王頻佳，王　嫻，謝成彬，王　躍

(1.成都醫(yī)學(xué)院臨床微生物學(xué)教研室，成都 610500；2.四川省成都市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科　610031;3.四川省婦幼保健院檢驗(yàn)科，成都 610045)

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雙歧桿菌脂磷壁酸對(duì)深部白色念珠菌感染小鼠細(xì)胞免疫的影響*

王頻佳1，王嫻2#，謝成彬3△，王躍1

(1.成都醫(yī)學(xué)院臨床微生物學(xué)教研室，成都 610500；2.四川省成都市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科610031;3.四川省婦幼保健院檢驗(yàn)科，成都 610045)

[摘要]目的觀察雙歧桿菌脂磷壁酸(BLTA)對(duì)深部白色念珠菌感染小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。方法通過(guò)尾靜脈注射白色念珠菌建立免疫低下小鼠深部白色念珠菌感染模型，觀察BLTA處理對(duì)小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖活性、NK細(xì)胞殺傷活性及血清細(xì)胞因子水平的影響。結(jié)果免疫低下小鼠深部感染白色念珠菌后，小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性輕度下降(P>0.05)，NK細(xì)胞殺傷活性明顯下降(P<0.05)，IL-2、IL-4和INF-γ水平輕微升高(P>0.05)，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；BLTA處理后，小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖活性和NK細(xì)胞殺傷活性明顯升高(P<0.01)，血清IL-2和INF-γ水平明顯升高(P<0.05)，IL-4變化不大，IL-10明顯降低(P<0.01)。結(jié)論BLTA可改善免疫低下小鼠的免疫功能狀態(tài)，恢復(fù)甚至增強(qiáng)深部感染念珠菌后受到抑制的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

[關(guān)鍵詞]小鼠;雙歧桿菌脂磷壁酸;白色念珠菌;細(xì)胞免疫

白色念珠菌寄生于人體的體表、口腔、上呼吸道、胃腸道和陰道黏膜等部位，是臨床常見(jiàn)的條件致病菌。當(dāng)前，隨著抗菌藥物、激素和免疫抑制劑的大量使用，白色念珠菌引起的深部感染變得日益常見(jiàn)。由于抗真菌藥物在成本、毒性、藥代動(dòng)力學(xué)的變化及藥物相互作用復(fù)雜性等方面的局限性，導(dǎo)致侵襲性真菌感染的發(fā)病率和死亡率都較高[1]。研究還發(fā)現(xiàn)，念珠菌感染后會(huì)使機(jī)體的免疫功能受到進(jìn)一步的抑制[2-4]，從而使侵襲性真菌感染愈加難于控制。因此，開(kāi)發(fā)既具有一定抗真菌感染活性又能提高機(jī)體免疫力的新型抗真菌藥物或生物制劑成為了眾多研究者熱衷的事情[5-6]。雙歧桿菌是人體腸道最重要的益生菌，研究證實(shí)雙歧桿菌無(wú)論是全菌、培養(yǎng)上清液或其表面分子都具有抗微生物的活性，包括抗細(xì)菌活性、抗真菌活性和抗病毒活性。脂磷壁酸(bifidobacterial lipoteichoic acid，BLTA)是雙歧桿菌的細(xì)胞壁成分，也是雙歧桿菌發(fā)揮生物學(xué)功能的重要活性分子。作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，BLTA能夠改善深部白色念珠菌感染小鼠的生存狀態(tài)，提高生存率，且這種作用與BLTA的劑量呈依賴(lài)關(guān)系。本研究旨在觀察BLTA對(duì)深部白色念珠菌感染小鼠細(xì)胞免疫功能的影響，探討B(tài)LTA對(duì)念珠菌感染小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為白色念珠菌病的治療提供新的途徑。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株健康BALB/c雄性小鼠(SPF級(jí))30只，8～10周齡，體質(zhì)量18～20 g，由四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市簡(jiǎn)城比爾動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0011159；小鼠淋巴瘤細(xì)胞株YAC-1由本室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)菌株白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90029，購(gòu)自溫州康泰生物科技有限公司。接種沙保培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)48 h后，取單個(gè)菌落用無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后調(diào)整到所需濃度。

