李　杰， 田相利， 董雙林， 高明亮， 張　凱， 奉　杰， 班文波， 張慶起

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.連云港市贛榆區(qū)海洋漁業(yè)技術指導站，江蘇 連云港 222100)

添加糖蜜對蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體細菌群落結構的影響?

李杰1， 田相利1??， 董雙林1， 高明亮1， 張凱1， 奉杰1， 班文波1， 張慶起2

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.連云港市贛榆區(qū)海洋漁業(yè)技術指導站，江蘇 連云港 222100)

摘要：為探討?zhàn)B殖水體中細菌群落結構與不同環(huán)境因子的關系。本文通過添加糖蜜將外源添加物的(餌料和糖蜜)C/N調整為10、15、20和25四個不同水平(分別為C1、C2、C3和C4組)，以投喂基礎飼料作為對照組(C0)。利用PCR-DGGE技術和冗余分析方法(RDA)，分析了添加糖蜜對蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中細菌群落結構的影響。研究表明：蝦蟹混養(yǎng)池塘水體中細菌菌群主要由放線菌綱、藍藻綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、ε-變形菌綱、擬桿菌綱和芽孢桿菌綱組成。C1、C2、C3和C4四個處理組的細菌群落結構相似，與C0組差異顯著。各處理組的優(yōu)勢菌群相似，其相對含量存在一定差異，放線菌綱在整個養(yǎng)殖過程中占據(jù)優(yōu)勢地位。與對照組相比，實驗組細菌群落的多樣性隨養(yǎng)殖時間的延長明顯增加，于8月檢測到γ-變形菌綱，于9月檢測到ε-變形菌綱和芽孢桿菌綱。各處理組相比較，Pielou均勻度指數(shù)變化不明顯，Shannon-Winener指數(shù)隨C/N水平的升高呈先上升后下降的趨勢，在養(yǎng)殖后期,C2處理組的Shannon-Winener指數(shù)明顯高于其它處理組，C4處理組最低。RDA分析表明，蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中菌群結構的變化是多種環(huán)境因子綜合作用的結果。影響細菌群落多樣性的主要環(huán)境因子的重要性在7月為TOC>-N，在8月為P，在9月為-N>pH>TN>TOC。綜合水質指標、菌群結構和多樣性分析結果表明：調控外源添加物C/N為15時，水體細菌群落多樣性高、組成差異小、結構穩(wěn)定，有利于蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)的水質條件優(yōu)化。

關鍵詞：蝦蟹混養(yǎng)；水體；環(huán)境因子；PCR-DGGE；C/N；冗余分析；細菌群落；多樣性指數(shù)

引用格式：李杰，田相利，董雙林，等. 添加糖蜜對蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體細菌群落結構的影響[J].中國海洋大學學報(自然科學版)， 2016， 46(5): 38-49.

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生物絮團是水體中的藻類、異養(yǎng)微生物、原生動物與殘餌等形成的團絮狀有機碎屑[1]。水體中的殘餌及氨氮、亞硝氮等有毒物質可以通過生物絮團被異養(yǎng)微生物和藻類利用，從而有效改善水質[2]。同時，絮團可以被部分養(yǎng)殖動物攝食，實現(xiàn)餌料的多重利用，從而顯著提高養(yǎng)殖生物的生長特性，節(jié)約生產成本[3-4]。另外，有研究表明生物絮團還能夠在一定程度上抑制病原菌，提高動物的免疫力[5]。因此，生物絮團技術在養(yǎng)殖中的應用越來越受到人們的關注，其技術的核心是通過調節(jié)合適的水體碳氮比，從而人為控制生物絮團的形成[4]。Avnimelech通過計算得出當飼料中C/N=15.75時，可以促進微生物合成菌體蛋白，并有效去除養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸鹽氮[6]。當水體C/N水平為10～20時，有利于異養(yǎng)菌的繁殖，對絮團的形成起到促進作用[7-8]。

