熊應(yīng)權(quán)，陸　錚

(1.天津市海河醫(yī)院藥劑科,天津 300050；2.天津市南開醫(yī)院藥劑科，天津 300100)

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咖啡酸苯乙酯對(duì)糖尿病大鼠腎保護(hù)作用*

熊應(yīng)權(quán)1，陸錚2

(1.天津市海河醫(yī)院藥劑科,天津 300050；2.天津市南開醫(yī)院藥劑科，天津 300100)

[摘要]目的探討咖啡酸苯乙酯(CAPE)對(duì)糖尿病大鼠腎功能的保護(hù)作用及機(jī)制。方法將50只大鼠分為5組，對(duì)照組、模型組及CAPE低、中、高(12、24、48 mg/kg)劑量組，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ) 65 mg/kg制備糖尿病大鼠模型，第8周末測(cè)尿清蛋白(Alb) 、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和肌酐，腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定空腹血糖(GLU)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。取出腎臟，一部分腎組織用4 ℃生理鹽水沖洗后，稱質(zhì)量研磨制成勻漿，再離心，取上清液測(cè)定丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽氧化物酶(GSH)的活性、一氧化氮(NO)水平、一氧化氮合酶(NOS)和Na-K-ATP酶活性。另一部分腎組織光鏡下檢測(cè)組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果與模型組比較，CAPE高劑量組Alb和RBP明顯降低(P<0.05)；腎組織中NO、NOS、GSH和SOD活性明顯上升，MDA水平明顯下降，Na-K-ATP酶活性升高(P<0.05)，腎組織病理損傷減輕。結(jié)論CAPE能降低糖尿病大鼠腎臟損傷具有保護(hù)作用，起保護(hù)作用可能與提高腎臟抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]咖啡酸苯乙酯；糖尿病腎?。谎趸瘧?yīng)激；腎保護(hù)

近年來發(fā)現(xiàn)咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)具有抗炎抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性，其在缺血-再灌注中的保護(hù)作用已經(jīng)得到證實(shí)，其抗氧化保護(hù)作用備受關(guān)注[1-4]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病引起的一種慢性并發(fā)癥，是一種危害性巨大的漸進(jìn)性腎功能損害，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重腎衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為反應(yīng)性氧化產(chǎn)物過多是造成DN各種損害的共同機(jī)制[5-7]。CAPE對(duì)DN的保護(hù)作用目前尚少見報(bào)道。因此，本研究觀察DN大鼠氧化應(yīng)激水平，探討CAPE對(duì)DN大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平的影響及其腎臟保護(hù)作用，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用CAPE進(jìn)行輔助治療DN提供可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～240 g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXX(京)2007-0001；CAPE、鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；全自動(dòng)血液生化分析儀購自日本Hitachi公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)、一氧化氮(nitricoxide，NO)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)測(cè)定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法動(dòng)物處理與分組參照文獻(xiàn)[8]，將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，檢測(cè)血糖均正常，除對(duì)照組10只外，其余大鼠禁食12 h 后，一次性腹腔注射STZ 65 mg/kg (STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中，冰浴保存，現(xiàn)配現(xiàn)用)，注射72 h后，挑選血糖大于16.7 mmol/L的大鼠，繼續(xù)觀察飼養(yǎng)，7 d后測(cè)定血糖大于16.7 mmol/L的大鼠為糖尿病模型大鼠，挑選造模成功的40只大鼠分為糖尿病模型組和CAPE高、中、低劑量組(48、24、12 mg/kg)，每組10只。CAPE高、中、低劑量組大鼠分別給予CAPE 48、24、12 mg/kg，每天1次，持續(xù)8周，對(duì)照組、糖尿病模型組給予等量生理鹽水。第8周末次給藥后于代謝籠中收集24 h尿液，測(cè)尿清蛋白(Alb)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和肌酐，腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定空腹血糖(GLU)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。取出腎臟，一部分用4 ℃生理鹽水沖洗后，稱質(zhì)量研磨制成勻漿，再離心，取上清液測(cè)定MDA水平、SOD和GSH的活性、NO水平、NOS活性和Na-K-ATP酶活性。另一部分腎組織光鏡下檢測(cè)組織形態(tài)學(xué)變化。

