黃盛文，吳　嫻，許　吟，周　曼，劉興梅

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貴陽(yáng)地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥分子篩查結(jié)果分析*

黃盛文1，吳嫻1，許吟2，周曼2，劉興梅1

[摘要]目的了解貴陽(yáng)地區(qū)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥的發(fā)生率及基因突變分布情況。方法選取新生兒臍血DNA樣本515例，采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)G6PD基因15種突變類(lèi)型和1種多態(tài)位點(diǎn)。結(jié)果515份樣本檢出G6PD基因突變10例，檢出率為1.94%。檢出5種突變類(lèi)型：1388G>A 4例(40.0%)，1024C>T和519C>T各2例(20.0%)，1376G>T和95A>G各1例(10.0%)。多態(tài)位點(diǎn)1311C>T的等位基因頻率為12.79%。結(jié)論貴陽(yáng)地區(qū)是G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，1388G>A是該地區(qū)最常見(jiàn)的G6PD基因突變類(lèi)型。

[關(guān)鍵詞]葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥；基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；新生兒；分子篩查

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是最常見(jiàn)的人類(lèi)酶缺陷癥之一，全世界范圍內(nèi)約有4億人受累[1]。我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)是G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，人群中基因攜帶率為4%～20%[2]。G6PD缺乏癥是引起新生兒黃疸的主要原因之一，約50%的患兒有新生兒黃疸，嚴(yán)重者可發(fā)展為核黃疸，引起腦組織病理性損害，導(dǎo)致腦癱、智力低下等嚴(yán)重后遺癥[3]。因此，開(kāi)展新生兒G6PD缺乏癥篩查，可指導(dǎo)臨床及早采取措施，預(yù)防新生兒高膽紅素血癥和核黃疸的發(fā)生。目前臨床上主要是通過(guò)直接或間接檢測(cè)G6PD活性的方法來(lái)進(jìn)行G6PD缺乏癥的篩查。由于女性雜合子的酶活性變異程度較大，這些方法容易造成女性雜合子的漏檢。采用分子篩查的方法可提高雜合子的檢出率。為了解貴陽(yáng)地區(qū)G6PD缺乏癥的發(fā)生率及基因突變分布情況，本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)，對(duì)515例新生兒的G6PD基因突變進(jìn)行分子篩查。

1資料與方法

1.1一般資料研究樣本來(lái)自于貴州省人民醫(yī)院分子生物室樣本庫(kù)，共515份新生兒臍血DNA樣本，其中男264例，女251例。

1.2方法

1.2.1突變位點(diǎn)及引物設(shè)計(jì)選取我國(guó)人群中已發(fā)現(xiàn)的3種常見(jiàn)突變位點(diǎn)(1388G>A、1376G>T、95A>G)，12種少見(jiàn)突變位點(diǎn)(1387C>T、1381G>A、1360C>T、1024C>T、1004C>A、871G>A、835A>G、592C>T、519C>T、517C>T、487G>A、392G>T)及1種常見(jiàn)多態(tài)位點(diǎn)(1311C>T)，采用AssayDesigner3.1軟件進(jìn)行PCR引物和延伸引物設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2PCR及引物延伸反應(yīng)將樣本標(biāo)化至10～20 ng/μL，按照384孔板配置試劑。每孔5 μL PCR反應(yīng)體系含：10×PCR緩沖液0.5 μL，25 mmol/L MgCl20.4 μL，25 mmol/L dNTP Mix 0.1 μL，0.5 μmol/L Primer Mix 1 μL，5 U/μL HotStar Taq 0.2 μL，標(biāo)化DNA 模板1 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物中加入2 μL蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase enzyme,SAP)消化液進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)以去除未用完的dNTP。將配置好的iPLEX引物延伸反應(yīng)混合液2 μL 加入已完成SAP反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中進(jìn)行延伸反應(yīng)。PCR反應(yīng)和引物延伸反應(yīng)均在ABI veriti 384孔PCR儀上進(jìn)行。

