龔軒民,孫永東

(1.四川醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，四川瀘州 646000；2.四川醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院耳鼻喉科，四川瀘州 646000)

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miRNA-125b在鼻咽癌中的表達及與順鉑化療敏感性研究

龔軒民1,孫永東2△

(1.四川醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，四川瀘州 646000；2.四川醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院耳鼻喉科，四川瀘州 646000)

[摘要]目的探討微小RNA-125b(miRNA-125b)在鼻咽癌組織、血清中的表達及與順鉑化療敏感性的相關性。方法收集34例臨床確診鼻咽癌完整病例資料及組織和血清標本，另取患者癌旁組織為組織對照，同時收集34例健康體檢者血清標本為血清對照，運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time qPCR)法檢測miRNA-125b在癌組織、癌旁組織、血清中的表達，并進行統(tǒng)計學分析。結果miRNA-125b在癌組織的表達顯著低于癌旁組織(P=0.006)，在鼻咽癌患者血清中的表達顯著低于健康體檢者(P=0.000)；miRNA-125b在患者癌組織與血清中的表達無相關性(r=0.112，P=0.528)。miRNA-125b在癌組織中的表達與病理分型、T分期、N分期有關(P<0.05)，在患者血清中的表達僅與N分期相關(P<0.05)。miRNA-125b在癌組織中表達與順鉑化療敏感性呈負性相關(P<0.05)，在患者血清中的表達與順鉑化療敏感性無明顯相關性(P>0.05)。結論miRNA-125b的低表達可能參與了鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展，對鼻咽癌診斷、分型、分級有一定意義，在癌組織中的表達水平可作為篩選順鉑化療方案的指標之一。

[關鍵詞]微RNA-125b;鼻咽腫瘤;順鉑;化學療法；敏感性

鼻咽癌是鼻咽黏膜上皮腫瘤，惡性程度高，具有浸潤性強、易遠處轉移等特征，是頭頸部最為常見的惡性腫瘤。鼻咽癌對放、化療敏感，化療方案首選順鉑(DDP)+5-氟尿嘧啶(5-FU)[1]，但是臨床治療過程中存在部分患者對化療耐藥的現(xiàn)象，給最佳化療方案的選擇帶來一定盲目性。鼻咽癌的發(fā)生被認為與微小RNA(microRNA，miRNA)表達失衡有關，有研究證實miRNA-144在鼻咽癌組織中高表達[2]，miRNA-204在鼻咽癌組織中低表達[3]，這些現(xiàn)象可能會促進鼻咽癌侵襲和轉移。miRNA-125b表達異?？赡芘c腫瘤體積、侵襲、轉移相關[4]，并且miRNA-125b可能通過對靶基因調控來影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[5]。但是鼻咽癌患者miRNA-125b有無異常表達，目前還少見報道。本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time qPCR)法檢測鼻咽癌患者癌組織與血清miRNA-125b的表達，初步探討miRNA-125b與鼻咽癌發(fā)病的關系，以及對順鉑化療敏感性的影響。

1資料與方法

1.1一般資料選取四川醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院2012～2014年34例鼻咽癌患者為觀察組，其中男29例，女5例，年齡34～67歲，中位年齡54歲。在患者化療前收集癌組織、血清標本。同時取患者癌旁組織(距腫瘤邊緣大于3 cm，經病理證實為正常黏膜組織)，選擇同期健康體檢者34例血清為對照組。納入標準：(1)全部病例均經電子鼻咽鏡取得組織活檢，經病理確診為原發(fā)性鼻咽癌；(2)具備完整的臨床診斷、治療資料；(3)均經過DDP化療，3個療程或以上，具備化療效果比較；(4)患者無嚴重心、肝、腎、肺等全身性疾病，家屬及患者知曉本研究過程、目的、意義，并同意參與。主要試劑與儀器：總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京艾德萊生物)，血清RNA提取試劑盒(Applied Biosyste，美國)，引物設計與合成(上海生物工程公司)，ABI-7300定量熒光PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2方法氯仿提取法提取組織總RNA，mirVana miRNA Isolation試劑盒提取血清總RNA，以分光光度儀檢測260/280吸光度(OD)值。cDNA合成：取1 μg總RNA于20 μL反應體系為4.00 μL 5×RT緩沖液，0.75 μL 10 mmol/L dNTP，2.00 μL 25 mmol /L Mg2+，0.25 μL 40 U/μL RNA酶抑制劑，0.20 μL 200 U/μL逆轉錄酶，其余以dd H2O補足，反應條件為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min。real-time-qPCR：以U6為內參檢測目的基因相對表達量，U6、miRNA-125b引物序列見表1，反應總體積為20 μL為2×miRNA qPCR Mix(含Sybr Green) 10 μL、反向引物0.4 μL、正向引物0.4 μL、cDNA產物1.0 μL、其余用dd H2O補齊，反應條件為94 ℃預變性3 min;94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s，共40個循環(huán);所有反應設立3個復孔。得到Ct值，Ct值代表熒光達到閾值的循環(huán)數(shù)。