目前，生物絮團技術作為一種改善養(yǎng)殖水體環(huán)境的重要手段已在國內外水產養(yǎng)殖中得到廣泛應用，但對該技術的研究多集中于凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、日本囊對蝦(Penaeusjaponicus)和羅非魚(Tilapia)等水產動物的單一養(yǎng)殖模式中[1-2,9-10]，對其在混養(yǎng)模式中的應用研究較為缺乏。三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是中國大型的海產經濟蟹類之一，其與凡納濱對蝦的混合養(yǎng)殖是中國沿海地區(qū)水產養(yǎng)殖的重要模式之一[11]，迄今未見生物絮團技術對該養(yǎng)殖模式中細菌群落結構等的影響。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)是在基因水平上，通過分析DNA分子的種類和數(shù)量來鑒定微生物種群結構特征的一種現(xiàn)代分子生物學技術[12]，具有操作簡單、重復性好和分析樣品量大等優(yōu)點。1993年Muyzer首次利用該技術分析了生態(tài)環(huán)境中細菌群落的多樣性，目前該技術在對海洋微生物的研究中已得到廣泛應用[13]。例如，傅蓮英采用PCR-DGGE技術分析蝦蟹養(yǎng)殖水體及沉積物中細菌群落多樣性的變化[14]。Petri等應用該技術研究了西波羅的海海冰垂直成層結構中細菌群落的遺傳多樣性[15]。通過控制水體C/N水平調控水體細菌等微生物的組成和功能，是生物絮團技術的核心之一[2,6]。本研究利用PCR-DGGE技術和冗余分析(RDA)等方法，分析了通過添加糖蜜調控外源添加物不同C/N水平對蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)中水體細菌群落結構的變化，探討了不同環(huán)境因子對細菌群落結構的影響，以期從微生物學角度為通過C/N調控養(yǎng)殖水體水質技術提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗池塘與圍隔

本研究于2013年7—10月在江蘇省贛榆縣佳信水產開發(fā)有限公司海水養(yǎng)殖池塘中進行。實驗池塘為泥沙質底。實驗采用海水池塘陸基圍隔實驗法進行，其中圍隔由支架和圍隔幔構成，以木樁、竹竿等為支架，以高密度聚乙烯編織布為圍隔幔，架設于池塘中，面積為5m×5m，圍隔的初始條件一致，圍隔與圍隔之間是完全獨立的，且無水的交流，其具體結構參見文獻[16]。實驗期間，養(yǎng)殖水體利用充氣泵進行連續(xù)充氣。

1.2 實驗設計與管理

1.2.1 實驗設計實驗設置了5個不同處理組，每組3個平行。各處理組通過添加糖蜜調控其C/N水平，分別設置為10(C1)、15(C2)、20(C3)和25(C4)，以不添加糖蜜組作為對照(C0，C/N在3.35～5.16之間)，詳見表1。本實驗中的C/N指外源添加物(餌料和糖蜜)的碳元素與氮元素的質量比。

實驗圍隔中均放養(yǎng)三疣梭子蟹密度為6ind/m2，放養(yǎng)凡納濱對蝦密度為45ind/m2。實驗用三疣梭子蟹苗及凡納濱對蝦皆購自連云港贛榆佳信水產開發(fā)有限公司。三疣梭子蟹放養(yǎng)時平均甲寬(1.71±0.21)cm，平均甲長(0.88±0.10)cm，平均體重(0.29±0.03) g。凡納濱對蝦放養(yǎng)時體長(1.76±0.44)cm，平均體重(0.12±0.03)g。三疣梭子蟹和凡納濱對蝦于2013年7月13日放養(yǎng)，于10月12日收獲完畢。

根據(jù)Avnimelech總結的生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)的C/N調控公式[6]，并根據(jù)餌料投喂量調整不同實驗組糖蜜的添加量。糖蜜添加計算公式為：