1.1.3主要試劑BLTA由本室從兩歧雙歧桿菌提取純化；注射用環(huán)磷酰胺，規(guī)格0.2 g/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)H32020857；沙保培養(yǎng)基，溫州康泰生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液，美國(guó)Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料公司；刀豆蛋白(ConA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10 和INF-γ檢測(cè)試劑盒，欣博盛生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.4主要儀器MJX-100型霉菌培養(yǎng)箱(常州中誠(chéng)儀器制造有限公司)，HERA cell i CO2培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]，DNM-9602酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)，AU2700型全自動(dòng)生化分析儀[貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司]。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組健康雄性BALB/c小鼠30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，給予小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射3 d，制備免疫低下小鼠模型。隨后將小鼠分成對(duì)照組、感染組、BLTA組，每組10只。各組間小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2.2深部白色念珠菌感染小鼠模型的建立及處理至第3次注射環(huán)磷酰胺24 h后，BLTA組小鼠每日1次頸背部皮下注射BLTA 150 μg/鼠，連續(xù)7 d，其余小鼠同部位注射等量生理鹽水。第11天，感染組和BLTA組小鼠經(jīng)尾靜脈注射濃度為1.0×105CFU/mL的白色念珠菌菌液0.2 mL(2×104CFU/mice)，注射1次，對(duì)照組小鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。自注射白色念珠菌當(dāng)日起，每日1次對(duì)BLTA組每只小鼠頸背部皮下注射BLTA 150 μg，連續(xù)7 d，其余小鼠同部位注射等量生理鹽水。于最后1次注射BLTA 24 h后，摘除各組小鼠眼球取血并斷頸處死，稱(chēng)量體質(zhì)量，摘出胸腺及脾稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，即相應(yīng)臟器質(zhì)量(mg)除以體質(zhì)量(g)，并無(wú)菌制備脾臟單個(gè)細(xì)胞懸液。

1.2.3脾淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整脾細(xì)胞濃度至1.5×106/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，200 μL/孔，重復(fù)3孔，加入ConA 20 μL (終濃度5 μg/mL)。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)68 h后，加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清液，加DMSO 100 μL/孔，溫育10 min,檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處各孔的吸光度值(A)。

1.2.4NK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)用含50 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整脾細(xì)胞和YAC-1細(xì)胞的濃度至2×109/L。將兩者等比例混合后,加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，重復(fù)3孔,記為實(shí)驗(yàn)孔(E)。另設(shè)空白對(duì)照(B)3孔(每孔加入RPMI 1640培養(yǎng)液200 μL)、靶細(xì)胞自然釋放孔(Tn) 3孔(每孔加入YAC-1細(xì)胞懸液和培養(yǎng)液各100 μL)及靶細(xì)胞最大釋放孔(Tm)3孔(每孔加入YAC-1細(xì)胞懸液100 μL)。于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)24 h,向Tm孔中加入含20 mL/L Triton X-100的RPMI 1640溶液,100 μL/孔?；靹蚝?靜置10 min,離心收集上清液,在全自動(dòng)生化分析儀上用速率法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)的活性,并按下列公式計(jì)算NK細(xì)胞的殺傷率(%)。NK細(xì)胞的殺傷率=[(E-B)-(Tn-B)]/[(Tm-B)-(Tn-B)]×100%。

1.2.5血清細(xì)胞因子的檢測(cè)收集小鼠血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別檢測(cè)血清中IL-2、IL-4、IL-10和INF-γ的水平。

