結(jié)構(gòu)域分析由Pfam 27.0 (http://pfam.xfam.org/) 在線完成[23]。輸入的是蛋白氨基酸序列，參數(shù)設(shè)置如下：Cut-off選Use E-value，E-value值為默認(rèn)的1.0。

1.4水稻泛素結(jié)合酶基因的電子表達(dá)譜

電子表達(dá)譜數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI中的GEO Profiles(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的microarray結(jié)果，人工統(tǒng)計(jì)分析。

1.5水稻泛素結(jié)合酶基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件聚類(lèi)分析

起始密碼子上游1 500 bp的序列來(lái)自TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用的是水稻基因組瀏覽網(wǎng)頁(yè)(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)，找到相應(yīng)基因位點(diǎn)后，縮放到合適大小，然后點(diǎn)擊Go按鈕，在下載出來(lái)的序列中尋找對(duì)應(yīng)基因的起始密碼子序列并手動(dòng)截取起始密碼子上游1500 bp的序列。啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析在PLACE網(wǎng)站(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)完成[24,25]。聚類(lèi)分析由Cluster 3.0和Java TreeView軟件共同完成[26]。

1.6稻瘟病菌接種水稻后的轉(zhuǎn)錄組分析

稻瘟病菌菌株Guy11孢子懸浮液，濃度為1×105個(gè)/mL，噴霧接種到3葉1心期的Pid2和Pid3單基因系上。于接種后36 h取樣，提取植物總RNA，將符合要求的樣品送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。RPKM(reads per kb per million reads)代表的是每百萬(wàn)reads中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)[27]。

1.7稻瘟病菌侵染情況下水稻泛素結(jié)合酶基因的表達(dá)分析

將濃度約為1×105個(gè)/mL的Guy11孢子懸浮液接種到3葉1心期的Pid2和Pid3單基因系水稻幼苗上，于接種前(即0 h), 及接種后1 h，3 h，6 h，12 h，24 h取樣。提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄，稀釋到合適濃度進(jìn)行qRT-PCR定量分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行，顯著性分析采用的是最小顯著差數(shù)法(LSD)，顯著性水平0.05。

2結(jié)果與分析

2.1水稻泛素結(jié)合酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明水稻泛素結(jié)合酶主要分為3個(gè)大組，其中Ⅰ大組包含4個(gè)亞組(Ⅰ-a，Ⅰ-b，Ⅰ-c，Ⅰ-d)，Ⅱ大組包括3個(gè)亞組(Ⅱ-a，Ⅱ-b，Ⅱ-c)，Ⅲ大組可分成2個(gè)亞組——Ⅲ-a和Ⅲ-b(圖1)。第Ⅱ-a亞組中只有2個(gè)基因，可能在進(jìn)化過(guò)程中由同一個(gè)基因復(fù)制而來(lái)。

2.2蛋白結(jié)構(gòu)域分析

蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，除了OsUBC38之外，其余47個(gè)水稻泛素結(jié)合酶基因都含有一個(gè)大的泛素結(jié)合酶催化結(jié)構(gòu)域(UBCc domain)。除此之外，還零星分布有Low complexity結(jié)構(gòu)域。

2.3電子表達(dá)譜分析

電子表達(dá)譜數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)選取了生物脅迫因素1個(gè)，即稻瘟病菌的侵染；非生物脅迫因素1個(gè)，即鹽脅迫；激素處理因素3個(gè)，即脫落酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素；激發(fā)子1個(gè)，即寡聚糖幾丁質(zhì)。結(jié)果如表1所示，從中可以看出，除了OsUBC9、OsUBC14、OsUBC15和幾個(gè)數(shù)據(jù)不可用的基因外，其他都能被稻瘟病菌的侵染誘導(dǎo)表達(dá)，這說(shuō)明水稻泛素結(jié)合酶很可能在抵抗稻瘟病菌的侵染過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