C/N=(ΔCH×C1%+Feed×C2%)/(Feed×N%)。

式中：ΔCH為糖蜜添加量；C1%為糖蜜中有機碳含量；Feed為投餌量；N%為餌料中N的含量。

三疣梭子蟹餌料選用鮮活藍蛤(殼肉比為3.27，含水率為78.29%，含碳量32.78%，含氮量9.76%)；凡納濱對蝦選用連云港正大農牧有限公司生產的對蝦配合飼料(含水率7.00%，含碳量34.65%，含氮量6.72%)。添加碳源為購于山東壽光某公司的糖蜜(總有機碳含量28.91%)。

表1　實驗設計及糖蜜添加

Note:①Treatments; ②Stocking density of Litopenaeus vannamei; ③Stocking density of Portunus trituberculatus; ④Molasses addition to shrimp feed; ⑤Molasses addition to creep feed

1.2.2 實驗管理鮮活藍蛤每日18:00—19:00投喂1次，投喂量參照周演根等[11]。對蝦飼料每天投喂2次，投喂時間為7:00—8:00與18:00—19:00。每7d檢查生長，根據(jù)蝦蟹生長情況調整餌料投喂量。

養(yǎng)殖期間圍隔不換水，僅補充因蒸發(fā)與滲漏造成的損失，水深保持在1.2～1.4m之間。7月底開始使用增氧機充氧。每晚10:00至次日清晨6:00充氣，晴天下午2:00—4:00充氣，并根據(jù)天氣狀況調整。隨著餌料投喂量與糖蜜添加量的增加，生物絮團逐步形成后調整成全天24h連續(xù)充氧。

糖蜜根據(jù)投餌量隨時調整，充分溶解后潑灑，每2h潑灑1次，天氣狀況不好不潑灑。

1.3 實驗樣品的采集與預處理

實驗于2013年7—9月開展。每月下旬，用采水器在實驗圍隔的3個固定點、水深為0.5m左右處分別采集1000mL水樣，置于無菌的聚乙烯瓶中。待靜置30min后，經800目篩絹過濾，0.22μm抽濾后，濾膜置于無菌EP管中，于-80℃超低冰箱中保存待測，水樣立即用于水質指標(總氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮、活性磷、總磷和總有機碳)的測定。

1.4 日常水質指標測定

1.5 變形梯度凝膠電泳DGGE

1.5.1 DGGE凝膠電泳采用CTAB化學法提取水體總DNA，以總DNA為模板，對細菌16SrDNA的特異性片段V3區(qū)進行PCR擴增，特異性擴增引物為GC-341f和534r。PCR反應體系(50μL)為：2×Taq Master Mix25μL，DNA模板2μL，上下游引物各1μL，ddH2O 21μL。以DNA maker-2000為標準，檢測PCR擴增片段在1%的瓊脂糖凝膠的位置。將PCR擴增產物置于聚丙烯酰胺凝膠(變行劑梯度為40%～65%)的點樣孔內，在1×TAE的緩沖液中進行電泳(時間為16h)，然后將凝膠置于5μg/mL的溴化乙錠溶液中進行避光染色，蒸餾水漂洗后用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行拍照分析。

1.5.2 DGGE條帶的切割、回收、克隆、轉化和測序在紫外燈照射下切割DGGE泳道上較亮的特征條帶，置于50μL的ddH2O中，4℃過夜。選用Zymoclean凝膠回收試劑盒純化回收優(yōu)勢條帶的DNA。將回收純化的DNA連接到pEASYT1載體上進行克隆，然后將連接產物導入Transl-T1感受態(tài)細胞中完成DNA的轉化。在LB培養(yǎng)基上挑取白色的陽性克隆產物，通過載體通用引物M13F/R進行檢測，然后在測序公司完成測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用BIO-RAD公司的Quantity One4.6.1軟件對DGGE電泳圖譜進行數(shù)據(jù)處理和分析。采用BLAST軟件找出與目的基因同源相似性高的序列。系統(tǒng)發(fā)育樹的建立采用MEGA6.3軟件。分別用香農維納指數(shù)(H′)和Pielou指數(shù)(J)來評價細菌群落的多樣性和均勻度。