表1　引物序列

1.3順鉑化療敏感性判定采用國際抗癌聯(lián)盟實體腫瘤客觀療效標準。完全緩解(CR)：腫瘤完全消失，持續(xù)1個月以上；部分緩解(PR)：病灶最大橫徑與最大垂直徑乘積縮小50%以上，持續(xù)1個月以上；疾病穩(wěn)定(SD)：病灶兩徑乘積縮小不足50%，增大不超過 25%，持續(xù)1個月；進展(PD)：病灶兩徑乘積增大25%以上或有新病灶出現(xiàn)。高敏感組為CR+PR，低敏感組為SD+PD。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用中位數(shù)及四分位數(shù)(P25～P75)表示，配對樣本中目的基因miRNA-125b相對表達量采用2-△Ct，△Ct=CtmiRNA-125b-Ct U6，表示目的基因相對于內參基因表達量，獨立樣本中miRNA-125b的相對表達量2-△△Ct[6]，△△Ct=△Ct觀察組-△Ct對照組，表示觀察組相對于對照組目的基因表達量；癌組織與癌旁組織、患者血清與對照組血清miRNA-125b表達量比較采用秩和檢驗，癌組織、血清miRNA-125b相對表達量與臨床指標、順鉑化療敏感性關系，采用Mann Whitney U檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組miRNA-125b表達比較觀察組患者癌組織中miRNA-125b表達量2-△Ct為7.62(4.26～13.91)，癌旁組織表達量2-△Ct為10.38(6.53～17.27)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.744，P=0.006)。觀察組患者血清中miRNA-125b表達量2-△Ct為5.64(2.78～8.49)，對照組血清miRNA-125b表達量2-△Ct為9.16(6.34～14.05)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.992，P=0.000)。見圖1。

圖1　各組miRNA-125b相對表達量的比較

2.2觀察組患者癌組織與血清miRNA-125b表達相關性分析癌組織miRNA-125b相對表達量2-△△Ct為0.685(0.436～0.825)，血清miRNA-125b相對表達量2-△△Ct為0.569(0.407～0.705)。鼻咽癌患者癌組織與血清miRNA-125b表達不存在相關性(r=0.112，P=0.528),見圖2。

圖2　觀察組癌組織、血清miRNA-125b表達的相關性

2.3鼻咽癌患者miRNA-125b表達水平與臨床指標間的關系根據(jù)鼻咽癌患者性別、年齡、病理分型、T分期、N分期進行分組，分析癌組織、血清miRNA-125b表達與臨床指標的關系。結果顯示鼻咽癌組織miRNA-125b相對表達量2-△△Ct與性別、年齡無關，N+較N-分期表達顯著降低(P=0.000)；在病理分型的比較中，低、未分化型明顯低于中、高分化型(P=0.027)；T3～4期明顯低于T1～2期(P=0.016)。血清miRNA-125b相對表達量2-△△C與性別、年齡、T分期、病理分型無關，僅與淋巴結轉移相關(N+表達量明顯低于N-，P=0.031)，見表2。

