王　芹，劉　穎，林　中，段澤輝

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西桂林 541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,廣西桂林 541199)

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腸道硫化氫合成酶CSE與糖尿病大鼠結(jié)腸動(dòng)力的相關(guān)研究*

王芹1，劉穎2△，林中1，段澤輝1

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西桂林 541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,廣西桂林 541199)

[摘要]目的探討腸道硫化氫(H2S)合成酶胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)與糖尿病(DM)大鼠近端結(jié)腸動(dòng)力的關(guān)系。方法一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)65 mg/kg，建立1型糖尿病模型，觀察大鼠的一般情況；注藥第10天制作結(jié)腸平滑肌縱行肌條，使用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄每組縱行肌肌條自發(fā)性收縮活性；分別采用免疫組化及雙重免疫熒光的方法觀察結(jié)腸全層標(biāo)本及肌間神經(jīng)叢(MP)中CSE分布；采用Western blot方法觀察腸道組織(去黏膜及黏膜下層)CSE的表達(dá)。結(jié)果DM組近端結(jié)腸肌條收縮活性均低于對(duì)照組(P<0.05)；CSE在黏膜下層、黏膜下神經(jīng)叢、MP、縱行肌和環(huán)形肌都有分布；CSE在大鼠肌間神經(jīng)元細(xì)胞核中分布，但CSE陽(yáng)性神經(jīng)元所占MP比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DM組大鼠結(jié)腸(去除黏膜及黏膜下層后)CSE的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論CSE表達(dá)上調(diào)可能是DM大鼠近端結(jié)腸運(yùn)動(dòng)減退的原因之一。

[關(guān)鍵詞]硫化氫；糖尿??；胱硫醚-γ-裂解酶；結(jié)腸動(dòng)力

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物多種器官組織有硫化氫(H2S)產(chǎn)生，其具有舒張血管平滑肌、心肌負(fù)性和肌力保護(hù)、清除氧自由基、抗炎等生物學(xué)效應(yīng)[1-2]。內(nèi)源性H2S主要通過(guò)胱硫醚-β-合成酶 (cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)來(lái)合成[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)H2S對(duì)消化道動(dòng)力亦起著重要的調(diào)節(jié)作用：外源性和內(nèi)源性H2S均抑制胃的運(yùn)動(dòng)[4]；外源性硫化氫可抑制大鼠縱行肌和環(huán)形肌自發(fā)性收縮，抑制效應(yīng)呈濃度依賴性[5]；松弛人、小鼠離體空腸[6]；對(duì)Wistar大鼠離體單個(gè)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生舒張作用[7]；主要通過(guò)保護(hù)腸神經(jīng)元尤其是興奮性神經(jīng)元而部分地保護(hù)了離體肌條的收縮功能[8]。

糖尿病(DM)胃腸動(dòng)力減退是DM胃腸道的表現(xiàn)之一，以往研究認(rèn)為DM結(jié)腸動(dòng)力障礙的機(jī)制與自主神經(jīng)病變、腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)病變、平滑肌形態(tài)學(xué)改變、Cajal間質(zhì)細(xì)胞病變、激素紊亂、血糖自身異常、Hp感染等方面相關(guān)[9-15]；但不能完全解釋DM動(dòng)力異常的機(jī)制，臨床也缺乏有效治療手段。

本研究運(yùn)用1型DM模型，通過(guò)測(cè)定結(jié)腸動(dòng)力、結(jié)腸H2S合成酶CSE分布及表達(dá)等實(shí)驗(yàn)，探討內(nèi)源性H2S與DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力減退的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,不控制食水?dāng)z入量。