計算公式為：H′=-∑PilnPi;

J=H′/lnS。

式中：Pi為第i條帶的灰度占該樣品總灰度的比率；S為樣品所有條帶的總數(shù)目。

采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。以P<0.05作為差異顯著水平。運用生物統(tǒng)計學軟件CANOCO4.5將數(shù)字化的DGGE指紋圖譜和環(huán)境因子相結合，完成冗余分析(RDA)。

2結果

2.1 蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中環(huán)境因子指標

2.2 水體細菌群落的結構特征

圖1為水體細菌群落結構的DGGE指紋圖譜。結果表明，7月各個處理組含有的共性條帶數(shù)量最多，條帶數(shù)目及停留位置均差異不大，表明7月水體細菌群落結構特征相似。而8、9月代表不同處理組的條帶在電泳圖譜組中數(shù)量、停留位置均出現(xiàn)差異，各處理組既含共性條帶，也含特異性條帶，而9月位于同一位置的條帶亮度也出現(xiàn)不同程度的變化，說明細菌菌群在DNA分子水平上可能發(fā)生了變化。從整個養(yǎng)殖實驗來看，C0和C4組含有的條帶數(shù)目較少，C1～C3組含有條帶數(shù)目較多，其中C3組8月最多，條帶數(shù)目為30、29、29，C2組9月最多，條帶數(shù)目為34、35、35，而C4組最少，條帶數(shù)目為28、27、24。綜合以上結果，各處理組間的細菌類型仍存在一定相似性，但隨著養(yǎng)殖時間的推移，不同C/N水平下細菌群落結構特征差異越來越顯著。

對水體DGGE指紋圖譜中可辨認的條帶進行切割、回收測序，獲得陽性克隆序列為：7月21條，8月26條，9月25條，大小均在169～196bp之間。測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行檢索并進行BLAST分析，結果表明切膠序列與已知物種序列具有極高的相似度(98%～100%)。根據(jù)測序結果構建的水體菌群系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。結果表明，7月水體細菌的優(yōu)勢菌群主要歸屬于7個綱：放線菌綱(Actinobacteria)、藍藻綱(Cyanobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)和擬桿菌綱(Bacteroidetes)。其中，放線菌綱條帶數(shù)目在C1組分布最多，C3組條帶數(shù)目最多為α-變形菌綱，而C4組的藍藻綱條帶數(shù)目最多。8月水體細菌優(yōu)勢菌群主要歸屬于5個綱：放線菌綱、藍藻綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱(條帶數(shù)目最少，僅為1條，且只在實驗組出現(xiàn))和擬桿菌綱，其中，放線菌綱條帶數(shù)目在C1組分布最多，C4組的藍藻綱條帶數(shù)目最多，擬桿菌綱的條帶數(shù)目在各個處理組中分布均勻。9月水體細菌的主要優(yōu)勢菌群歸屬于放線菌綱、藍藻綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和擬桿菌綱等9個綱。其中C2組含有的放線菌群條帶數(shù)目最多，擬桿菌綱在C0和C1數(shù)目較多，8月未檢測到的δ-變形菌綱在9月重新出現(xiàn)。