2.4啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的分析

啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析選取抗病相關(guān)順式作用元件9個(gè)(S000042，S000056，S000232，S000390，S000391，S000430，S000443，S000447, S000453)；激發(fā)子相關(guān)順式作用元件3個(gè)(S000142，S000200，S000492)；苯丙氨酸解氨酶相關(guān)順式作用元件3個(gè)(S000137，S000400，S000444)；過(guò)敏性反應(yīng)相關(guān)順式作用元件1個(gè)(S000198)。值得一提的是，4個(gè)抗病相關(guān)順式作用元件(S000390，S000430，S000447，S000453)和1個(gè)過(guò)敏性反應(yīng)相關(guān)順式作用元件S000198在水稻泛素結(jié)合酶基因的啟動(dòng)子區(qū)有很高的分布(圖2)。這說(shuō)明水稻泛素結(jié)合酶很可能參與了稻瘟病菌侵染過(guò)程中的抗病防御反應(yīng)。

2.5稻瘟病菌接種水稻后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.5.1RNA-seq測(cè)序質(zhì)量報(bào)告

測(cè)序結(jié)果中， clean reads數(shù)占總數(shù)據(jù)的98.02%。以reads數(shù)量作為橫坐標(biāo)，識(shí)別到的基因百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行測(cè)序飽和度的測(cè)驗(yàn)。結(jié)果表明，隨著reads數(shù)的增多，識(shí)別到的基因百分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)速度趨于平緩，說(shuō)明識(shí)別到的基因數(shù)趨于飽和，測(cè)序數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的分析(圖3)。

2.5.2RNA-seq數(shù)據(jù)中水稻泛素結(jié)合酶基因的表達(dá)情況分析

RNA-seq數(shù)據(jù)中讀取到水稻泛素結(jié)合酶基因44個(gè)。根據(jù)一般的標(biāo)準(zhǔn)，RPKM值在0.1到3.75之間的為低表達(dá)基因，3.75到15之間的為中等表達(dá)基因，大于15的為高表達(dá)基因[27]。RNA-seq讀取到的水稻泛素結(jié)合酶基因中超過(guò)50%的基因?qū)儆诟弑磉_(dá)基因。值得一提的是OsUBC16在Pid2(親和組合)和Pid3(非親和組合)中的RPKM值分別為558.43和675.23，差別明顯。OsUBC17的RPKM值則在Pid2中為150.60，高于Pid3中的124.43。相比之下，OsUBC18和OsUBC25在Pid2和Pid3中未表現(xiàn)出太大差別(圖4)。

2.6稻瘟病菌誘導(dǎo)情況下幾個(gè)水稻泛素結(jié)合酶基因表達(dá)情況分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，選取了OsUBC16、OsUBC17、OsUBC18和OsUBC25來(lái)做qRT-PCR分析。結(jié)果表明Guy11接種Pid2單基因系水稻能誘導(dǎo)OsUBC16、OsUBC18的表達(dá)。接種24 h后，OsUBC16基因的表達(dá)顯著高于0 h。非親和組合中，OsUBC16、OsUBC17在接種后1 h就被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，3 h之后OsUBC16的表達(dá)就開(kāi)始受到抑制，而12 hOsUBC17的表達(dá)達(dá)到一個(gè)高峰值。OsUBC25基因的表達(dá)量在接種后1 h開(kāi)始就受到極顯著的抑制(圖5)。

圖1水稻泛素結(jié)合酶基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

Fig. 1. Phylogenetic tree of rice UBC gene family.

表1水稻泛素結(jié)合酶基因家族電子表達(dá)譜

Table 1. Expression pattern of rice UBC gene family in silico.

基因 Gene 表達(dá)誘導(dǎo)因素Expressioninducingfactors稻瘟病菌侵染Blastfungusinfection鹽脅迫Salinitystress脫落酸Abscisicacid赤霉素Gibberellin細(xì)胞分裂素Cytokinin寡聚糖幾丁質(zhì)ChitinoligosaccharideOsUBC1++++++OsUBC2++++++OsUBC3++nn+nOsUBC4++++++OsUBC5++++++OsUBC6++++++OsUBC7++nn+nOsUBC8++++++OsUBC9nn++++OsUBC10++++++OsUBC11++++++OsUBC12++nn+nOsUBC13++nn+nOsUBC14nn++n+OsUBC15nnnnnnOsUBC16++++++OsUBC17++++++OsUBC18++++++OsUBC19++++++OsUBC20NNNNNNOsUBC21NNNNNNOsUBC22NNNNNNOsUBC23NNNNNNOsUBC24++++++OsUBC25NNNNNNOsUBC26++++++OsUBC27++++++OsUBC28++++++OsUBC29++++++OsUBC30++++++OsUBC31++nn+nOsUBC32++++++OsUBC33++++++OsUBC34++++++OsUBC35NNNNNNOsUBC36NNNNNNOsUBC37++nn++OsUBC38++++++OsUBC39NNNNNNOsUBC40++++++OsUBC41++nn+NOsUBC42++++++OsUBC43++++++OsUBC44++++++OsUBC45++++++OsUBC46++++++OsUBC47++nn+NOsUBC48++++++