2.4鼻咽癌患者miRNA-125b表達與順鉑化療敏感性關系化療高敏感組鼻咽癌組織miRNA-125b相對表達量2-△△Ct為0.712(0.569～0.847)，低敏感組為0.558(0.418～0.705)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.572，P=0.010)。化療高敏感組血清miRNA-125b相對表達量2-△△Ct為0.553(0.403～0.746)，低敏感組為0.571(0.401～0.712)，差異無統(tǒng)計學意義(Z=-0.782，P=0.429)，見表3、圖3。

表2　鼻咽癌患者癌組織、血清miRNA-125b的表達與臨床指標間的關系(n=34)

表3　鼻咽癌患者miRNA-125b表達與順鉑化療敏感性的關系

A:癌組織；B:血清。

圖3鼻咽癌患者miRNA-125b表達與順鉑化療敏感性的關系

3討論

miRNA是一類進化保守的單鏈非編碼RNA，長度為20～22個核苷酸。miRNA可以通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)結合，抑制其翻譯或者導致序列特異性靶mRNA降解，從而使基因沉默來發(fā)揮調節(jié)細胞增殖、凋亡、分化的生物學活性[7]。隨著人類基因圖譜的完善，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，僅僅占人類基因組不到3%的miRNA可能參與了30%左右的人類基因調控[8]，超過50%的miRNA位于腫瘤相關基因區(qū)域內。研究證實在人類多種惡性腫瘤組織中出現(xiàn)miRNA異常表達的現(xiàn)象[4,9]，提示某些miRNA可能作為癌基因或者抑癌基因在惡性腫瘤的發(fā)生過程中扮演核心角色。鼻咽癌的發(fā)病機制非常復雜，EB病毒感染被認為是重要原因之一，但新近研究發(fā)現(xiàn)和miRNA表達失衡也有密切聯(lián)系[2]。Sengupta等[10]揭示了鼻咽癌組織miRNA 表達譜，發(fā)現(xiàn)miRNA-29c、miRNA-212等8個miRNA 有較明顯的表達改變。miRNA-144、miRNA-204表達異常也被認為與鼻咽癌發(fā)病有關[2-3]。提示miRNA在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要作用。miRNA-125b是miRNA家族較為活躍的成員，可能對腫瘤發(fā)生起著調控作用，與分化、增殖、侵襲、轉移等諸多腫瘤細胞生物學活性相關[4,11-12]。據(jù)報道，miRNA-125b作為抑癌基因表達于肺癌[4]、肝癌[11]等癌組織中，作為癌基因表達于前列腺癌、胰腺癌[12]等癌組織中。但是在鼻咽癌組織中有無表達異常，還少見報道。本研究采用real time-qPCR分析鼻咽癌組織和癌旁組織miRNA-125b表達量，發(fā)現(xiàn)癌組織miRNA-125b較癌旁組織表達明顯降低(P=0.006)。提示miRNA-125b可能作為抑癌基因存在于鼻黏膜組織，其表達降低可能使得相關癌基因激活，從而參與到鼻咽癌的發(fā)生。

外周循環(huán)血miRNA穩(wěn)定性高，不易被降解。研究顯示，循環(huán)血miRNA對腫瘤早期診斷、分期、預后有一定預見作用[13]。熊偉明[14]通過miRNA芯片篩選鼻咽癌患者外周血清中表達異常的miRNA，發(fā)現(xiàn)有miRNA-296、miRNA-361等76個較健康志愿者高表達，miRNA-125b、miRNA-487b等104個較低表達。但是此研究僅進行了miRNA-125b的篩選，并沒有進行驗證檢測。本研究通過檢測血清中miRNA-125b水平發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者比較，鼻咽癌患者miRNA-125b表達明顯降低(P=0.000)，與癌組織的檢測結果相符合。但二者表達并無相關性，可能是由于樣本量較少，缺乏大樣本量的比對數(shù)據(jù)所致。

