譚　韜，唐　倩 綜述，伍　彬,劉應(yīng)杰,曾　雪 審校

(重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥物分析教研室　401331)

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水體和動物源性食品中殘留抗生素的新型檢測技術(shù)研究進(jìn)展*

譚韜，唐倩 綜述，伍彬△,劉應(yīng)杰,曾雪 審校

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥物分析教研室401331)

[關(guān)鍵詞]殘留抗生素；檢測技術(shù)；樣品預(yù)處理；聯(lián)用技術(shù)

由于醫(yī)療、個人護(hù)理品、養(yǎng)殖等領(lǐng)域幾十年來的抗生素濫用，有的抗生素在土壤中的殘留量已達(dá)到了有機農(nóng)藥污染物的水平[1]，所帶來的一系列問題已引起警覺。據(jù)報道，2013年中國抗生素的產(chǎn)量達(dá)12.12萬噸，成為世界第一抗生素生產(chǎn)和消費大國。目前常見抗生素檢測方法為微生物檢測法、免疫學(xué)分析法、電磁傳感器、現(xiàn)代儀器法等[2-4]。微生物檢測法用于抗生素殘留檢查的初篩，存在耗時、定性差等問題；免疫法的檢測對象較為單一；傳感器雖可快速檢測多種抗生素，但難以確認(rèn)種類，而現(xiàn)代儀器法能同時對多種殘留抗生素進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。本文就國內(nèi)外對自然水體、蜂蜜、牛奶、水產(chǎn)品、禽肉、蛋等樣品中殘留抗生素的檢測技術(shù)、樣品預(yù)處理及應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，其中重點介紹以色譜法為代表的現(xiàn)代儀器檢測技術(shù)。

1自然水體

60多種抗生素在我國地表水中被測出，其總體濃度與檢出頻率均高于其他國家。這些抗生素主要來源于制藥廠和醫(yī)院廢水的排放、畜牧養(yǎng)殖的廢水及糞便等殘渣、生活污水。

自然水體中抗生素多為ng/L～μg/L級別，因此良好的樣品富集方法、高效的分離手段及高靈敏檢測器就尤為重要。楊常青等[5]采用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-HPLC-MS/MS)法建立了水中磺胺(SAs)、氟喹諾酮(FQs)、四環(huán)素(TCs)和氯霉素(CAPs)4類共16種抗生素同時檢測的方法。該研究選擇了HLB作為固相萃取填料，采用兩種溶劑(甲醇及含氨水的甲醇)組合對目標(biāo)抗生素進(jìn)行洗脫，在減少洗脫溶劑用量的同時又提高了回收率，獲得了良好的富集效果，還利于下一步的氮吹操作。該方法的回收率為69.5%～122.6%，檢出限達(dá)到0.05～0.32 ng/L。

Hu等[6]采用凍干法(FDP)對樣品進(jìn)行富集，采用LC-MS/MS法共測量了水樣中26種殘留抗生素。這種富集方法操作簡單，可同時對6大類26種抗生素進(jìn)行富集，能減小目標(biāo)分析物的損耗，回收率高，優(yōu)于液液萃取和固相微萃取技術(shù)。富集后的樣品，應(yīng)選用適合ESI-MS系統(tǒng)的溶劑溶解，必要時需進(jìn)行冷凍離心(4 ℃)及過濾處理。

較于高效液相色譜(HPLC)，超高效液相色譜(UPLC)具有更省時、更靈敏、分離效果更好、抗基質(zhì)干擾能力更強等特點。Gros等[7]采用SPE-UPLC-MS/MS對醫(yī)院、城市廢水及自然水體中的53種殘留抗生素及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測。Gros在HLB和MCX間也選了凈化富集能力更好的HLB。研究表明富集前加入EDTA-Na2并采用低pH條件(pH=2.5)，可獲得更好的富集效率。該研究用新型Acquity HSS T3色譜柱取代了C18，使用梯度洗脫技術(shù)后更能大大改善峰形、提高分離效果；檢出限達(dá)到了ng/L級別，回收率為30%～120%。

目前，HLB材料對水體中殘留抗生素具有較高的富集效率而被優(yōu)先采用，研究也表明C18柱對于自然水體中的喹諾酮類抗生素有較高的富集效率[8]。由于MS/MS靈敏度高，可對紫外吸收較低的抗生素(如氨基糖苷類)進(jìn)行檢測，因此常與LC聯(lián)用。由于MS強大的定性、定量分析能力，甚至可認(rèn)為LC不過是MS的進(jìn)樣系統(tǒng)。

2動物組織類食品

在養(yǎng)殖業(yè)中作為治病和促生長藥物的抗生素被動物大量攝入；此外，動物還會通過進(jìn)食(如水、食物、花蜜等[9])攝入環(huán)境中殘留的抗生素。其中，90%的抗生素會以原形和活性代謝產(chǎn)物等形式排到自然界中[10]，使水環(huán)境出現(xiàn)持續(xù)低濃度抗生素污染，不光會對水生生物產(chǎn)生遠(yuǎn)期毒性作用，還會使得水環(huán)境中微生物群落產(chǎn)生對抗生素的耐藥性；另一部分抗生素將在動物組織內(nèi)殘留蓄積進(jìn)入人類食物鏈，導(dǎo)致人類進(jìn)一步濫用抗生素。由于動物組織樣品較復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)和脂類，如不進(jìn)行合適的樣品預(yù)處理(提取、凈化)及富集，會對色譜柱產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞，因此良好的樣品預(yù)處理方案將有助于殘留抗生素的準(zhǔn)確檢測。