1.1.2主要試劑與儀器羅氏血糖儀(德國(guó)ACCU-CHEKrPerforma公司)；解剖顯微鏡、熒光顯微鏡(Olympus)；張力換能器、RM6240多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)；STZ(美國(guó)Sigma公司)；小鼠抗大鼠Hu(HuC/HuD)單克隆抗體(美國(guó)Invitrogen公司)；兔抗大鼠CSE單克隆抗體(Abcam)；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及1型DM模型的制作SPF級(jí)雄性Wistar大鼠20只，分為DM組(n=10)和對(duì)照組(n=10)。DM模型按照文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行[16]：DM組大鼠禁食不禁水12 h后稱重，一次性腹腔注射STZ 65 mg/kg;對(duì)照組腹腔注射同等劑量檸檬酸母液(pH 4.2～4.5)。72 h后尾靜脈采血，連測(cè)2 d血糖大于或等于16.7 mmol/L者為造模成功，剔除血糖小于16.7 mmol/L者。此后于處死前1 d再次測(cè)量血糖，同時(shí)測(cè)量體質(zhì)量，觀察大鼠飲食、飲水、皮膚色澤、精神狀況及二便情況。注藥第10天進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2結(jié)腸平滑肌條制備及其自發(fā)性收縮的記錄大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后剖腹，迅速取約2 cm的結(jié)腸(約距回盲瓣2 cm)，平滑肌條制備及其自發(fā)性收縮方法同文獻(xiàn)[17]。收縮強(qiáng)度以曲線下面積 (area un-der the curve,AUC) 表示，統(tǒng)計(jì)分析兩組AUC的差異。

1.2.3免疫組化檢測(cè)近端結(jié)腸CSE的分布大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，迅速取距回盲瓣2 cm結(jié)腸標(biāo)本約1 cm，在Kreb液中洗凈腸容物后，迅速予10% 中性緩沖福爾馬林固定約 24 h；按常規(guī)免疫組化步驟進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、抗體孵育及蘇木素染色，石蠟包埋切片時(shí)切片平面時(shí)與腸腔軸垂直，山羊抗大鼠CSE抗體濃度為1∶250。觀察CSE在腸道壁的分布。

1.2.4雙重免疫熒光染色觀察近端結(jié)腸MP中CSE的分布大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后,迅速剖腹取距回盲瓣2 cm的一段長(zhǎng)約 1.5 cm的結(jié)腸置于冰Kreb液中,參照Liu等[17]雙重免疫熒光方法進(jìn)行肌間神經(jīng)叢全層標(biāo)本(whole-mount)制備及抗體孵育， 小鼠抗大鼠 Hu蛋白單克隆抗體濃度為1∶100，兔抗大鼠CSE多克隆抗體濃度為1∶200,山羊抗小鼠 FITC抗體濃度為1∶100，山羊抗兔 TRITC抗體濃度為1∶200。所有涉及熒光二抗的步驟都要避光。熒光顯微鏡下觀察,以抗Hu抗體作為神經(jīng)元標(biāo)志物顯示全部神經(jīng)元，每只大鼠至少統(tǒng)計(jì)1 000個(gè)腸神經(jīng)元，計(jì)算CSE陽(yáng)性神經(jīng)元占全部神經(jīng)元的百分比。

1.2.5Western blot檢測(cè)近端結(jié)腸(去除黏膜及黏膜下層)CSE的表達(dá)大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，迅速取距回盲瓣2 cm的一段長(zhǎng)約1.5 cm的結(jié)腸組織(去除黏膜及黏膜下層)約1 g予-80°冰箱保存?zhèn)溆茫Ｒ?guī)Western blot方法進(jìn)行提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、曝光、顯影，兔抗大鼠CSE多克隆抗體濃度CSE 1∶1 000。采用目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為相對(duì)表達(dá)量來(lái)分析兩組表達(dá)量差異。

2結(jié)果

2.1一般情況DM模型建立成功后，大鼠血糖明顯升高，出現(xiàn)明顯三多一少癥狀；與對(duì)照組相比，DM組大鼠明顯懶動(dòng)、毛色干枯、無(wú)進(jìn)攻性、多便、稀便。DM大鼠血糖明顯高于對(duì)照組大鼠[(33.30±2.23)nmol/L vs.(4.76±0.28)nmol/L,P<0.05]；處死前DM組大鼠體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組大鼠[(218.5±8.6)g vs.(295.7±18.3)g，P<0.05],DM組每只大鼠每天大便次數(shù)多于對(duì)照組[(8.00±0.32)次 vs.(5.00±0.65)次，P<0.05]，飲食量、飲水量、尿量未做統(tǒng)計(jì)，組內(nèi)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2兩組大鼠結(jié)腸平滑肌條自發(fā)性收縮活性DM組大鼠近端結(jié)腸縱行肌自發(fā)性收縮的 AUC 均低于對(duì)照組[(8.0±0.72)g/min vs.(12.67±0.32)g/min,P<0.05]，見圖1。