2結(jié)果

2.1BLAT對(duì)深部白色念珠菌感染小鼠一般狀況和臟器指數(shù)的影響小鼠自注射環(huán)磷酰胺后出現(xiàn)少動(dòng)、消瘦、飲食減少、多尿、皮毛欠光滑等現(xiàn)象，與臨床上免疫力低下患者納差、消瘦、懶動(dòng)乏力等癥狀相似。小鼠深部感染白色念珠菌后，出現(xiàn)少食、畏寒、少動(dòng)的狀態(tài)，而B(niǎo)LTA組小鼠精神和食欲相對(duì)較好，體質(zhì)量下降緩慢。從免疫器官指數(shù)結(jié)果來(lái)看，感染組小鼠與對(duì)照組相比胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有輕度下降(P>0.05)；但是在用BLTA處理后小鼠的臟器指數(shù)明顯增加，與對(duì)照組和感染組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。BLTA組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的增加，表明BLTA能夠促進(jìn)免疫器官的增殖發(fā)育。見(jiàn)表1。

表1　BLAT對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

2.2BLTA對(duì)深部白色念珠菌感染小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性和NK細(xì)胞殺傷活性的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，免疫低下小鼠感染白色念珠菌后，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力略有下降(P>0.05)，NK細(xì)胞殺傷活性則下降明顯(P<0.05)。在經(jīng)BLTA處理后，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力和NK細(xì)胞殺傷活性明顯升高，與對(duì)照組和感染組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2　BLTA對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞殺傷活性的影響

2.3BLTA對(duì)深部白色念珠菌感染小鼠細(xì)胞因子分泌的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，免疫低下小鼠感染白色念珠菌后，血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4和INF-γ水平較感染前有輕微升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，感染組小鼠IL-10較對(duì)照組有明顯升高(P<0.05)。經(jīng)BLTA處理后，血清IL-2和INF-γ水平明顯升高，與對(duì)照組和感染組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清IL-4與感染組相比變化不大，只是比對(duì)照組有所升高(P<0.01)；血清IL-10水平較感染組有所降低(P<0.01)，而與對(duì)照組水平持平。見(jiàn)表3。

表3　BLTA對(duì)小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ濃度的影響

3討論

免疫力低下人群常出現(xiàn)深部白色念珠菌感染[7-9]，而白色念珠菌感染后又通過(guò)直接或間接作用導(dǎo)致機(jī)體免疫功能進(jìn)一步受到抑制，再加上念珠菌對(duì)氟康唑等抗真菌類(lèi)藥物耐藥性的不斷增強(qiáng)[10-12]，給臨床念珠菌病的治療帶來(lái)很大困難。因此，在念珠菌病臨床治療過(guò)程中，除了及時(shí)的抗真菌治療外，盡可能恢復(fù)甚至增強(qiáng)受抑制的免疫功能就顯得格外重要。本研究應(yīng)用環(huán)磷酰胺降低小鼠免疫功能，并通過(guò)尾靜脈注射白色念珠菌制備深部感染小鼠模型，以達(dá)到模擬免疫低下患者罹患深部念珠菌病的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫低下小鼠深部感染念珠菌后，機(jī)體的免疫功能受到進(jìn)一步的抑制，表現(xiàn)為胸腺和脾臟指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞殺傷活性均較對(duì)照組小鼠有所下降，其中NK細(xì)胞殺傷活性的下降程度尤為顯著(P<0.05)；而在經(jīng)BLTA處理后，胸腺和脾臟指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞殺傷活性均明顯升高(P<0.01)。研究表明，BLTA可改善免疫低下小鼠的免疫功能狀態(tài)，恢復(fù)甚至增強(qiáng)深部感染念珠菌后受到抑制的免疫應(yīng)答。