“+”代表可誘導(dǎo)表達(dá)，“n”代表無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)，“N”表示無(wú)數(shù)據(jù)可用。

‘+’ ， Inducible; ‘n’ , No related data; ‘N’ , Unavailable.

圖2水稻泛素結(jié)合酶基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件聚類(lèi)分析

Fig. 2. Cluster analysis of cis-element in the promoter region of rice UBC genes.

圖3水稻RNA-seq測(cè)序飽和度分析

Fig. 3. Saturation analysis of rice RNA-seq data.

3討論

Zeng等[3]早在2006年就強(qiáng)調(diào)泛素/蛋白酶體系統(tǒng)可能在植物和微生物互作的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，并且提供了很多間接的證據(jù)。而后在2010年Dielen等[2]發(fā)表在《分子植物病理學(xué)》上的一篇綜述更是強(qiáng)調(diào)“植物防御反應(yīng)的每一步都涉及到泛素/蛋白酶體系統(tǒng)”。同時(shí)，作者還提到“泛素/蛋白酶體系統(tǒng)不光是寄主植物用來(lái)防御的武器，也是一些病原菌攻擊的靶標(biāo)，從而抑制這個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行或者利用這個(gè)系統(tǒng)為病原菌服務(wù)”。因此，我們不難提出設(shè)想：病原菌在侵染植物的過(guò)程中擾亂了寄主植物的泛素/蛋白酶體系統(tǒng)，從而也打破了寄主植物細(xì)胞體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，從而有利于病菌的侵染；還有一種模式就是：病原菌分泌效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主植物細(xì)胞中，模擬寄主植物泛素/蛋白酶體系統(tǒng)的組分，從而利用寄主的泛素蛋白酶體系統(tǒng)以利于病菌的成功侵染。

圖4四個(gè)水稻泛素結(jié)合酶基因在Pid2和Pid3單基因系水稻中表達(dá)情況比較

Fig. 4. Expression comparison of four rice ubiquitin-conjugating enzyme gene in Pid2 and Pid3 monogenic lines.

*，**分別表示表達(dá)量顯著和極顯著上調(diào)。

*，** indicate significantly or extremely significantly upregulated expression levels，respectively.

圖5接種稻瘟病菌后水稻泛素結(jié)合酶基因的表達(dá)量變化

Fig. 5. Expression level of rice ubiquitin-conjugating enzyme genes after Magnaporthe oryzae inoculation.

從48個(gè)水稻泛素結(jié)合酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，水稻泛素結(jié)合酶家族基因在進(jìn)化過(guò)程中存在復(fù)制事件，即同一家族的兩個(gè)基因存在片段重復(fù)或者串聯(lián)重復(fù)。例如：OsUBC25和OsUBC26在堿基序列上存在片段重復(fù)，但是功能方面是否有冗余還有待進(jìn)一步論證。另外，水稻泛素結(jié)合酶家族基因在進(jìn)化過(guò)程中存在功能的分化現(xiàn)象。在水稻泛素結(jié)合酶基因家族中存在9個(gè)泛素結(jié)合酶變體(UEV, ubiquitin E2 variants)[28,29]。這些UEV是否還有泛素結(jié)合酶活性暫且沒(méi)有報(bào)道，但是半胱氨酸-巰基位點(diǎn)作為泛素結(jié)合酶與泛素分子的結(jié)合位點(diǎn)在E2發(fā)揮功能的過(guò)程中至關(guān)重要。由此可見(jiàn)，至少這9個(gè)UEV可能趨于行使泛素結(jié)合酶以外的功能。而水稻泛素結(jié)合酶家族基因在進(jìn)化中的復(fù)制事件則說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中不斷有新的泛素結(jié)合酶呈現(xiàn)。

