莫偉嘉，李　佳，陸會(huì)平，馮振博

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧 530021)

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轉(zhuǎn)錄因子Sp3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)意義*

莫偉嘉，李佳，陸會(huì)平，馮振博△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧 530021)

[摘要]目的研究轉(zhuǎn)錄因子Sp3(Sp3)在肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用。方法采用Western blot法和RT-PCR法檢測(cè)該院49例HCC組織及其癌旁肝組織中Sp3和β-Catenin的表達(dá)情況，分析二者在HCC和癌旁肝組織中的表達(dá)差異、二者的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系，以及Sp3與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果Western blot和RT-PCR法的結(jié)果均顯示：(1)Sp3在HCC中的表達(dá)高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)β-Catenin在HCC中的表達(dá)高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(3)Sp3和β-Catenin在HCC中的表達(dá)與腫瘤直徑和分級(jí)相關(guān)；(4)Sp3和β-Catenin在HCC中的表達(dá)呈正相關(guān)(Western blot：r=0.681、P=0.000；RT-PCR：r=0.641，P=0.000)，均與腫瘤大小和分化程度有關(guān)；(5)Sp3高表達(dá)的病例預(yù)后較低表達(dá)的病例差 (P<0.05)。結(jié)論Sp3在HCC發(fā)生中起促進(jìn)作用且與腫瘤惡性程度相關(guān)； Wnt通路可能是其參與HCC發(fā)生、發(fā)展的途徑。

[關(guān)鍵詞]癌，肝細(xì)胞；肝腫瘤；轉(zhuǎn)錄因子Sp3；β-Catenin

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)，尤其是廣西地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段積累的過(guò)程，多種基因參與其中。轉(zhuǎn)錄因子Sp3(transcription factor Sp3，Sp3)參與多種基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，目前已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中均存在Sp3的異常表達(dá)[1]，部分非腫瘤疾病如腎小球硬化也與Sp3相關(guān)[2]。對(duì)于Sp3與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，已有若干研究成果，但關(guān)于Sp3在HCC中的作用目前相關(guān)的研究尚較少。β-Catenin是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，在通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)調(diào)控c-myc和Cyclin D1等癌基因的表達(dá)。研究顯示，Wnt通路參與HCC的發(fā)生[3]，β-Catenin與HCC的高度惡性和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前，對(duì)于Sp3與β-Catenin在HCC中的關(guān)系、Sp3是否通過(guò)Wnt通路參與HCC發(fā)生、發(fā)展等問(wèn)題未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)Sp3在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用，及其與β-Catenin的關(guān)系進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取本院2009年1月至2011年1月新鮮凍存的肝細(xì)胞癌及其癌旁肝組織標(biāo)本49例(梁索型20例，透明細(xì)胞型9例，混合細(xì)胞型13例，腺樣型7例)；患者年齡25～73歲，中位年齡45歲；男43例，女6例；按分化程度分高分化(1～2級(jí))和低分化(3～4級(jí))兩組(分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照2010版《WHO腫瘤分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》)。并收集腫瘤體積、甲胎蛋白及乙型肝炎表面抗原檢測(cè)情況、TNM分期、隨訪情況等資料。所有患者均未進(jìn)行放療及化療，以確保結(jié)果無(wú)其他影響因素。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)試劑Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Mixer、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；兔抗人Sp3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bio-Legend公司；兔抗人β-Catenin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司；羊抗兔IgG(H+L)HRP連接二抗購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；Western-Blot GAPDH內(nèi)參購(gòu)自上?？党晒荆籖IPA裂解液(強(qiáng))、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒工作盒、發(fā)光劑、苯甲基磺酰氟(PMSF)等購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)研究所。引物由上海捷瑞公司設(shè)計(jì)及合成目的基因Sp3：上游5′-GCT TGC ACC TGT CCC AAC TGT A-3′，下游5′-CTC CAG AAT GCC AAC GCA GA-3′；目的基因β-Catenin：上游5′-GAG TGC TGA AGG TGC TAT CTG TC-3′，下游5′-CTG AAC AAG AGT CCC AAG GAG A-3′；內(nèi)參基因β-actin：上游5′-GCA CCA CAC CTT CTA CAA TGA GC-3′；下游5′-GGA TAG CAC AGC CTG GAT AGC AAC-3′。

1.2.2Western blot法提取總蛋白、加入上樣緩沖液煮沸5 min變性后上樣電泳，100 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜(Sp3 90 min、β-Catenin 120 min、內(nèi)參 60 min)，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗(Sp3工作濃度為1.33 μL/mL、β-Catenin工作濃度為1 μL/mL)12 h，TBST洗膜5 min×2次，室溫孵育二抗(二抗工作濃度0.1 μL/mL)1 h，TBST洗膜5 min×2次，滴加發(fā)光劑，柯達(dá)膠片曝光顯影，膠片拍照后用Quantity one軟件分析圖像及數(shù)據(jù)。