1.2.3MALDI-TOF-MS檢測(cè)將完成全部反應(yīng)過(guò)程的產(chǎn)物用樹(shù)脂進(jìn)行脫鹽洗滌，再將檢測(cè)樣品從384孔板中轉(zhuǎn)移到表面覆蓋基質(zhì)的MassARRAY芯片中，放入Sequenom質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)質(zhì)譜圖中的峰值確定每份樣本的基因型，導(dǎo)出基因分型數(shù)據(jù)。

表1　G6PD基因突變位點(diǎn)MALDI-TOF-MS檢測(cè)擴(kuò)增引物和延伸引物

續(xù)表1　G6PD基因突變位點(diǎn)MALDI-TOF-MS檢測(cè)擴(kuò)增引物和延伸引物

F：上游引物；R：下游引物；E：延伸引物。

2結(jié)果

2.1基因分型結(jié)果將導(dǎo)出的基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行聚合分析，得到15個(gè)突變位點(diǎn)和1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型散點(diǎn)圖，并判別出每個(gè)位點(diǎn)的基因型分布情況。16個(gè)位點(diǎn)的判讀成功率均在98.5%以上，總判讀成功率為99.4%(8 190/8 240)。

2.2分子篩查結(jié)果515份樣本中檢出G6PD基因突變10例(1.94%)，其中男性4例(1.52%)，女性6例(2.39%)，均為突變雜合子。共檢出5種突變類(lèi)型：1388G>A 4例(40.0%)，1024C>T和519C>T各2例(20.0%)，1376G>T和95A>G各1例(10.0%)。多態(tài)位點(diǎn)1311C>T在男性中檢出半合子35例(13.26%)；女性中基因型CC、CT和TT例數(shù)分別為193例(76.89%)、53例(21.12%)和5例(1.99%)。該組樣本中1311C>T的等位基因頻率為12.79%。見(jiàn)表2。

表2　G6PD基因突變類(lèi)型分布情況

3討論

G6PD缺乏癥患者臨床表現(xiàn)變化較大。多數(shù)患者，尤其是女性雜合子平時(shí)可無(wú)臨床癥狀。部分患者可表現(xiàn)為藥物、食物或感染誘發(fā)的急性溶血，慢性非球形細(xì)胞溶血性貧血，新生兒黃疸等嚴(yán)重的臨床癥狀。開(kāi)展新生兒G6PD缺乏癥篩查，不僅可以及早采取措施，防止核黃疸的發(fā)生，同時(shí)，可使攜帶有致病基因的患兒及家長(zhǎng)在患兒的成長(zhǎng)過(guò)程中做好預(yù)防工作，減少各種感染機(jī)會(huì)，避免服用或食用可誘發(fā)急性溶血的藥物及食物[4]。

臨床上G6PD缺乏癥的篩查方法分為G6PD活性定性和定量檢測(cè)兩類(lèi)。定性方法有高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、硝基四氮唑藍(lán)(NBT)紙片法、熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)；定量方法有NBT定量法、G6PD/6PGD比值法等。目前對(duì)新生兒G6PD缺乏癥篩查的流程通常是先進(jìn)行G6PD活性定性檢測(cè)，陽(yáng)性者再進(jìn)行定量檢測(cè)，可提高篩查的敏感性和準(zhǔn)確性。由于G6PD缺乏癥是一種X-連鎖不完全顯性遺傳，女性雜合子的G6PD活性差異較大。因此，采用G6PD活性檢測(cè)的方法容易造成表型輕微的女性雜合子漏診，而她們會(huì)將致病基因繼續(xù)傳給后代。近年來(lái)，隨著分子診斷方法的迅速發(fā)展和普及，多種新技術(shù)用于G6PD的分子篩查，如反向點(diǎn)雜交[5]、變性高效液相色譜[6]、熒光探針PCR熔解曲線法[7]、基因芯片[8]和飛行時(shí)間質(zhì)譜[9]等，提高了女性雜合子的檢出率。