從電子表達(dá)譜來(lái)看，水稻泛素結(jié)合酶大多數(shù)能被稻瘟病菌的侵染誘導(dǎo)表達(dá)。從啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件來(lái)看，4個(gè)抗病相關(guān)順式作用元件和1個(gè)過(guò)敏性反應(yīng)相關(guān)順式作用元件在水稻泛素結(jié)合酶基因的啟動(dòng)子區(qū)有較高的分布。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果也表明，稻瘟病菌和JA處理能夠誘導(dǎo)OsUBC26的表達(dá)[13]。這也讓我們更有理由相信水稻的泛素結(jié)合酶參與了稻瘟病菌侵染信號(hào)途徑的響應(yīng)，并且很可能與JA信號(hào)途徑有關(guān)。E等[15]的研究也表明水稻泛素結(jié)合酶的表達(dá)至少能被IAA，6-BA，GA，ABA中的兩種誘導(dǎo)。雖然Hansol等[14]對(duì)40個(gè)水稻E2s和17個(gè)水稻ARM-U-box E3s的互作模式做了探討，但是，在水稻中E2和E3的互作網(wǎng)絡(luò)還鮮有報(bào)道，大多數(shù)水稻泛素蛋白連接酶的底物還處于未知階段。目前，可以確定的是水稻泛素結(jié)合酶參與了水稻與稻瘟病菌的互作過(guò)程。

qRT-PCR的結(jié)果說(shuō)明不同水稻泛素結(jié)合酶在水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的過(guò)程中扮演了不同的角色。這可以從水稻泛素結(jié)合酶基因的表達(dá)模式在稻瘟病菌與水稻的親和互作和非親和互作中表現(xiàn)出很大的差別看出來(lái)。這些差別說(shuō)明在稻瘟病菌侵染的過(guò)程中水稻泛素結(jié)合酶之間可能存在系統(tǒng)的調(diào)控。已有的研究表明泛素結(jié)合酶E2主要決定泛素鏈的長(zhǎng)度和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，而不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的泛素鏈標(biāo)記的蛋白分子將行使不同的功能，例如以K48相連的泛素鏈標(biāo)記的蛋白分子主要被送往26S蛋白酶體進(jìn)行降解，而以K63相連的泛素鏈標(biāo)記的蛋白分子則主要在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起作用[30]。因此，我們可以推測(cè)那些在稻瘟病菌侵染初期就被誘導(dǎo)高表達(dá)的水稻泛素結(jié)合酶基因很可能在水稻抗病防御反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起了作用，而被誘導(dǎo)表達(dá)較晚的水稻泛素結(jié)合酶基因則可能主要在水稻啟動(dòng)防御反應(yīng)方面起了作用，例如通過(guò)泛素化途徑降解掉一些防御反應(yīng)相關(guān)的抑制蛋白，從而啟動(dòng)水稻的抗病防御反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hershko A. The ubiquitin system for protein degradation and some of its roles in the control of the cell division cycle.CellDeathDiffer， 2005, 12: 1191-1197.

[2]Dielen A, Badaoui S, Candresse T, et al. The ubiquitin/26S proteasome system in plant-pathogen interactions: A never-ending hide-and-seek game.MolPlantPathol， 2010, 11(2): 293-308.

[3]Zeng L R, Miguel E V, Zhu T, et al. Ubiquitination-mediated protein degradation and modification: An emerging theme in plant-microbe interactions.CellRes， 2006, 16: 423-426.

[4]Stone S L. The role of ubiquitin and the 26S proteasome in plant abiotic stress signaling.FrontPlantSci， 2014, 5.

[5]Marino D, Peeters N, Rivas S. Ubiquitination during plant immune signaling.PlantPhysiol， 2012, 160(1): 15-27.

[6]Smalle J, Vierstra R D. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway.AnnuRevPlantBiol， 2004, 55: 555-590.

[7]Madden L V, Wheelis M. The threat of plant pathogens as weapons against U.S. crops.AnnuRevPhytopathol， 2003, 41(4): 155-176.

[8]Zeng L R, Qu S H, Bordeos A, et al.Spottedleaf11， a negative regulator of plant cell death and defense, encodes a U-Box/Armadillo repeat protein endowed with E3 ubiquitin ligase activity.PlantCell, 2004, 16: 2795-2808.