2.3水體細菌群落的相對豐度

圖3為水體細菌群落的相對豐度圖。結果顯示，隨著養(yǎng)殖的進行，各處理組水體細菌群落的相對豐度出現(xiàn)差異，優(yōu)勢菌群發(fā)生變化。其中，7月各處理組的優(yōu)勢菌群為放線菌綱、α-變形菌綱和藍藻綱，相對含量分別在13.11%～32.28%、10.22%～21.32%和10.02%～23.85%間，而β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱和擬桿菌綱在各處理組中含量均較低，其中γ-變形菌綱僅在C4組出現(xiàn)。8月C0、C1、C2和C3中的優(yōu)勢菌群為放線菌綱，相對含量分別是30.55%、27.79%、27.89%和29.34%，其次是藍藻綱，而C4組的優(yōu)勢菌群是藍藻綱，相對含量是28.82%，其次是放線菌綱。γ-變形菌綱僅在C0～C4調控組被檢測到，其他種類的細菌含量以C1最高，相對含量達到26.81%，說明C1組優(yōu)勢菌群相對含量較低。在9月，放線菌綱是各處理組優(yōu)勢菌群，相對含量分別為34.94%、40.87%、37.06%、36.73%和39.26%，其中，C0的相對含量最低，而C1與C2組不含δ-變形菌綱?？傮w上看，芽孢桿綱和ε-變形菌綱為9月新出現(xiàn)菌群，且只在各C/N調控組出現(xiàn)，而β-變形菌綱僅出現(xiàn)在7月。綜合以上可以看出，不同C/N水平下水體細菌的優(yōu)勢菌群及其含量出現(xiàn)差異，表明細菌群落結構發(fā)生了變化。

表2　不同C/N水平的水體環(huán)境因子指標

注：表中同一列中標注的不同字母表示每月各數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。

Note:Data in the same column with different superscripts are significantly different in the same month (P<0.05).

圖1　水體細菌群落DGGE指紋圖譜

圖2　水體菌群16S rDNA-V3序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 水體細菌群落結構的CA分析

圖4所示為不同處理組的CA分析。從圖中的變量因子(C0、C1、C2、C3、C4分別由圖4中的A、B、C、D、E表示)載荷和卡方距離可以看出，代表不同處理的點分布在排序圖的不同空間。7月代表各處理組的點基本分布在排序圖的中心附近；8月中C2和C3處理分布在排序軸的中心附近，C1和C4分布其兩側，都與對照組C0相距較遠；而在9月，C2處理分布在排序軸的中心附近，與C1和C3處理差距不遠，C0和C4處理靠近在排序圖的邊緣。綜上表明，不同C/N水平條件下細菌群落的結構組成隨著養(yǎng)殖實驗的進行差異越來越明顯。

2.5 水體各類細菌群落的相對豐度與環(huán)境因子的RDA分析

將不同C/N水平條件下細菌群落結構DGGE圖譜數(shù)字化后與8種環(huán)境因子相結合進行RDA分析，兩者之間的關系如圖5所示。代表不同處理組的點分布在排序圖的不同空間，表明不同C/N水平條件下水體中細菌群落結構存在差異。

圖3　水體中各種細菌群落的相對豐度

(圖中大寫英文字母A、B、C、D和E分別代表C0、C1、C2、C3、C4不同處理組，A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D4和E1～E3分別代表相應處理的3個重復。A, B, C, D and E represents C0, C1, C2, C3 and C4, respectively and A1～A3，B1～B3，C1～C3，D1～D3 and E1～E3 represents three replicates for each treatments.)

圖4不同處理組的CA分析

Fig.4The CA analysis of different treatment group

圖5　不同C/N水平水體中各類細菌群落

2.6水體細菌群落多樣性

本研究采用香農-維納指數(shù)衡量細菌群落結構的多樣性，采用Pielou指數(shù)來反映群落結構的的均勻度[17]，從而對細菌群落結構進行相對準確的分析。從圖6可以看出，從時間尺度看，香農維納指數(shù)和均勻度指數(shù)在整體上均呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢，以8月最高，7月最低，9月略低于8月。從不同C/N水平來看，C2組香農維納指數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，較其他處理組要高；而均勻度最高值則出現(xiàn)在8月的C1組，與C2組相差不大。C4組香農維納指數(shù)和均勻度指數(shù)均最低，其他處理組則介于兩者之間。綜合上述2個指數(shù)可以看出，C2組細菌群落的多樣指數(shù)最高，C4組最低。