1.2.3RT-PCR法Trizol提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以β-actin為內(nèi)參按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性5 min。以95 ℃變性1 min、退火(Sp3和內(nèi)參54 ℃、β-Catenin 56 ℃)30 s、72 ℃延伸1 min為一個(gè)循環(huán)，Sp3和β-Catenin分別35、37個(gè)循環(huán)；內(nèi)參25個(gè)循環(huán)。之后均72 ℃再延伸10 min、4 ℃暫保存。所得產(chǎn)物以18 g/L瓊脂糖凝膠電泳、核酸染料染色，應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采圖后用Quantity one軟件分析圖像及數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，對(duì)Sp3、β-Catenin在HCC及其癌旁肝組織中表達(dá)的差異性、二者表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s確切概率法分析；對(duì)Sp3和β-Catenin在HCC中表達(dá)相關(guān)性用Spearmen等級(jí)相關(guān)分析；對(duì)Sp3與HCC預(yù)后的關(guān)系用Log-Rank法分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Sp3表達(dá)結(jié)果經(jīng)Western blot法檢測(cè)，HCC組織中Sp3的高表達(dá)率高于癌旁肝組織[59.18%(29/49)vs.28.57%(14/49),χ2=4.732，P=0.03]，見圖1。Sp3在HCC中的表達(dá)與腫瘤直徑和分級(jí)相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白及乙型肝炎表面抗原情況無(wú)關(guān)(P>0.05)，見表1、圖2～3。

1:HCC；2：癌旁肝組織。

圖1Sp3在HCC與癌旁肝組織中的表達(dá)(Western blot)

經(jīng)RT-PCR法檢測(cè)，HCC組織中Sp3的高表達(dá)率高于癌旁肝組織[63.27%(31/49)vs.26.53%(13/49)，χ2=13.364，P=0.000]，見圖4。Sp3在HCC中的表達(dá)與腫瘤直徑和分級(jí)相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白及乙肝表面抗原情況無(wú)關(guān)(P>0.05)，見表2、圖5～6。

1：小體積HCC；2：泳道1對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；3：大體積HCC；4：泳道3對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。

圖2Sp3在不同體積HCC中的表達(dá)(Western blot)

1：低分化HCC；2：泳道1對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；3：泳道4對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；4：高分化HCC。

圖3　Sp3在不同分化HCC中的表達(dá)(Western blot)

AFP：甲胎蛋白；HBsAg：乙型肝炎表面抗原。

兩種方法均顯示Sp3在有肝硬化的癌旁肝組織中的表達(dá)高于無(wú)明顯病變的癌旁肝組織[Western blot:52.17%(12/23)vs.7.69%(2/26)，χ2=11.832，P=0.001;RT-PCR:47.83%(11/23)vs.7.69%(2/26)，χ2=10.085，P=0.001]，見圖7～8。

1、2：泳道4、5的內(nèi)參；3：Marker；4：癌旁肝組織；5：HCC。

圖4Sp3在HCC與癌旁肝組織中的表達(dá)(RT-PCR)

1～4：泳道6～9的內(nèi)參；5：Marker；6：小體積HCC；7：泳道6對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；8：大體積HCC；9：泳道8對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。

圖5Sp3在不同體積HCC中的表達(dá)(RT-PCR)

1～4：泳道6～9的內(nèi)參；5：Marker；6：高分化HCC；7：泳道6對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；8：低分化HCC；9：泳道8對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。

圖6　Sp3在不同分化HCC中的表達(dá)(RT-PCR)

1：HCC；2：硬化癌旁肝組織；3：無(wú)硬化癌旁肝組織。

圖7Sp3在無(wú)硬化癌旁肝組織與硬化癌旁肝組織中的表達(dá)(Western blot)

1～3：泳道5～7內(nèi)參;4：Marker；5：硬化癌旁肝組織；6：無(wú)硬化癌旁肝組織；7：HCC組織。

圖8Sp3在無(wú)硬化癌旁肝組織與硬化癌旁肝組織中的表達(dá)(RT-PCR)

2.2兩種方法檢測(cè)Sp3結(jié)果的一致性經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析兩種方法檢測(cè)Sp3結(jié)果的一致性顯示：兩種方法的檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.789，P<0.01)。

2.3β-Catenin表達(dá)經(jīng)Western blot法檢測(cè),HCC組織中β-Catenin的高表達(dá)率高于癌旁肝組織[51.02%(25/49)vs. 24.49%(12/49)，χ2=7.338，P=0.007]，見圖9。β-Catenin在HCC組織中的表達(dá)與腫瘤直徑和分級(jí)相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白及乙肝表面抗原情況無(wú)關(guān)(P>0.05)，見表3、圖10～11。