[9]Park C, Chen S B, Shirsekar G, et al. TheMagnaportheoryzaeeffector AvrPiz-t targets the RING E3 ubiquitin ligase APIP6 to suppress pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity in rice.PlantCell, 2012, 24: 4748-4762.

[10]蔣春苗, 黃興奇, 付堅(jiān), 等.疣粒野生稻泛素結(jié)合酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列克隆與分析. 作物學(xué)報(bào),2012，38(5): 808-813.

Jiang C M, Huang X Q, Fu J, et al. Cloning and analysis on full-Length cDNA sequence of ubiquitin-conjugating enzyme gene fromOryzameyerianaBaill.ActaAgronSin， 2012, 38(5): 808-813. (in Chinese with English abstract)

[11]胡婷麗, 李魏, 劉雄倫, 等. 泛素化在植物抗病中的作用. 微生物學(xué)通報(bào), 2014, 41(6): 1175-1179.

Hu T L, Li W, Liu X L, et al. The role of ubiquitination in plant disease resistance.MicrobiolChina， 2014, 41(6): 1175-1179. (in Chinese with English abstract)

[12]楊玖霞, 張浩, 王志龍, 等. E3泛素連接酶調(diào)控植物抗病分子機(jī)理研究進(jìn)展. 植物保護(hù)，2015，41(4): 1-8.

Yang J X, Zhang H, Wang Z L, et al. Recent progresses in the regulation mechanism of E3 ligases in plant disease resistance.PlantProtect， 2015, 41(4): 1-8. (in Chinese with English abstract)

[13]林藝娟.OsRBCS和OsUBC2在水稻抗病防御中的作用機(jī)制. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2014.

Lin Y J. The mechanism ofOsRBCsandOsUBC2 in rice disease resistance. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2014.(in Chinese with English abstract)

[14]Hansol B, Woo T K. Classification and interaction modes of 40 rice E2 ubiquitin-conjugating enzymes with 17 rice ARM-U-box E3 ubiquitin ligases.BiochemBiophysResCommun, 2014, 444: 575-580.

[15]E Z G, Zhang Y P, Li T T, et al. Characterization of the ubiquitin-conjugating enzyme gene family in rice and evaluation of expression profiles under abiotic stresses and hormone treatments.PLoSONE， 2015, 10(4).

[16]Xu L, Ménard R, Berr A, et al. The E2 ubiquitin-conjugating enzymes, AtUBC1 and AtUBC2, play redundant roles and are involved in activation ofFLCexpression and repression of flowering inArabidopsisthaliana.PlantJ, 2009, 57(2): 279-288.

[17]Cui F, Liu L J, Zhao Q Z, et al.Arabidopsisubiquitin conjugase UBC32 is an ERAD component that functions in brassinosteroid-mediated salt stress tolerance.PlantCell, 2012, 24(1): 233-244.

[18]Chung E, Cho C W, So H A, et al. Overexpression ofVrUBC1， a mung bean E2 ubiquitin-conjugating enzyme, enhances osmotic stress tolerance inArabidopsis.PLoSONE， 2013, 8(6).

[19]Wan X R, Mo A Q, Liu S, et al. Constitutive expression of a peanut ubiquitin-conjugating enzyme gene inArabidopsisconfers improved water-stress tolerance through regulation of stress-responsive gene expression.JBiosciBioengin， 2011, 111(4): 478-484.

[20]Zhou G A, Chang R Z， Qiu L J. Overexpression of soybean ubiquitin-conjugating enzyme geneGmUBC2 confers enhanced drought and salt tolerance through modulating abiotic stress-responsive gene expression inArabidopsis.PlantMolBiol， 2010, 72(4-5): 357-367.

[21]Jeon E H, Pak J H, Kim M J, et al. Ectopic expression of ubiquitin-conjugating enzyme gene from wild rice,OgUBC1， confers resistance against UV-B radiation andBotrytisinfection inArabidopsisthaliana.BiochemBiophysResCommun， 2012, 427(2): 309-314.

[22]Kawahara Y, Bastide M D L, Hamilton J P, et al. Improvement of theOryzasativaNipponbare reference genome using next generation sequence and optical map data.Rice， 2013, 6: 4.

[23]Finn R D, Bateman A, Clements J, et al. The Pfam protein families database.NuclAcidsRes， 2014, Database Issue 42: D222-D230.