圖6　基于DGGE圖譜計算的Shannon-Winener

3討論

3.1 蝦蟹混養(yǎng)池塘水體中細菌的群落結構特征。

PCR-DGGE技術是現(xiàn)代分子生物學中用于鑒定并分析細菌群落多樣性變化的一種重要分析手段[18]，該方法消除了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的限制，可在基因水平上更加全面、真實地反映細菌群落的結構信息[19]。本研究以該技術手段分析了不同糖蜜添加量蝦蟹混養(yǎng)池塘7—9月水體中細菌群落結構的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，各處理細菌的優(yōu)勢菌群為放線菌、α-變形菌、藍細菌和一些未知不可培養(yǎng)細菌。這一結果與其它研究存在較大的差異。例如，羅鵬等研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門(β綱細菌占1/5)和CFB(Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides)是凡納濱對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群[20]；而夏耘等研究表明，在草魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中，絮團的主要細菌類型為變形菌、放線菌、擬桿菌及一些未知不可培養(yǎng)細菌[21]。這種差異可能與養(yǎng)殖種類、模式、養(yǎng)殖用水的類型以及添加的碳源和餌料的不同有關。本研究在養(yǎng)殖初期檢測到β-變形菌，但這些細菌在養(yǎng)殖后期未被檢測到，證實了Stevens等的研究結果[22]；養(yǎng)殖后期，C/N調控組新出現(xiàn)了ε-變形菌綱和芽孢桿菌綱細菌，這與趙培[23]的研究結果相似。

3.2 蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)中水體細菌群落結構的多樣性指數(shù)

群落多樣性是衡量群落穩(wěn)定性的重要指標，群落組成越復雜，其結構越穩(wěn)定，得到的緩沖越大，可以很好地應對外界環(huán)境的變化和群落內部種群的波動。表征生物多樣性指標的參數(shù)較多[29]，本研究使用了香農維納指數(shù)和均勻度指數(shù)?？梢钥闯?，細菌群落多樣性指數(shù)變化趨勢與DGGE指紋圖譜的分析結果基本一致。其中，7月的香農維納指數(shù)和均勻度指數(shù)最低，說明7月的細菌多樣性最低，群落組成最簡單，結構不穩(wěn)定[30]。而8、9月的細菌群落的香農維納指數(shù)相差不大，表明細菌群落結構較穩(wěn)定，抗外界干擾能力比較強。群落多樣性與養(yǎng)殖環(huán)境關系密切，當生態(tài)環(huán)境惡化時，微生物多樣性則會明顯下降[31]，且在一定范圍內，隨營養(yǎng)物質的增加而增大，而過高則會受到抑制[32]。本研究發(fā)現(xiàn)處理組C1、C2和C3的香農維納指數(shù)高于對照組，其中C2組的多樣性指數(shù)數(shù)值在養(yǎng)殖后期明顯高于其它處理組，而C4組則為最低。這表明C/N水平影響不同養(yǎng)殖模式水體細菌群落多樣性，當C/N水平過高時，則可能會抑制環(huán)境敏感細菌的生長和繁殖，造成多樣性的下降[24,31,33-34]。

3.3 蝦蟹混養(yǎng)池塘水體中細菌群落結構與環(huán)境因子之間的關系

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責任編輯朱寶象

Effect of Molasses Addition on Microbial Community Structure in the Polyculture System ofPortunustrituberculatusandLitopenaeusvannamei

LI Jie1, TIAN Xiang-Li1, DONG Shuang-Lin1, GAO Ming-Liang1, ZHANG Kai1,FENG Jie1, BAN Wen-Bo1, ZHANG Qing-Qi2

(1.The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Marine Fishery Technology Guiding Office, Ganyu, Lianyungang 222100, China)