萃取法是最經(jīng)典的樣品預(yù)處理方案，該方法簡單易行，在對動物組織中殘留抗生素的研究中用得較多。Dasenaki等[11]采用UHPLC-ESI-MS/MS對魚、豬、家禽肉中的17種磺胺類抗生素和5種四環(huán)素類抗生素進(jìn)行了分離分析。該研究采用萃取法對均漿后的樣品進(jìn)行提取凈化，線性范圍為20～150 μg/kg，線性相關(guān)系數(shù)高于0.98，檢出限為10～20 μg/kg。

Abdallah等[12]采用了優(yōu)化了的“QuEChERS” 方法(Quick、Easy、Cheap、Rugged、Safe) 對樣品進(jìn)行了快速樣品前處理，使用HPLC-HRMS對豬、牛、羊、雞的腎、肝、肉中22種磺胺類抗生素及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測。該研究檢出限為3～26 μg/kg，定量限為1～88 μg/kg，回收率為88%～112%。

SPE法也常用于這個領(lǐng)域中。Jafari等[13]采用C18富集了雞肉中的殘留抗生素，并第一次采用離子淌度譜檢測了禽肉中的3種抗生素。離子淌度譜具有檢出限低、響應(yīng)快速、便攜性好的特點。該研究采用了連續(xù)電暈放電的電離源，獲得了更高數(shù)量級的離子流，提高了檢測分辨能力，線性關(guān)系可達(dá)0.99以上，定量限為12.5～19.7 μg/kg。

湍流色譜法是一種直接在線進(jìn)樣預(yù)處理技術(shù)，能使大分子的生物基質(zhì)成分與小分子抗生素良好分離。Bousova等[14]采用LC-MS/MS對雞肉中36種抗生素進(jìn)行了分離分析。該方法先用乙腈與2%三氯乙酸(45∶55,v/v)對均漿后的雞肉樣品進(jìn)行萃取、離心、過濾之后采用湍流色譜法進(jìn)行富集凈化。結(jié)果表明，湍流色譜法的富集效率優(yōu)于固相萃取技術(shù)，該方法對24種抗生素及其代謝產(chǎn)物的檢出限達(dá)到了0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，回收率為80%～120%。

目前LC-MS/MS在動物源性食品中殘留抗生素檢測中大量應(yīng)用，我國也有成熟的檢測標(biāo)準(zhǔn)(如，GB/T 21317-2007，GB/T21320-2007，GB/T 21315-2007，GB/T 21312-2007等)。在與LC聯(lián)用后，MS不光可以對目標(biāo)抗生素進(jìn)行定性、定量、結(jié)構(gòu)分析，還能對抗生素在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量和結(jié)構(gòu)分析，這大大方便了藥代動力學(xué)的研究[15]。

3蜜、乳、蛋等

抗生素也會在動物所產(chǎn)的蜜、乳、蛋中殘留[16]，各國都明確規(guī)定了蜜、乳、蛋中抗生素最大允許殘留量。

3.1色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)各國基于LC-MS建立起來的蜜、乳、蛋中抗生素檢測方法(如我國，GB/T 22968-2008，GB/T 18932.25-2005，GB/T 23411-2009等)，基本上采用SPE法對樣品進(jìn)行凈化富集。

Bohm等[17]用HLB材料的SPE法對蜂蜜樣品進(jìn)行了預(yù)處理和富集，然后采用LC-MS/MS對樣品中37種抗生素進(jìn)行了準(zhǔn)確測量，確定限(CCα)達(dá)到了7.5～12.9 μg/kg，檢測容量(CCβ) 達(dá)到9.4～19.9 μg/kg，回收率為92%～106%。

Jiménez等[18]也采用了LC-MS/MS對蛋進(jìn)行檢測。不同的是，該研究采用了加壓萃取技術(shù)(PLE)對蛋中殘留抗生素進(jìn)行了凈化和富集。提取物無需再進(jìn)行其他的凈化處理，用微孔濾膜過濾后即可直接采用UHPLC-MS/MS進(jìn)行檢測。該方法一共測定了蛋中41種殘留抗生素，CCα可達(dá)到0.5～3.0 μg/L，CCβ 達(dá)到1.0～3.0 μg/L。但結(jié)果表明，該研究對蛋中殘留四環(huán)素的定量分析能力略為遜色。為了得到較高的萃取效率，Xu等[19]采用了改良后的中空纖維液相微萃取技術(shù)(HF-SEBLLME)。這種技術(shù)需要一種含有金屬絲的中空纖維管，內(nèi)充萃取液，放入樣品溶液中。開啟磁力攪拌器，含金屬絲的中空纖維管會快速轉(zhuǎn)動，能大大提高萃取效率。提取物經(jīng)富集后，采用GC進(jìn)行檢測，線性范圍為0.20～20.00 ng/mL，檢出限為0.02～0.06 ng/mL，定量限為0.07～0.19 ng/mL,回收率為93.6%～104.6%。研究數(shù)據(jù)表明這種萃取技術(shù)擁有更低的檢出限，優(yōu)勢明顯。