[24]Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M，et al. Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database.NuclAcidsRes， 1999, 27: 297-300.

[25]Prestridge D S. SIGNAL SCAN: A computer program that scans DNA sequences for eukaryotic transcriptional elements.ComputerApplBiosci， 1991, 7: 203-206.

[26]de Hoon M J L, Imoto S, Nolan J, et al. Open source clustering software.Bioinformatics， 2004, 20(9): 1453-1454.

[27]Mortazavi A, Williams B A, Mccue, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.NatMethods， 2008, 5(7): 621-628.

[28]van Demark A P, Hofmann R M, Tsui C, et al. Molecular insights into polyubiquitin chain assembly: Crystal structure of the Mms2/Ubc13 heterodimer.Cell， 2001, 105(6): 711-720.

[29]Andersen P L, Zhou H, Pastushok L, et al. Distinct regulation of Ubc13 functions by the two ubiquitin-conjugating enzyme variants Mms2 and Uev1A.JCellBiol, 2005, 170(5): 745-755.

[30]Ye Y, Rape M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.NatRevMolCellBiol， 2009, 10(11): 755-764.

Bioinformatic and Expression Analysis of Rice Ubiquitin-conjugating Enzyme Gene Family

LIU Xin, ZHANG Heng, KAN Hu-fei, ZHOU Li-shuai, HUANG Hao, SONG Lin-lin, ZHAI Huan-chen,ZHANG Jun, LU Guo-dong*

(TheFunctionalGenomicsCenter,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China；*Corresponding author， E-mail：gdlufafu@163.com)

LIU Xin, ZHANG Heng, KAN Hufei, et al. Bioinformatic and expression analysis of rice ubiquitin-conjugating enzyme gene family. Chin J Rice Sci, 2016, 30(3): 223-231.

Abstract:The ubiquitin/proteasome system plays an important role in plant growth and development, morphogenesis and disease resistance. Recent studies have shown that some pathogens can mimic the host plant ubiquitin/proteasome system components to achieve their own purposes. Ubiquitin-conjugating enzyme is the second enzyme in the ubiquitination process and is indispensable for the plant ubiquitin/proteasome system. Previous studies showed that there are 48 predicted ubiquitin-conjugating enzyme genes in rice genome. In order to preliminarily elucidate the functions of rice ubiquitin-conjugating enzyme genes in plant disease resistance, bioinformatic, RNA-seq and qRT-PCR methods were used to analyze characteristics and expression patterns of rice ubiquitin-conjugating enzyme gene family. Phylogenetic tree analyses indicate that the 48 rice ubiquitin-conjugating enzyme genes can be divided into 3 groups, 7 sub-groups in total. Protein domain analysis showed that ubiquitin-conjugating enzyme genes mainly consist of a big ubiquitin-conjugating enzyme catalytic domain. Expression analysis in silico suggested that most of the rice ubiquitin-conjugating enzymes can be induced by blast fungus infection. Plant cis-acting elements analysis indicated that four pathogen resistance cis-acting elements and one hypersensitivity reaction cis-acting element have high distribution in the promoter region of the 48 rice ubiquitin-conjugating enzyme genes. RNA-seq data from compatible and incompatible monogenic rice after rice blast fungus infection showed that 44 rice ubiquitin-conjugating enzyme genes were expressed at 36 hours after treatment, among which more than 50% were highly expressed genes. qRT-PCR analysis showed that expression of some ubiquitin-conjugating enzyme genes can be induced by the inoculation of rice blast fungus both in compatible and incompatible monogenic rice. However, in incompatible rice the expression of rice ubiquitin-conjugating enzyme genes tends to be inhibited after rice blast fungus inoculation.

Key words:rice; ubiquitin-conjugating enzyme; ubiquitin/proteasome system; bioinformatics; Magnaporthe oryzae; RNA-seq; qRT-PCR

DOI:10.16819/j.1001-7216.2016.5177

收稿日期:2015-11-30； 修改稿收到日期: 2016-03-16。

基金項(xiàng)目:國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013BAD19B03)。

中圖分類(lèi)號(hào):Q755； S511.01

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1001-7216(2016)03-0223-09

中國(guó)水稻科學(xué)(Chin J Rice Sci),2016,30(3):223-231

http://www.ricesci.cn