深部念珠菌感染后，機(jī)體的免疫應(yīng)答是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，其中細(xì)胞免疫應(yīng)答在對(duì)抗念珠菌感染中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，而且念珠菌感染的結(jié)局很大程度上取決于機(jī)體內(nèi)Th1/Th2型免疫應(yīng)答何者占據(jù)主要地位[13-15]。Stuehler等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞能增加機(jī)體對(duì)白色念珠菌的抵抗力，而Th2細(xì)胞則增加機(jī)體的易感性。Th1細(xì)胞以分泌IL-2和INF-γ為主，主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答的激活；Th2細(xì)胞則主要激活體液免疫應(yīng)答，并通過(guò)其分泌的IL-4和IL-10抑制Th1細(xì)胞活性。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫低下小鼠深部感染念珠菌后，其血清中IL-2、INF-γ和IL-4的水平雖然與對(duì)照組相比差別不大(P>0.05)，但I(xiàn)L-10的水平明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明念珠菌感染后免疫應(yīng)答的確是以Th2型應(yīng)答為主，而Th1型應(yīng)答則可能受到抑制。由于IL-2是機(jī)體最主要、最強(qiáng)有力的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是促使Th0向Th1分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子；INF-γ則具有巨噬細(xì)胞激活因子的作用，能增加巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞等的殺傷活性，促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞并抑制Th2細(xì)胞增生；而IL-4是特征性的Th2型細(xì)胞因子，具有抑制Th1型反應(yīng)的作用；IL-10能抑制Th1細(xì)胞功能和細(xì)胞因子合成。故念珠菌感染免疫低下小鼠后，很可能通過(guò)抑制IL-2、INF-γ的分泌釋放，增強(qiáng)IL-10的分泌釋放使機(jī)體的免疫應(yīng)答未能及時(shí)由Th0向Th1應(yīng)答轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致胸腺和脾臟增殖受到抑制，脾淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞殺傷活性下降，從而造成機(jī)體對(duì)白色念珠菌抵抗力差，極易出現(xiàn)系統(tǒng)性念珠菌病。在經(jīng)BLTA處理后，深部念珠菌感染小鼠血清IL-2和INF-γ水平均較感染組明顯升高(P<0.01)，IL-4水平雖然變化不大(P>0.05)，但I(xiàn)L-10水平較感染組明顯下降(P<0.01)，更接近對(duì)照組水平(P>0.05)。說(shuō)明BLTA能夠通過(guò)增強(qiáng)IL-2和INF-γ的分泌釋放使機(jī)體免疫應(yīng)答由Th0向Th1應(yīng)答轉(zhuǎn)化，Th1型細(xì)胞因子的分泌大大增加，促進(jìn)胸腺和脾臟增生,增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的增殖活性,提高NK細(xì)胞的殺傷活性，使Th1/Th2的紊亂得以糾正，從而提高了機(jī)體對(duì)白色念珠菌感染的抵抗力。本研究結(jié)果說(shuō)明，BLTA主要激發(fā)深部白色念珠菌感染小鼠Th1型細(xì)胞的應(yīng)答，具有良好的調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Miyazaki M,Horii T,Hata K,et al．In vitro activity of E1210，a novel antifungal，against clinically important yeasts and molds[J]．Antimicrob Agents Chemother，2011，55(10)：4652-4658．

[2]Collette JR,Zhou H,Lorenz MC.Candida albicans suppresses nitric oxide generation from macrophages via a secreted molecule[J].PLoS One，2014,9(4):e96203.

[3]Zheng XF,Hong YX,Feng GJ,et al.Lipopolysaccharide-induced M2 to M1 macrophage transformation for IL-12p70 production is blocked by Candida albicans mediated up-regulation of EBI3 expression[J].PLoS One，2013,8(5):e63967.

[4]Wellington M,Dolan K,Krysan DJ.Live Candida albicans suppresses production of reactive oxygen species in phagocytes[J].Infect Immun，2009,77(1):405-413.

[5]Sevilla MJ,Robledo B,Rementeria A,et al.A fungicidal monoclonal antibody protects against murine invasive candidiasis[J].Infect Immun，2006,74(5):3042-3045.

[6]Kidane YH,Lawrence C,Murali TM.Computational approaches for discovery of common immunomodulators in fungal infections:towards broad-spectrum immunotherapeutic interventions[J].BMC Microbiol，2013,13:224.