A:近端結(jié)腸縱行肌收縮曲線；B:AUC柱形圖。

圖1大鼠近端結(jié)腸縱行肌肌條自發(fā)性收縮活性

2.3兩組大鼠結(jié)腸CSE分布在兩組大鼠的結(jié)腸組織中，CSE 在縱行肌和環(huán)形肌細(xì)胞的胞漿、肌間神經(jīng)元細(xì)胞核中強(qiáng)表達(dá)，見圖2。

A:對(duì)照組；B:DM組。

圖2兩組大鼠近端結(jié)腸免疫組化染色(×200)

2.4兩組大鼠近端結(jié)腸MP中CSE分布在兩組大鼠的結(jié)腸組織中，CSE在肌間神經(jīng)元細(xì)胞核中分布，肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元形態(tài)未見明顯變化，DM組CSE陽(yáng)性神經(jīng)元的比例較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(99.00±0.45)% vs.(99.00±0.57)%,P>0.05)]，見圖3。

2.5兩組大鼠結(jié)腸中CSE的表達(dá)(去除黏膜及黏膜下層后)Western blot結(jié)果顯示，DM組大鼠結(jié)腸CSE的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見圖4。

2.6兩組大鼠胃腸動(dòng)力改變與CSE表達(dá)的變化Spearman相關(guān)性分析兩組大鼠腸動(dòng)力改變與CSE表達(dá)變化成負(fù)相關(guān)(r=-0.782，P<0.05),雙側(cè)顯著相關(guān)，見圖5。

A:對(duì)照組肌間神經(jīng)節(jié)；B:對(duì)照組MP中CSE分布；C:對(duì)照組CSE陽(yáng)性神經(jīng)元占肌間神經(jīng)節(jié)的比例；D:DM組肌間神經(jīng)節(jié)；E:DM組MP中CSE分布；F：DM組CSE陽(yáng)性神經(jīng)元占肌間神經(jīng)元的比例。

圖3兩組大鼠近端結(jié)腸MP雙重免疫熒光(×200)

A：Western blot蛋白條帶；B：兩組CSE灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖。

圖4兩組CSE在結(jié)腸(去除黏膜及黏膜下層)的表達(dá)

圖5　CSE表達(dá)與縱行肌電生理Spearman相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

3討論

本研究首先建立1型DM大鼠模型，DM組大鼠血糖明顯升高，出現(xiàn)明顯三多一少、懶惰、無(wú)攻擊性、毛色干枯等表現(xiàn)。對(duì)其近端結(jié)腸動(dòng)力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示DM組大鼠結(jié)腸縱行肌的AUC明顯低于對(duì)照組，以上結(jié)果表明DM組大鼠近端結(jié)腸動(dòng)力減退。但DM組大鼠亦有稀便、多便情況，可能與高血糖引起的遠(yuǎn)端結(jié)腸胃腸動(dòng)力增快有關(guān)[10]。