2結(jié)果

2.1CAPE對(duì)糖尿病大鼠GLU和HbA1c的影響與對(duì)照組比較，其他各組大鼠GLU和HbA1c水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠GLU和HbA1c水平比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較。

2.2CAPE對(duì)糖尿病大鼠尿液Alb和RBP的影響實(shí)驗(yàn)采用收集24 h尿液，為了排除尿量的影響，Alb和 RBP均以Ucr校正。與對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠尿液Alb、RBP水平明顯升高(P<0.05)，經(jīng)CAPE干預(yù)后，尿液Alb和 RBP顯著降低(P<0.05)，CAPE高劑量組治療效果較好，CAPE中、低劑量組也有治療效果，且存在一定的劑量關(guān)系，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3CAPE對(duì)糖尿病大鼠腎臟MDA水平及GSH、SOD活性的影響與對(duì)照組相比，糖尿病模型組大鼠MDA水平明顯升高，而SOD、GSH活性明顯下降(P<0.05)；與糖尿病模型組比較，CAPE高劑量組大鼠MDA水平明顯下降，而SOD、GSH活性明顯升高(P<0.05)，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CAPE中、低劑量組也有一定的治療效果，但與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2　各組大鼠尿液Alb和 RBP水平比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與糖尿病模型組比較。

2.4CAPE對(duì)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)NO水平及NOS、Na-K-ATP酶活性的影響與對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠NO水平明顯降低、Na-K-ATP酶和NOS活性明顯下降(P<0.05)；與糖尿病模型組比較，CAPE高劑量組大鼠 NO水平明顯升高、Na-K-ATP酶和NOS活性明顯升高(P<0.05)，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CAPE中、低劑量組也有一定的治療效果，但與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

A：對(duì)照組；B：糖尿病模型組；C：CAPE低劑量組；D：CAPE 中劑量組；E：CAPE 高劑量組。

圖1光鏡下觀察各組大鼠腎組織(HE，×100)

表3　各組大鼠腎臟MDA水平及GSH、SOD活性

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與糖尿病模型組比較。

表4　各組大鼠腎臟NO水平及NOS、Na-K-ATP酶活性

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與糖尿病模型組比較。

2.5CAPE對(duì)糖尿病大鼠腎組織病理學(xué)的影響在光鏡下觀察，對(duì)照組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)正常，無異常病理表現(xiàn)；糖尿病模型組腎髓質(zhì)部彌漫性病變，腎盂擴(kuò)張，腎盂移行上皮增生，乳頭部腎小管和集合管灶性擴(kuò)張、上皮細(xì)胞增生，部分腎小管和集合管受到擠壓、萎縮，間質(zhì)水腫、炎性浸潤，管腔內(nèi)可見結(jié)晶樣物質(zhì)和脫落上皮等沉積；CAPE低劑量組數(shù)個(gè)腎小管萎縮、變性肺，間質(zhì)增生、炎性細(xì)胞浸潤；CAPE 中劑量組腎皮髓交界處散在腎小管鈣化；CAPE 高劑量組結(jié)締組織增生，異物肉芽腫結(jié)節(jié)散在，腎實(shí)質(zhì)未見異常，腎組織病理變化減輕，表現(xiàn)為輕度炎性浸潤，見圖1。

3討論

CAPE是蜂膠中一種天然的抗氧化成分，研究已經(jīng)表明具有抗炎抗氧化，消除自由基，調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用，具有良好的應(yīng)用前景[9-10]，但在糖尿病腎損傷中尚少見報(bào)道研究，DN發(fā)病率逐年上升，給社會(huì)和個(gè)人造成了巨大的負(fù)擔(dān)，DN造成腎衰竭從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)微量清蛋白尿，是DN早期主要臨床表現(xiàn)，是目前臨床診斷治療DN的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[11]，本實(shí)驗(yàn)采用STZ制備糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示其GLU和HbA1c顯著升高，8周后Alb和尿RBP顯著升高，表明糖尿病大鼠已逐步進(jìn)展為DN，給予CAPE干預(yù)后，Alb和尿RBP顯著下降，提示CAPE對(duì)DN有一定的保護(hù)作用，而GLU和HbA1c并無顯著變化，表明CAPE對(duì)血糖無影響。Na-K-ATP酶是判斷腎臟病情的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[12]，結(jié)合腎臟病理組織學(xué)檢查證實(shí)給予較長時(shí)間的CAPE后，會(huì)明顯改善腎損傷，對(duì)于腎臟病理形態(tài)及腎功能明顯改善，CAPE中、低劑量組中腎臟氧化指標(biāo)則只出現(xiàn)部分緩解和減輕，進(jìn)一步說明CAPE對(duì)腎臟的保護(hù)作用存在劑量關(guān)系。