1：HCC；2：癌旁肝組織。

圖9β-Catenin在HCC與癌旁肝組織中的

表達(dá)(Western blot)

1：小體積HCC；2：泳道1對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；3：大體積HCC；4：泳道3對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。

圖10β-Catenin在不同體積HCC中的

表達(dá)(Western blot)

1：泳道2對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；2：高分化HCC；3：低分化HCC；4：泳道3對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。

圖11　β-Catenin在不同分化HCC中的

1～2：泳道4～5的內(nèi)參;3：Marker；4：HCC；5：癌旁肝組織。

圖12β-Catenin在HCC與癌旁肝組織中的

表達(dá)(RT-PCR)

經(jīng)RT-PCR法檢測(cè),HCC組織中β-Catenin的高表達(dá)率高于癌旁肝組織[53.06%(26/49)vs.14.29%(7/49)，χ2=16.493，P=0.000]，見圖12。β-Catenin在HCC組織中的表達(dá)與腫瘤直徑和分級(jí)相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白及乙肝表面抗原情況無(wú)關(guān)(P>0.05)，見表4、圖13～14。

1～4：泳道6～9的內(nèi)參；5：Marker；6：小體積HCC；7：泳道6對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；8：大體積HCC；9：泳道8對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。

圖13β-Catenin在不同體積HCC中的表達(dá)

(RT-PCR)

1～4：泳道6～9的內(nèi)參；5：Marker；6：高分化HCC；7：泳道6對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；8：低分化HCC；9：泳道8對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織。

圖14　β-Catenin在不同分化HCC中的

2.4Sp3與β-Catenin相關(guān)性分析兩種方法均顯示：多數(shù)Sp3高表達(dá)的病例β-Catenin也高表達(dá)。經(jīng)相關(guān)性分析，在HCC組織中二者的表達(dá)呈正相關(guān)(Western blot：r=0.681，P=0.000；RT-PCR：r=0.641，P=0.000)。

2.5Sp3與HCC預(yù)后的關(guān)系隨訪時(shí)間為28個(gè)月，死亡及復(fù)發(fā)均判為終止事件。經(jīng)Western blot法檢測(cè)，20例Sp3低表達(dá)的病例無(wú)病生存時(shí)間平均為23.4個(gè)月，預(yù)后明顯好于Sp3高表達(dá)的病例(此類病例無(wú)病生存時(shí)間平均為18.4個(gè)月)。生存分析顯示預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見圖15。經(jīng)RT-PCR法檢測(cè)，18例Sp3低表達(dá)的病例無(wú)病生存時(shí)間平均為23.6個(gè)月，預(yù)后明顯好于Sp3高表達(dá)的病例(此類病例無(wú)病生存時(shí)間平均為18.6個(gè)月)，生存分析顯示預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見圖16。

1：Sp3高表達(dá)的HCC病例；2：Sp3低表達(dá)的HCC病例。

圖15生存曲線(Western blot)

1：Sp3高表達(dá)的HCC病例；2：Sp3低表達(dá)的HCC病例。

圖16生存曲線(RT-PCR)

3討論

Sp3與Sp1均為Sp家族成員，并有最為相似的細(xì)胞分布和DNA識(shí)別序列，Sp3對(duì)Sp1的結(jié)合位點(diǎn)均有較強(qiáng)的結(jié)合能力。Sp1與HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已被研究證實(shí)[4-6]，但對(duì)與其同家族的Sp3在HCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中作用的研究則鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)研究以Western blot及RT-PCR兩種方法檢測(cè)Sp3在HCC及其癌旁肝組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Sp3在HCC中的表達(dá)高于癌旁肝組織，提示Sp3在HCC的發(fā)生過(guò)程中是一促進(jìn)因子。此外，在大體積、低分化的HCC組織中，Sp3的高表達(dá)率增加，因而推測(cè)Sp3還能反映腫瘤的惡性程度，Sp3高表達(dá)的HCC具有較高的惡性程度。這一推論符合生存分析的結(jié)果：Sp3高表達(dá)的HCC病例，預(yù)后較低表達(dá)的病例差，出現(xiàn)了更短的平均生存時(shí)間和更高的病死/復(fù)發(fā)率。因此，Sp3高表達(dá)或許可作為HCC的危險(xiǎn)信號(hào)，提示高度惡性、預(yù)后不佳。以往有研究報(bào)道Sp3高表達(dá)與頭頸部腫瘤預(yù)后不良相關(guān)[7]，本研究結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道相符。