本研究進一步分析了miRNA-125b表達與臨床指標間的關系。鼻咽癌組織中miRNA-125b表達與淋巴結轉移、病理分型、T分期顯著相關(P<0.05)。在血清中，miRNA-125b表達與淋巴結轉移相關(P<0.05)。提示miRNA-125b可能參與了鼻咽癌的發(fā)展、轉移、侵襲。表明miRNA-125b作為抑癌基因與腫瘤細胞生物學活性、腫瘤進程密切相關[15-16]。聯(lián)合檢測鼻咽癌組織和血清miRNA-125b表達可能對臨床分期、分級有一定幫助。

miRNA-125b可以通過對Bap1、Bbc3、Neu1、Bcl2、Stard13等靶基因的調控來影響腫瘤細胞對化學治療藥物耐藥[5]。Duroux-Richard等[17]發(fā)現(xiàn)在血清中miRNA-125b水平可以作為抗腫瘤藥物利妥昔單抗使用的生物學指標。本研究結果顯示，對順鉑低敏感組患者鼻咽癌組織miRNA-125b表達要低于高敏感組(P=0.010)，而血清中表達無差異。表明在未使用化療藥物時癌組織miRNA-125b表達與順鉑化療敏感性呈一定負相關。但是據(jù)Chen等[18]的最新報道，采用順鉑治療的鼻咽癌患者miRNA-125b表達量會增加，反而降低了化療敏感性。但本研究分析的檢測指標均來自未進行化療的患者，二者研究對象有差異。同時這也說明鼻咽癌涉及miRNA-125b對順鉑耐藥的機制十分復雜，需要進一步探索，尤其是在分子水平對上下游通路進行研究。

綜上所述，miRNA-125b可能作為抑癌基因在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用，其表達變化可以反映鼻咽癌分型、淋巴結轉移、臨床分期等腫瘤進展程度。miRNA-125b有望成為鼻咽癌患者順鉑化療的篩選指標，為化療方案選擇提供依據(jù)。但是本研究依然存在樣本量少、缺乏相關分子機制研究作為支撐的局限，后續(xù)應該加強和相關研究機構的合作，進行大樣本量實驗進一步探索miRNA-125b和鼻咽癌的關系，為鼻咽癌的診斷、治療提供新思路。

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Study on expression of miRNA-125b in nasopharyngeal carcinoma and sensitivity of cisplatin chemotherapy

Gong Xuanmin1,Sun Yongdong2△

(1.College of Traditional Chinese and Western Medicine，Sichuan Medical University,Luzhou, Sichuan 646000,China;2.Department of Otolaryngology,Affiliated Hospital of TraditionalChinese Medicine,Sichuan Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the whether miR-125b expression having the abnormality in nasopharyngeal carcinoma tissues and serum and whether having the correlation with the sensitivity of cisplatin chemotherapy.MethodsThe intact medical records and tissue and serum samples in 34 cases of clinically diagnosed nasopharyngeal carcinoma were collected and the serum samples in 34 individuals undergoing the physical examination were also collected as the controls.The expression of miRNA-125b in carcinoma tissue,paracancerous tissue and serum was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (real-time qPCR).The statistical analysis was performed.ResultsThe expression of miRNA-125b in carcinoma tissue was significantly lower than that in paracancerous tissue(P=0.006),and serum miRNA-125b expression in nasopharyngeal carcinoma patients was significantly lower than that in the individuals undergoing the healthy physical examination(P=0.000);but the miRNA-125b expression had no correlation between the paracancerous tissue and serum(r=0.112，P=0.528).The expression of miRNA-125b in cancer tissues was correlated with the pathological typing,T staging and N staging(P<0.05),the serum miRNA-125b expression in carcinoma subjects was only related with the N staging (P<0.05).The expression of miRNA-125b in carcinoma tissue was negatively correlated with the sensitivity of cisplatin chemotherapy (P<0.05),however,there was no obvious correlation between the serum miRNA-125b level and the sensitivity of cisplatin chemotherapy (P>0.05).ConclusionThe low miRNA-125b expression may be involved in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma and plays a certain significance for the diagnosis,pathology typing and classification of nasopharyngeal carcinoma.Its expression level in cancer tissue can serve as one of indicators for screening out the cisplatin chemotherapy sche

[Key words]microRNA-125b;nasopharyngeal neoplasms;cisplatin；chemotherapy;sensitivity

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.022

作者簡介：龔軒民(1986-)，住院醫(yī)師，在讀碩士，主要從事鼻咽癌發(fā)病機制和中西醫(yī)結合治療的研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:sunyongd@126.com。

[中圖分類號]R739.63

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1515-04

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-02-06)