Abstract：Bacteria are producers and decomposers of the microbial ecosystem, playing a very important role there in the material circulation, energy flow, environmental improvement and prevention of diseases, and being closely related to the diseases outbreaking frequently among the farming and breeding ani-mals. Accordingly, it is very significant to study microbial community composition, structure and function. In the present study, the PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) technology, redundancy analysis (RDA) and the diversity index were employed to characterize the bacterial community structure in the polyculture system of Portunus tritiberculatus and Litopenaeus vannamei to investigate the effect of abiotic factors. In terms of microbiology, the regulation of C/N could be a useful mean of improving aquatic environments; it can promote the growth of P. trituberculatus and L. vannamei in the polyculture system. The group treated with basic feed was used as control(C0). Four other C/N levels (i. e. 10, 15, 20 and 25) were set in this experiment by adding molasses into artificial feed, and the four treatments were represented by C1, C2, C3 and C4 group, respectively. Results from this study demonstrated that the major bacteria included Actinobacteria, Cyanobacteria, Proteobacteria (α, β, γ, δ and ε), Bacteroidetes and Bacillibacteria in seawater of this polyculture system. In this study, the results had significant difference from those of other researches, which may be cause by the different culture of species, breeding patterns, type of aquaculture water and the addition of carbon and feed. Change in community structure of bacteria in water is related to the content and proportion of C and N. A similar bacterial community structure was obtained between treatments of C1, C2, C3 and C4, all being significantly different from C0 group. All treatments had a similar dominant bacterial community and Actinobacteria dominated all aquaculture experiment, while there was a significant difference between treatments in the relative amount of dominant bacterial community. In comparison with the control, the microbial community diversity increased with the aquaculture time. Rather than control group, γ-Proteobacteria was detected in August in other treatments and ε-Proteobacteria and Bacillibacteria in September. These findings illustrated that adding carbon into the aquaculture water appropriately may make contribution to the growth of aquaculture probiotic. CA analysis showed that the difference between the bacterial community compositions is more significant in the later stage of the experiment. When compared with other groups, C2 group has a better bacterial community composition and more stable structure. The diversity index showed a variation trend of increasing firstly and reached the maximum in August and then decreased. No significant change of Pielou index was observed among all treatments, while Shannon-Winener index increased firstly and then decreased, being the highest in C2 group and the lowest in C4 group in September. From the results, it was showed that C/N ratio affected aquatic microbial community diversity. It might inhibit the growth and reproduction of the environmentally sensitive bacteria when C/N level was too high, which will decrease the diversity of the microorganisms. According to RDA analysis, the change in microbial community structure was the synergistic result of multi-abiotic factors, of them TOC > TN > -N > TP > -P > -N in July, TP > -N> P in August and -N > -N> -P > -N > pH > TN > TOC in September. It showed that TOC was an important factor in early experiment. Besides, despite the different specific forms, N and P are the important elements, which could affect the microbial community structure during the entire breeding process. The preliminary experimental results showed that the C/N level of 15 was better for the polyculture system of P. trituberculatus and L. vannamei in seawater purification and in the maintenance of microbial community structure.

Key words:polyculture; water quality; environmental factor; PCR-DGGE; C/N; redundancy analysis; bacterial community; diversity index

基金項目：? 國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAD13B03)；山東省杰出青年基金項目(JQ201009)資助

收稿日期：2015-02-04；

修訂日期：2015-12-13

作者簡介：李杰(1985-)，女，碩士生，從事水產養(yǎng)殖生態(tài)學研究。E-mail：lijiexiaomai@163.com ??通訊作者： E-mail：xianglitian@ouc.edu.cn

中圖法分類號：S917.1

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)05-038-12

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150040

Supported by National Great Project of Scientific and Technical Supporting Programs(2011BAD13B03)；Program for Excellent Youth Foundation of Shandong Province(JQ201009)