MALDI-TOF-MS是一種生物分子定性和定量分析的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[10]，結(jié)合引物延伸反應(yīng)，已發(fā)展成為一種常用的單核苷酸多態(tài)性(SNP)和點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)，廣泛用于分子診斷和多態(tài)與疾病易感性的關(guān)聯(lián)研究[11]。本研究采用MALDI-TOF-MS結(jié)合引物延伸技術(shù)，對(duì)新生兒進(jìn)行G6PD基因突變篩查，包括15種突變位點(diǎn)和1種多態(tài)位點(diǎn)，涵蓋了我國(guó)人群中絕大部分的G6PD基因突變類(lèi)型。由于我國(guó)人群中已發(fā)現(xiàn)的G6PD基因突變類(lèi)型有30多種，本研究的方法不能檢測(cè)出其他少見(jiàn)和未知的突變類(lèi)型。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，仍需要與G6PD活性檢測(cè)的方法相結(jié)合，對(duì)G6PD活性檢測(cè)陽(yáng)性而分子篩查陰性的樣本，需要進(jìn)一步做序列分析以明確。

本研究中G6PD的檢出率為1.94%，高于文獻(xiàn)報(bào)道的1.21%[12]，這是因?yàn)樽髡卟捎玫氖欠肿雍Y查方法，而文獻(xiàn)報(bào)道采用的是G6PD活性檢測(cè)，說(shuō)明分子篩查的敏感性更高，降低了女性雜合子的漏檢率。國(guó)內(nèi)最常見(jiàn)的3種G6PD基因突變類(lèi)型，即1388G>A、1376G>T和95A>G[13]在本組樣本中均有檢出，但所占比例與其他地區(qū)有所不同。1388G>A所占比例最高，達(dá)40.0%，其次是1024C>T和519C>T，各占20.0%，而1376G>T和95A>G最低，分別占10.0%，說(shuō)明不同地區(qū)不同人群的G6PD基因突變譜不同。1311C>T是不引起氨基酸改變的多態(tài)位點(diǎn)，在世界各地人群中分布廣泛。本組樣本中1311C>T的等位基因頻率為12.79%，顯著高于廣西地區(qū)的7.8%[14]，同樣也與不同地區(qū)和人群有關(guān)。這一位點(diǎn)的分型主要用于G6PD基因單倍型研究以確定不同突變發(fā)生的時(shí)間，對(duì)G6PD缺乏癥的致病性尚存在一定的爭(zhēng)議。

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(貴州省人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科;2.產(chǎn)科，貴陽(yáng) 550002)

Molecular neonatal screening for glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in Guiyang region*

Huang Shengwen1,Wu Xian1,Xu Yin2,Zhou Man2,Liu Xingmei1

(1.Department of Clinical Laboratory;2.Department of Obstetrics,Guizhou ProvincialPeople′s Hospital,Guiyang,Guizhou 550002,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the prevalence of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency and distribution of mutations in G6PD gene in Guiyang region.MethodsA total of 515 DNA samples taken from newborn umbilical cord blood were collected,15 mutations and one single nucleotide polymorphism in G6PD gene were detected by using of the Sequenom MassArray MALDI-TOF-MS system.ResultsAmong the 515 samples,10 were determined to have one of the G6PD gene mutations with a detection rate of 1.94%,5 mutation types were detected as follow:1388G>A accounted for 40.0% (4/10 cases),1024C>T and 519C>T accounted for 20.0% (2/10 cases) respectively,1376G>T and 95A>G accounted for 10.0% (1/10 cases) respectively.The single nucleotide polymorphism allele frequency of 1311C>T was 12.79%.ConclusionGuiyang is a region with higher prevalence of G6PD deficiency,1388 G>A is the most common mutation of G6PD gene in this region.

[Key words]glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency;desorption/ionization time of flight mass spectrometry;neonatus;molecular screening

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.019

* 基金項(xiàng)目：貴州省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(黔科合外G字[2011]7039)。

作者簡(jiǎn)介：黃盛文(1971-)，主任醫(yī)師，主要從事遺傳病基因診斷研究。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R446.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)11-1505-03

(收稿日期：2015-10-21修回日期：2015-12-26)