目前已經(jīng)證實(shí)H2S可以抑制腸道動(dòng)力，有研究[4]發(fā)現(xiàn)NaHS濃度依賴性抑制兔離體回腸肌自發(fā)性收縮，NaHS還抑制腸壁內(nèi)神經(jīng)受電刺激后誘發(fā)的豚鼠和大鼠回腸收縮；Gallego等[6]的研究顯示NaHS濃度依賴性抑制小鼠結(jié)腸和空腸、人和大鼠的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)；Gil等[18]發(fā)現(xiàn)H2S抑制大鼠結(jié)腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)，使平滑肌細(xì)胞超極化，但對(duì)慢波頻率沒有影響；H2S還可濃度依賴性抑制大鼠空腸環(huán)肌和縱肌的收縮[19-20]。蔣楠[21]發(fā)現(xiàn)DM大鼠回腸動(dòng)力減弱同時(shí)CBS表達(dá)增多，提示內(nèi)源性H2S可能對(duì)DM大鼠回腸動(dòng)力具有抑制作用，而H2S對(duì)DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力研究少見相關(guān)報(bào)道。CSE是CBS外另外一種體內(nèi)H2S主要合成酶[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)不同種屬動(dòng)物腸道組織中均有內(nèi)源性H2S合成酶CSE或CBS分布[22-23]。也有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸活體肌組織可產(chǎn)生H2S，同時(shí)使用CSE和CBS抑制劑后，H2S的產(chǎn)生受到明顯抑制[17，22]。為探討二者關(guān)系，本研究首先觀察CSE在大鼠結(jié)腸的分布及表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CSE在兩組大鼠縱行肌和環(huán)形肌細(xì)胞質(zhì)中強(qiáng)表達(dá)，并且還在肌間神經(jīng)元細(xì)胞核中分布，從而證實(shí)大鼠結(jié)腸有CSE分布；進(jìn)而Western blot結(jié)果顯示，DM組結(jié)腸(去除黏膜及黏膜下層)CSE表達(dá)均高于對(duì)照組，從而提示CSE增多可能是DM結(jié)腸動(dòng)力減弱的原因之一，但由于本實(shí)驗(yàn)的局限性，此時(shí)的CSE升高來(lái)自源于平滑肌細(xì)胞還是肌間神經(jīng)叢尚未可知。ENS包括黏膜下神經(jīng)叢及肌間神經(jīng)叢，調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌、免疫等，被稱為消化道壁內(nèi)的“微型腦”，其中位于縱行肌和環(huán)形肌間的肌間神經(jīng)叢對(duì)胃腸動(dòng)力起著重要的調(diào)節(jié)作用[24]。本研究結(jié)果顯示，大鼠結(jié)腸MP有CSE的分布，且CSE陽(yáng)性率達(dá)99%，這與文獻(xiàn)相似[3,17,25-27]，從這方面來(lái)講，內(nèi)源性H2S可能作為一種神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)胃腸道動(dòng)力，實(shí)際上兩組大鼠MP中CSE陽(yáng)性率無(wú)差異，但不排除MP中CSE蛋白表達(dá)上調(diào)引起的結(jié)腸動(dòng)力降低；免疫組化結(jié)果顯示出了肌間神經(jīng)叢，結(jié)腸固有肌層亦CSE分布。既往有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞可產(chǎn)生H2S[17]，從這種意義上來(lái)講，H2S可能作為一種胞內(nèi)信號(hào)分子參加胃腸道動(dòng)力的調(diào)節(jié)。就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)講，無(wú)論是肌源性還是神經(jīng)元性H2S合成的增多均會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸動(dòng)力的紊亂。CSE表達(dá)與縱行肌電生理呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步提示CSE表達(dá)上調(diào)引起腸道動(dòng)力的降低。

綜上所述，結(jié)腸局部?jī)?nèi)源性H2S合成酶表達(dá)上調(diào),提示H2S產(chǎn)生增多可能是DM 結(jié)腸動(dòng)力減弱的原因之一。

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Study on colonic H2S-producing enzyme CSE and colonic motility in diabetes mellitus*

Wang Qin1,Liu Ying2△,Lin Zhong1,Duan Zehui1

(1.the Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi,541001,China;2.the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin,Guangxi 541199,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the relationsheep between colonic H2S-producing enzyme cystathionine-γ-lyase(CSE) and colonic motility in a rat model of diabetes mellitus(DM).MethodsTo obtained diabetic rat models,all rats were injected intraperitoneally (ip) 1% streptozotocin (STZ,65 mg/kg),type 1 diabetes model was established,nornmol conditions were observed periodically.Ten days after treatment,production of colonic longitudinal smooth muscle strips,organ bath recordings were used to test the colonic motility;immunofluorescence and double immunofluorescence lableling method were performed to detect the distribution of CSE;Western blot were performed on rat colonic samples devoid of mucosa and submucosa to detect the expression of CSE.ResultsDM rats decreased the colonic motility(P<0.05);CSE was strongly expressed in the cytosols of the circular and longitudinal smooth muscle cells and the nucleus of the myenteric plexus neurons;CSE distributed in myenteric neurons in the nucleus of rat,but the proportion of MP had no difference (P>0.05);DM rats increased the expression of CSE in the colon devoid of mucosa and submucosa(P<0.05).ConclusionThe decrease of colonic motility in diabetic rat may be associated with the increased production of H2S-producing enzyme CSE.

[Key words]hydrogen sulfide;diabetes mellitus;cystathionine-γ-lyase;colonic motility

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.007

* 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460111)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014GXNSFAA118166)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳計(jì)劃課題(Z2012408)。

作者簡(jiǎn)介：王芹(1988-)，醫(yī)師，主要從事胃腸動(dòng)力研究。△通訊作者，E-mail:liuy1009@sina.com。

[中圖分類號(hào)]R333

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)11-1463-04

(收稿日期：2015-12-10修回日期：2016-02-09)