HCC的發(fā)生是一個(gè)多種基因參與、多階段、多因素積累的過(guò)程，Shiraha等[8]的研究表明至少有4類基因的變異及其所引起的生物學(xué)變化參與了HCC的發(fā)生，其中之一是促腫瘤生成通路的激活。在各種促腫瘤形成通路中，Wnt是最主要的通路，其在HCC發(fā)生過(guò)程中所起的關(guān)鍵作用已被較多研究證實(shí)[9-10]。β-Catenin作為Wnt通路參與眾多基因表達(dá)調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)[11]，是Wnt通路促進(jìn)HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子[12]。因此，β-Catenin及其所在的Wnt通路與HCC的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。本試驗(yàn)研究以Western blot和RT-PCR兩種方法檢測(cè)β-Catenin在HCC及其癌旁肝組織中的表達(dá)情況，所得結(jié)果相似，即β-Catenin在HCC組織中的表達(dá)高于癌旁肝組織，且在大體積、低分化的HCC組織中，β-Catenin表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，再次證實(shí)了β-Catenin在HCC發(fā)生中的促進(jìn)作用，及其與HCC惡性程度相關(guān)。

β-Catenin富含GC序列[13]，而Sp3可以特異地識(shí)別和調(diào)控富含GC序列的基因，故Sp3與β-Catenin之間極有可能存在調(diào)控機(jī)制。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在HCC組織中Sp3與β-Catenin呈正相關(guān)，且二者的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系也一致，提示W(wǎng)nt通路可能是Sp3促進(jìn)HCC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一。目前，有少量關(guān)于Sp家族蛋白與Wnt通路關(guān)系的研究，如Pathi等[14]的研究認(rèn)為，在大腸癌中Sp家族蛋白Sp1、Sp3及Sp4對(duì)β-Catenin有調(diào)控作用。而另有研究報(bào)道，Sp家族蛋白在Wnt/β-Catenin通路中是一關(guān)鍵作用因子[15]。本試驗(yàn)所顯示出的Sp3與β-Catenin在HCC組織中的相關(guān)性，可作為Sp3參與HCC發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及Sp3與Wnt/β-Catenin通路關(guān)系的初步探討。

HCC進(jìn)展較快，且起病隱匿難以早期發(fā)現(xiàn)，手術(shù)治療效果普遍不理想[16]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道HCC根治性切除后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%，且復(fù)發(fā)時(shí)多數(shù)患者已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。因此，應(yīng)用更多的早期診斷手段、確立更多的早期診斷指標(biāo)以盡可能的早診早治是提高HCC療效的關(guān)鍵。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在存在硬化病變的癌旁肝組織中，Sp3表達(dá)高于無(wú)明顯病變的癌旁肝組織，鑒于肝硬化是HCC公認(rèn)的高危因素和癌前病變[17]，可將Sp3視為一個(gè)潛在的HCC早期診斷指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)研究。

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Expression of transcription factor Sp3 in hepatocellular carcinoma*

MoWeijia,LiJia,LuHuiping,FengZhenbo△

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion530021，China)

[Abstract]ObjectiveTo research the expression of Sp3 and β-Catenin in HCC and study the assessable factors of them for prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.MethodsWestern blot and RT-PCR methods were used to detect the expression of Sp3 and β-Catenin in HCC and the liver tissue beside tumor among 49 cases.We analyzed the difference of these two indexes expressed in HCC and the liver tissue beside tumor.Then we detected the correlation between these two indexes and the character of clinic pathology,and researched the correlation between Sp3 and the prognosis of HCC.ResultsThe high expression rate of Sp3 in HCC was higher than that of liver tissue beside tumor(P<0.05) according to Western blot and RT-PCR,the same to β-Catenin(P<0.05).Expression of Sp3 and β-Catenin were both related with size of tumor and degree of differentiation.Positive correlation existed between these two indexes according to Western blot method(r=0.681，P=0.000) and RT-PCR method(r=0.641,P=0.000).The prognosis of cases with high expression of Sp3 was poorer than the low expression cases(P<0.05).ConclusionSp3 plays a promoter role in occurrence of HCC,which is correlated with the grade malignancy of HCC.Sp3 might participated in occurrence and development of HCC via the Wnt pathway.

[Key words]carcinoma,hepato cellular;liver neoplasms;transcription factor Sp3;β-Catenin

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.022

*基金項(xiàng)目：廣西區(qū)域性高發(fā)惡性腫瘤規(guī)范化診治關(guān)鍵技術(shù)研究及應(yīng)用示范(桂科攻1298003-2-5)。

作者簡(jiǎn)介：莫偉嘉(1985-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:zhenbofeng@yahoo.com.cn。

[中圖分類號(hào)]R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)03-0356-05

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-10-16)