3.2毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)邵鈺秀等[20]建立了一種采用電堆積方式在線富集的毛細(xì)管電泳技術(shù)對牛奶、雞蛋和蜂蜜中四環(huán)素、土霉素、強力霉素進(jìn)行了檢測。在正向進(jìn)樣電壓作用下，pH值為3的樣品溶液中以陽離子形態(tài)存在的TC、OTC和DC在高場作用下快速電泳進(jìn)入毛細(xì)管，當(dāng)其穿越低電導(dǎo)率樣品和高電導(dǎo)率運行緩沖液界面時，由于進(jìn)入低場區(qū)，其運動速度將立即降低，發(fā)生分析物離子在樣品與緩沖液界面處的堆積，由此實現(xiàn)了對分析物的在線富集。在優(yōu)化條件下，四環(huán)素、土霉素和強力霉素的富集倍數(shù)分別為86、54和54，檢出限為1.7～2.1 μg/kg,1.8～2.2 μg/kg和1.9～2.2 μg/kg，定量限均為20 μg/kg。

分子印跡技術(shù)也可以用于樣品的預(yù)處理和富集，具有非常高的選擇性，稱為分子印跡固相萃取技術(shù)[21](MIPs-SPE)。Moreno-González等[22]就利用了這種技術(shù)，采用CE-MS聯(lián)用技術(shù)對牛奶中8種喹諾酮類抗生素進(jìn)行了檢測。首先他在毛細(xì)管的一端內(nèi)嵌進(jìn)自制的分子印跡材料，通過加壓進(jìn)樣的方式壓入約22 μL樣品溶液，然后壓入甲醇/水/氨水(60/37/3) 溶液(約60 nL)進(jìn)行分子印跡材料上保留物的洗脫。加電壓前，還需用緩沖液將這段洗脫物從吸附材料上替換下來。該方法的回收率為70.0%～102.3%。該研究認(rèn)為此富集技術(shù)與在線富集技術(shù)并不一樣，因此稱為管內(nèi)嵌入式富集技術(shù)(In-line-MISPE)。該研究還對比了不同方法在測量牛奶中喹諾酮類抗生素時的檢出限和定量限，見表1，該研究所提出的方法具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度。

4現(xiàn)狀與展望

抗生素殘留帶來的一系列問題已引起了民眾和政府的重視。研究者們依然在孜孜不倦地尋找著富集效率更高的樣品預(yù)處理方法，以及分離效率更好、檢測靈敏度更高、可測種類更多的分離檢測手段，見表2。

表1　不同方法在測量牛奶中喹諾酮類藥物時的檢出限和定量限對比

表2　樣品凈化和富集技術(shù)及分離和檢測方法的優(yōu)劣勢比較

續(xù)表2　樣品凈化和富集技術(shù)及分離和檢測方法的優(yōu)劣勢比較

對于抗生素殘留的研究將向著兩個方向發(fā)展：(1)快速準(zhǔn)確檢驗，其研究重點集中在高效快速的檢測手段開發(fā)。目前的研究希望整個樣品的分析時間能控制在25 min以內(nèi)，可無論是SPE等預(yù)處理法，還是LC-MS/MS等檢測技術(shù)，都存在著耗時、昂貴、對操作者技術(shù)要求過高等問題，難以應(yīng)對當(dāng)前廣泛的殘留抗生素檢測需求；而一些快速篩查技術(shù)，卻又存在著定性弱、準(zhǔn)確性較差、檢測種類單一等問題。未來新型檢測手段必將面臨方便、快捷、準(zhǔn)確、可同時檢測多種抗生素等要求的考驗。(2)抗生素的生物代謝情況及環(huán)境中的分布、轉(zhuǎn)歸、降解等情況的研究。這類研究將有助于揭開抗生素在生物體內(nèi)代謝情況和環(huán)境降解情況，也能為殘留抗生素的檢測尋找合適的殘留標(biāo)識物；還能揭示殘留抗生素在環(huán)境中的轉(zhuǎn)歸及分布規(guī)律，為殘留抗生素的環(huán)境修復(fù)工程提供準(zhǔn)確有效的數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

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doi:·綜述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.037

* 基金項目：重慶市衛(wèi)生與計劃生育委員會醫(yī)學(xué)科研計劃項目(2015MSXMD99)；重慶醫(yī)藥高專自科項目(CQZ2013109,YGZ2014106)。

作者簡介：譚韜(1981-)，講師，碩士，主要從事藥物與生物大分子相互作用方向的研究?！魍ㄓ嵶髡?E-mail:wubin3412@163.com。

[中圖分類號]X832;S859.84

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1271-04

(收稿日期：2015-07-08修回日期：2015-12-27)