DN增加自由基產(chǎn)物，使機(jī)體抗氧化劑防御系統(tǒng)活性的減低可引起糖尿病狀態(tài)下氧化應(yīng)激的加劇，造成惡性循環(huán)。MDA是反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)，SOD、GSH是機(jī)體主要的抗氧化酶，NO、NOS也是機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[13-15]，在本研究中通過CAPE干預(yù)后，與糖尿病模型組比較，CAPE高劑量組能顯著降低MDA水平，提高SOD和GSH活性，CAPE低劑量組治療效果較差，表明CAPE對(duì)腎損傷的保護(hù)作用有一定的劑量關(guān)系，同時(shí)糖尿病模型組大鼠NO水平降低，NOS活性降低，進(jìn)一步提示糖尿病對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞和NOS活性有損傷作用，經(jīng)過CAPE干預(yù)后，NOS活性增加，NO水平升高，顯示了CAPE對(duì)腎損傷的保護(hù)作用。

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CAPE對(duì)糖尿病大鼠腎臟會(huì)產(chǎn)生直接的保護(hù)作用，且存在一定的劑量關(guān)系，其保護(hù)機(jī)制可能與降低腎臟組織MDA水平，顯著增加GSH水平和SOD活性，提升NO水平、NOS活性和Na-K-ATP酶有關(guān)，從而提高機(jī)體組織抗氧化能力。本研究為目前臨床上糖尿病腎損傷的治療提供了參考依據(jù)，可能成為一個(gè)新的用于糖尿病腎臟氧化應(yīng)激損傷治療的輔助藥物，但這需要更進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

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Protective effect of caffeic acid phenethyl ester on kidney of STZ-induced diabetic rats

XiongYingquan1,LuZheng2

(1.DepartmentofPharmacy,TianjinMunicipalHaiheHospital,Tianjin300050,China;2.DepartmentofPharmacy,TianjinMunicipalNankaiHospital,Tianjin300100,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of caffeic acid phenethyl ester(CAPE) on the kidney function of STZ-induced diabetic rats and its mechanism．MethodsA total of 50 rats were divided into 5 groups:conrol group,model group,CAPE low,middle and high doses(12,24,48 mg/kg) groups.The diabetic rat model was established by a single injection of streptozotocin(STZ) 65 mg/kg.At the end of 8 weeks,urine Alb,retinol binding protein(RBP) and creatinine were detected and blood glucose and HbA1c were detected by collecting blood from abdominal aorta.The renal tissue was taken.The partial renal tissues were flushed by 4 ℃ normal saline,weighed,grinded into homogenate and centrifuged and the supernate was taken for measuring the levels of malondialdehyde (MDA),superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px),NO,NOS and Na-K-ATP.The histomorphological changes in another part of renal tissues were observed under optical microscopy.ResultsCompared with the model group,the Alb and RBP levels in the CAPE 48 mg·kg-1 group were significantly decreased(P<0.05),NO,NOS,GSH and SOD levels in renal tissues were significantly elevated,while the MDA level was significantly decreased,the Na-K-ATPase activity was increased(P<0.05),the renal histopathological injury was alleviated.ConclusionCAPE can reduce the renal injury in STZ-induced diabetic rats and has the protective effect,which may be related with increasing the renal function for anti-oxidative stress injury．

[Key words]caffeic acid phenethyl ester;diabetic nephropathies;oxidative stress;renal protection phenethyl ester

作者簡(jiǎn)介：熊應(yīng)權(quán)(1977-)，主管藥師，大學(xué)本科，主要從事臨床藥學(xué)與藥理學(xué)研究。

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.008

[中圖分類號(hào)]R965.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)04-0454-03

(收稿日期：2015-06-08修回日期：2015-10-14)