[7]Klingspor L,Tortorano AM,Peman J,et al．Invasive Candida infections in surgical patients in intensive care units:a prospective,multicentre survey initiated by the European Confederation of Medical Mycology (ECMM) (2006-2008)[J].Clin Microbiol Infect，2015，21(1):87.

[8]Kumar D,Kumar A,Singh S,et al．Candidemia-induced pediatric sepsis and its association with free radicals,nitric oxide,and cytokine level in host[J].J Crit Care,2015,30(2):296-303.

[9]Eggimann P,Que YA,Revelly JP,et al．Preventing invasive candida infections.Where could we do better?[J].J Hosp Infect,2015,89(4):302-308.

[10]Wang H,Xiao M,Chen SC,et al．In Vitro Susceptibilities of Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole as Determined by the 2010 National China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net (CHIF-NET) Study[J].J Clin Microbiol,2012,50(12):3952-3959.

[12]Jang MJ,Shin JH,Lee WG,et al．In vitro fluconazole and voriconazole susceptibilities of Candida bloodstream isolates in Korea:use of the CLSI and EUCAST epidemiological cutoff values[J].Ann Lab Med,2013,33(3):167-173.

[13]Richardson JP,Moyes DL.Adaptive immune responses to Candida albicans infection[J].Virulence,2015,6(4):327-337.

[14]Romagnoli G,Nisini R,Chiani P,et al．The interaction of human dendritic cells with yeast and germ-tube forms of Candida albicans leads to efficient fungal processing,dendritic cell maturation,and acquisition of a Th1 response-promoting function[J].J Leukoc Biol,2004,75(1):117-126.

[15]Angulo I,Jiménez-Díaz MB,García-Bustos JF,et al.Candida albicans infection enhances immunosuppression induced by cyclophosphamide by selective priming of suppressive myeloid progenitors for NO production[J].Cell Immunol,2002,218(1/2):46-58.

[16]Stuehler C,Khanna N,Bozza S,et al．Cross-protective TH1 Cells to Aspergillus Fumigatus and Candida albicans[J]．Blood,2011,117(22):5881-5891.

Effect of bifidobacterial lipoteichoic acid on cellular immunity of mice with systemic Candida albicans infection*

Wang Pinjia1,Wang Xian2#,Xie Chengbin3△,Wang Yue1

(1.Department of Clinical Microbiology,Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China;2.Department of Clinical Laboratory,the Third People′s Hospital of Chengdu,Chengdu,Sichuan 610031,China;3.Department of Clinical Laboratory,Sichuan Provincial Hospital of Children and Women,Chengdu,Sichuan 610045,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of bifidobacterial lipoteichoic acid (BLTA) on cellular immunity of mice with systemic Candida albicans infection.MethodsSystemic C.albicans infection model in immunocompromised mice were established by injecting standard strain of C.albicans via caudal vein.The effects of BLTA on thymus index,spleen index,splenic lymphocytes proliferation and NK cells cytotoxicity were observed as well as serum levels of cytokines.ResultsAfter systemic C.albicans infection in immunocompromised mice,thymus index,spleen index and splenic lymphocytes proliferation activity were decreased (P>0.05),NK cells cytotoxicity was decreased significantly (P<0.05),IL-2,IL-4 and INF-γ levels were increased slightly (P>0.05),IL-10 levels were increased significantly(P<0.05).After treated by BLTA,thymus index,spleen index,splenic lymphocytes proliferation and NK cells cytotoxicity were increased significantly (P<0.01),IL-2 and INF-γ levels were increased significantly (P<0.05),IL-4 levels showed little change,IL-10 levels were decreased significantly (P<0.01).ConclusionBLTA can improve immune status of immunocompromised mice,which can restore and enhance the compromised cellular immunity of mice with systemic C.albicans infection.

[Key words]mice;bifidobacterial lipoteichoic acid;candida albicans;cellular immunity

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.008

[中圖分類(lèi)號(hào)]R378.99

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)11-1467-03

(收稿日期：2015-10-28修回日期：2016-01-10)